Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00
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Agradecemos a Bernard Kulemaka y miembros del laboratorio de Smith por sus comentarios útiles y orientación de reactivo, Sam Connell y Brent Redford de 3i para enviar imágenes preguntas y Deborah Bang, Karen Heed y Kay Stewart para el cuidado del pez cebra. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Notre Dame, la Elizabeth y Michael Gallagher Family, el Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigación de pez cebra en la Universidad de Notre y centro de las células madre y medicina regenerativa en la Universidad de Notre Dame. Todos los estudios en animales se realizaron en cumplimiento de la Universidad de Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.

Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Notre Dame Animal cuidado institucional y Comité de uso.
1. preparación de la muestra de pez cebra
<ol><li>Coloque un macho adulto y una Tg femenino adulto (proteína convertible) en una cámara de acoplamiento por procedimientos estándar13. En este manuscrito, utilice Tg(sox10:eos) de pescado9 por acceso pero otras líneas transgénicas con proteínas de photoconvertible ...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling.">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li><li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Fluorescent+timer&amp;#34;:+protein+that+changes+color+with+time.">&amp;#34;Fluorescent timer&amp;#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li><li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

En tejidos complejos, distintos tipos de células se organizan en dominios específicos. Recientemente se han utilizado técnicas a las células individuales de la etiqueta dentro de estos tejido grandes estructuras1,2,3. Aquí muestran dos técnicas que pueden utilizarse igualmente para visualizar las interacciones de la célula y las interacciones de población de células dentro de tejidos complejos. La ventaja de la técnica...

Varias celdas distintas interactúan para construir y mantener los tejidos animales y vegetales complejos. Estas células son a menudo intercalados y difíciles de distinguir de los vecinos a un nivel unicelular sin microscopía de alta resolución que requieren fijación del tejido. Sin embargo, para entender cómo estas forman los tejidos, se mantiene y se convierten en enfermos, ha sido esencial para investigar cómo solo las células dentro del tejido están interactuando con el tiempo. Idealmente, estos experimentos requieren el etiquetado de células individuales dentro de un tejido de una manera no invasiva sin necesidad de fijación. Los científicos ahora han desarrollado numerosas técnicas para lograr esta tarea1,2,3,4.
El descubrimiento y la aplicación de la proteína fluorescente de Medusa verde (GFP) es un enfoque interesante que permitió para el etiquetado de distintas células en un tejido medio ambiente1. Utilizando promotores específicos de la célula, es posible seleccionar genéticamente un subconjunto de las células que llevan la etiqueta1. Alternativamente, viral inducido expresión de GFP puede ser utilizado para la expresión seleccionada por el usuario de GFP3,4. Aunque muy útil, expresión génica mediada de GFP no permite expresión seleccionada por el usuario dentro de un subconjunto de las células en el tejido; y viral expresión de GFP, aunque ventajosa, puede ser invasivo. Con la llegada de los derivados GFP y técnicas inteligentes como Brainbow para expresar distintas proteínas fluorescentes más escasamente en los tejidos, es posible visualizar las células y las interacciones entre ellos en el complejo tejido2, 5. sin embargo, estos enfoques etiqueta de células al azar. Si el experimento deseado requiere la visualización de una sola célula o población de células que se define por el experimentador, por lo tanto son limitados. Con tales experimentos, sería ventajoso tener una proteína fluorescente genéticamente expresa que puede ser manipulada para distinguir, en forma unicelular, de otras células fluorescentes y no fluorescentes.
Para alcanzar esta meta y visualizar la biología celular de las células en un tejido complejo de la vida, la comunidad científica utiliza photoconversion unicelular de diferentes proteínas fluorescentes6,7,8. Utilizando genéticamente controlada expresión de una proteína photoconvertible (es decir, eos, kaede, etc.) que las transiciones de un verde a rojo estado fluorescente cuando se exponen a los rayos UV (488 nm) luz, podemos distinguir una sola célula de su fluorescencia marcada vecinos6,7,8. Este enfoque utiliza un aparato conectado a nuestro microscopio confocal que puede dirigir la luz de una pila de láser a una región limitada de la difracción de interés. Con esta técnica, o bien podemos etiquetar las células o poblaciones más grandes en una manera definida por el usuario9,10,11. La técnica es mínimamente invasiva en comparación con las inyecciones de célula de GFP viral. Como una prueba de concepto, demostramos que podemos photoconvert las células dentro de un ganglio en el sistema nervioso periférico y photoconvert poblaciones más grandes como células situadas en el lado ventral de la médula espinal9,10, 11,12. Entonces podemos visualizar estas poblaciones de células de la photoconverted 24 h más tarde para ganar la penetración en su movimiento y diferenciación durante el desarrollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Tejido animal y vegetal se compone de distintas poblaciones de células. Estas células interactúan en el tiempo para construir y mantener los tejidos y pueden causar enfermedad cuando interrumpió. Los científicos han desarrollado técnicas inteligentes para investigar las características y dinámica natural de estas células dentro del tejido intacto por expresión de proteínas fluorescentes en subconjuntos de células. Sin embargo, a veces, los experimentos requieren más seleccionado visualización de células dentro del tejido, a veces en la forma unicelular o población de células. Para lograr esto y visualizar las células dentro de una población de células, los científicos han utilizado sola célula photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demostrar esta técnica, aquí mostramos cómo a la luz UV a una celda de Eos-expresión de interés en un intacto, vive de zebrafish. Entonces a la imagen de esas células de Eos+ photoconverted 24 h más tarde para determinar cómo ha cambiado en el tejido. Se describen dos técnicas: solo celular photoconversion y photoconversions de las poblaciones de la célula. Estas técnicas pueden utilizarse para visualizar las interacciones célula-célula, destino celular y diferenciación y migraciones celulares, lo que es una técnica que es aplicable en muchas de las preguntas biológicas.

Photoconversion de proteínas fluorescentes puede utilizarse para etiquetar las distintas células dentro de un tejido6. Para demostrar esto, Tg(sox10:eos) pescado9 fueron utilizados para expresar la proteína photoconvertible Eos en las secuencias reguladoras de sox10. Los animales Tg(sox10:eos) en 48 hpf fueron montados primero y luego reflejada para detectar cualquier photoconversion no específicos que puede ha...

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Aquí, presentamos un protocolo para mostrar cómo photoconversion celular se logra a través de la exposición Ultravioleta a áreas específicas que expresan la proteína fluorescente, Eos, en animales vivos.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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