Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Wir bedanken uns bei den UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility für Betreuung und Pflege der STED-Mikroskop. Diese Arbeit wurde durch #68865 von Canadian Institutes of Health Research (zu M.R.G) finanziert. Wir danken Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) für die CLIP-170-GFP-Plasmid.

Alle tierische Verfahren wurden von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt.
(1) mit dem Ausdruck GFP-Fusionsproteinen in A20 B-Lymphom-Zellen
<ol><li>A20 Zellkulturen in komplette RPMI Medium (RPMI-1640 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 50 µM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin ergänzt) bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % CO2.</li>
	<li>Vorbereiten des Tra...

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. 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M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Detaillierte Bilder des Zytoskeletts Strukturen erhalten Sie mit STED Höchstauflösung Mikroskopie, die theoretisch eine Auflösung von 50 erreichen nm, im Vergleich zu konventionellen konfokalen Mikroskopie, wofür die Beugung begrenzte Auflösung ~ 200 beträgt nm 24. die Möglichkeit, feinere Strukturen aufzulösen mithilfe Dekonvolution Software zur Berechnung der wahrscheinlichsten Position der ursprüngliche Lichtquelle aus dem beobachteten "verschwommen" Fluoreszenzsignal verstärkt wird. ...

Wenn B-Zellen zu binden polarisierten Arrays von Antigenen (z.B., angezeigt auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)), der daraus resultierenden B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung Laufwerke die Entstehung einer klassischen immun Synapse Struktur, die erstmals in beschrieben T Zellen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Zunächst Mikrokügelchen Antigen gebunden BCR Form an der Peripherie der B-Zelle: APC-Kontakt-Seite. Diese Mikrokügelchen bewegen sich dann in Richtung der Mitte der Antigen-Kontakt-Seite, wo sie verschmelzen zu einem zentralen supramolekularen Aktivierung-Cluster (cSMAC), die den Kern der immun Synapse bildet. Immun Synapse Bildung optimiert BCR Signalisierung und erleichtert die BCR-vermittelten Antigen-Extraktion aus der APC-Membran-14. Diese Antigen-Akquisition, die BCR-vermittelten Antigen Internalisierung und anschließende Antigen Verarbeitung folgt, kann B-Zellen zu präsentieren Peptid: MHC-II-komplexe, T-Zellen und T-Zell-Hilfe-14zu entlocken. Da immun Synapse Bildung fördert B-Zell-Aktivierung, Aufklärung der Mechanismen, die festlegen, dass diese funktionalen Muster der Rezeptor Organisation neu bieten kann sind Einblicke wie Humorale Immunantwort eingeleitet und geregelt.
Reorganisation der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons ist essentiell für immun Synapse Bildung. Lokalisierte BCR Signalisierung angeregt durch eine räumlich-polarisierten Arrays von Antigenen induziert rasche und drastische Umgestaltung der Aktin-Zytoskelett1,15. Die Bildung von dendritischen Aktin-Strukturen an der Peripherie der B-Zellen übt Druck Kräfte auf die Plasmamembran und fördert die Verbreitung von B-Zellen. Dies ermöglicht die B Zelle, einen größeren Bereich des Antigen-Auflagefläche zu scannen, und erhöht die Anzahl der BCR, die Antigen binden und BCR Signalwege aktivieren. Zur gleichen Zeit sind die MTOC und Mikrotubuli-Netzwerk neu ausgerichtet auf dem Gelände der Antigen-Kontakt. Während die MTOC der Antigen-Kontakt-Seite nähert, verlängern Mikrotubuli, die aus der MTOC entlang der Innenseite der Plasmamembran an der Schnittstelle zwischen der B-Zelle und Antigen tragenden Fläche16,17. Diese Juxtamembrane Mikrotubuli können dann als Titel für die dynien-vermittelten zentripetalen Bewegung der Antigen-gebundenen BCR Mikrokügelchen18, was zur Bildung einer cSMAC handeln.
Die Neuausrichtung und die Polarisation des MTOC gegenüber immun Synapse erfordert intakte Actin und Mikrotubuli Cytoskeletons und hängt oft von Wechselwirkungen zwischen der kortikalen Aktin Netzwerk und Mikrotubuli16,17, 19,20. Kortikale Actin-bindende Proteine, wie IQGAP1, können Mikrotubuli erfassen, durch die Interaktion mit Proteinkomplexe, die Mikrotubuli Plus-enden21schmücken. Diese dynamische komplexe Plus-Ende-bindende Proteine gehören EB1 und CLIP-170, die gemeinsam als Mikrotubuli Plus-tracking-Proteine (+ Tipps)21,22End bezeichnet werden. + Spitzen an den Enden der Mikrotubuli können Proteine binden, die die Plasmamembran oder der kortikalen Aktin-cytoskelett zugeordnet sind. Dies ermöglicht Kraft erzeugenden Mechanismen (z.B.Minus-Ende gerichtet Bewegung des cortically verankert dynien entlang der Mikrotubuli) Zugkräfte auf Mikrotubuli ausüben, und positionieren dabei die MTOC. CLIP-170 kann binden an das Protein Aktin-assoziierten Gerüst IQGAP123, und wir haben gezeigt, dass beide dieser Proteine für MTOC BCR-Induzierte Polarisation in Richtung immun Synapse17erforderlich sind. Diese IQGAP1-CLIP-170-Interaktion kann eine wichtige Rolle bei der Koordinierung der Umbau des Aktin-Zytoskeletts mit der Neupositionierung des Mikrotubuli-Netzwerks an der B-Zelle immun Synapse spielen.
Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie hat die dramatische Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons während B-Cell immun Synapse Bildung2ergeben. Dieser Ansatz kann nicht jedoch kleine zelluläre Strukturen im Detail durch die Beugungsgrenze des Lichts, aufgelöst, die nach dem Abbeschen Gesetz abhängig von der Wellenlänge des Lichts verwendet ist, um die Probe und die Blende der Objektive24beleuchten. Diese Beugungsgrenze schränkt die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopen, 200-300 nm in seitlicher Richtung und 500-700 nm in axialer Richtung25. Daher kleinere subzellulären Strukturen, sowie die feinen Details der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons konnten nur beobachtet werden mit Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopie-Bildgebung des Zytoskeletts ist zeitaufwendig, erfordert harte Probe Fixierung und Vorbereitung Protokolle, die biologische Strukturen zu verändern, und beschränkt sich auf Antikörper-vermittelten Erkennung. Die Fähigkeit, Immunostain und gleichzeitig Bild mehrere Proteine oder zelluläre Strukturen stellt einen wesentlichen Vorteil der Fluoreszenz-Mikroskopie. Darüber hinaus mit dem Ausdruck fluoreszierende Schmelzverfahren Proteine in den Zellen ermöglicht Echtzeit-Bildgebung und ist nützlich, wenn wirksame Antikörper für Immunostaining Protein des Interesses nicht verfügbar sind.
Jüngsten technologischen Fortschritte in der Super-Auflösung Mikroskopie überwinden Sie die Grenzen der Beugung des Lichts und erlaubt die Visualisierung von nanoskaligen Zellstrukturen24. Eine solche super-Resolution-Mikroskopie-Technik heißt stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie. STED beschäftigt zwei Lasern, wo ein Laser regt das Fluorophor und ein zweiten Lasers mit einem Donut-förmigen Muster gezielt unterdrückt die Fluoreszenz-Emission um das Fluorophor. Dies reduziert die Point-Spread Funktion (scheinbare Bereich) ein einzelnes fluoreszierende Partikel und bietet ein Sub Beugung Begrenzung fluoreszierende Bild25,26. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie beschäftigt auch Fluoreszenz-basierte Techniken zu Super-Auflösung erwerben. Aber die Bild-Erwerb und Wiederaufbau-Zeiten sind längst gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Fluorophore, die verwendet werden können und die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung des Zytoskeletts mehrere Komponenten ist technisch anspruchsvoll, da die Verwaltung Aktin und Mikrotubuli Strukturen erfordert unterschiedliche Fixierung Verfahren. Daher STED hat mehrere Vorteile gegenüber der Elektronenmikroskopie und anderen Super-Auflösung Mikroskopie nähert sich, dass es schnelle Bildakquisition bietet, minimale Nachbearbeitung Anforderungen hat und setzt die gleichen Fluorophore und Färbetechniken für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie von örtlich festgelegten Proben26genutzt werden.
Super-Auflösung Mikroskopie wurde jetzt verwendet, um Aktin-Strukturen an der immun Synapse in natürlichen killer (NK)-Zellen und T Zellen26,27,28,29,30, visualisieren 31. jedoch Höchstauflösung Bildgebung des Mikrotubuli-Zytoskeletts sowie die koordinierte Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons bei immun Synapse Bildung, wurde erst vor kurzem berichteten17. B-Bildzellen, die verteilt auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die stimulieren, BCR Signalisierung und initiieren Zytoskelett Reorganisation durfte früher STED-Mikroskopie. Wenn auf immobilisierten Antikörper Anti-Ig verchromt, durchlaufen B-Zellen dramatische Aktin-abhängige verbreiten, die rekapituliert die ursprünglichen Ereignisse während immun Synapse Bildung. Wichtig ist, offenbart STED-Mikroskopie die feinen Details der dendritischen Ring der F-Aktin, die Formen an der Peripherie des Immunsystems synapse und zeigte, dass die MTOC sowie die Mikrotubuli befestigt ist, in der Nähe der Antigen-Kontakt-Seite17bewegt hatte. Diese Mikrotubuli verlängert nach außen in Richtung der Peripherie Ring des F-Aktin. Multi-Color STED Bildgebung verschiedener Kombinationen von F-Actin, Tubulin, IQGAP1, und GFP-markierten CLIP-170 + Tipps Ferner ergab, dass Mikrotubuli Plus-enden gekennzeichnet durch CLIP-170-GFP eng verbunden mit der peripheren Aktin-Geflecht und IQGAP1, waren ein kortikale Erfassung Protein17.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für imaging-Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der immun Synapse mit STED-Mikroskopie. Diese Methoden wurden optimiert mit der A20 murinen B-Zell-Linie, die am meisten beschäftigt war, für das Studium BCR Signal- und immun Synapse Bildung17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. weil kommerzielle Antikörper auf CLIP-170 gut für Immunostaining in früheren Experimenten nicht funktioniert, beschreiben wir ausführlich die Expression von GFP-markierten CLIP-170 in A20 Zellen zusammen mit Färbung Protokolle zur Visualisierung von gleichzeitig bis zu drei Zellskelett Komponenten oder Zytoskelett-assoziierte Proteine. Methoden für die Verwendung von STED-Mikroskopie, Bild Aktin an NK Zelle immun Synapsen wurden40beschrieben. Hier reichen wir dies Höchstauflösung multi-Color-Bilder von der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons in B-Zellen zu erwerben.
Eine kritische Betrachtung für die Höchstauflösung Mikroskopie nutzt die entsprechende Fixierung-Verfahren für die Aufrechterhaltung der Zellstrukturen und vermeiden von Schäden an fluoreszierenden Proteinen. Die Fixierung und Färbung hierin vorgestellten Methoden wurden optimiert, um GFP Fluoreszenz zu behalten und bieten hochauflösende Bildgebung der Aktin und Mikrotubuli. Wenn fluoreszierende Proteine zum Ausdruck zu bringen, sollte angemerkt werden, dass B-Zellen in der Regel schwer zu transfizieren. Mithilfe dieses Protokolls 20-50 % von A20 express Zellen in der Regel den transfizierten GFP Fusionsprotein, und unter dieser Bevölkerungsgruppe sind die Ebenen der Proteinexpression variabel. Trotzdem super-Resolution Imaging von Aktin und Mikrotubuli, die mit den Verfahren, die wir beschreiben ist recht robust und qualitativ hochwertige Bilder sind leicht erhältlich. Trotz ihrer geringen Größe im Verhältnis zu A20 Zellen zeigen wir, dass diese Verfahren auch verwendet werden können, zum Bild der Mikrotubuli-Netzwerk im primären B-Zellen, die kurz mit Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert wurden. Wir haben gezeigt, dass LPS aktiviert primäre B-Zellen mit siRNA mit relativ hohem Wirkungsgrad (d. h.so, dass Protein Erschöpfung durch Immunoblotting nachgewiesen werden kann), transfiziert werden können so dass sie eine gute Alternative zu der Verwendung von B-Zell-Linien für einige Studien 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 mouse B-lymphoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-208</td>
			<td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;R0883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Liquid, 10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional materials for primary B cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19854</td>
			<td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS from E. coli 0111:B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B cell-activating factor (BAFF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2106-BF-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recommended transfection reagents and equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1217N81</td>
			<td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1381242</td>
			<td>Dissecting extra fine splinter forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-008</td>
			<td>For A20 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-020</td>
			<td>For primary mouse B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>340855</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52866</td>
			<td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11009</td>
			<td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>Scientific Voume Imaging</td>
			<td></td>
			<td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

B-Zellen, die an Membran-gebundene Antigene (z.B.auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle) binden bilden eine immun Synapse, eine spezielle Zellstruktur, die B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung optimiert und BCR-vermittelten Antigen Erwerb. Der Umbau des Aktin-Zytoskeletts und die Neuausrichtung des Mikrotubuli-Netzwerkes gegenüber der Antigen-Kontakt-Seite sind für immun Synapse Bildung unerlässlich. Umbau des Aktin-Zytoskeletts in einem dichten peripheren Ring des F-Aktin wird begleitet von Polarisation des Mikrotubuli-organizing Centers gegenüber immun Synapse. Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine, sowie kortikalen Plus-End Capture Proteine vermitteln physikalische Wechselwirkungen zwischen den Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons, die ihnen ermöglichen, in koordinierter Weise reorganisiert werden. Aufklärung der Mechanismen, Kontrolle, die das Zellskelett Reorganisation sowie verstehen wie diese Zellskelett Strukturen immun Synapse Bildung und BCR-Signalisierung, gestalten bieten neue Einblicke in die B-Zell-Aktivierung. Dies hat durch die Entwicklung von Super-Auflösung Mikroskopie Ansätzen unterstützt worden, die neue des Zytoskeletts Netzwerkorganisation Details. Wir beschreiben hier eine Methode für die Verwendung von stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und transfizierten GFP-Tags Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen. Um die frühen Ereignisse immun Synapse Bildung zu modellieren, ermöglichen wir den B-Zellen zu verbreiten auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die BCR-Signalisierung und cytoskelett Umbau zu initiieren. Wir bieten detaillierte Protokolle für den Ausdruck von GFP Fusionsproteine in A20 B-Lymphom-Zellen, für die Verbreitung von Anti-Ig-induzierte Zelle und für nachfolgende Zelle Fixierung, Immunostaining, Bildaufnahme und Bild Dekonvolution Schritte. Die hochauflösenden Bilder mithilfe dieser Verfahren erlauben es, gleichzeitig visualisieren Aktin Strukturen, Mikrotubuli und die Mikrotubuli Plus-Ende bindende Proteine, die diese beiden Zellskelett Netzwerke verbinden können.

Für B-Zellen auf immobilisierte Anti-Ig zu verbreiten bietet STED-Mikroskopie, die in Verbindung mit Dekonvolution Software verwendet Bilder mit höherer Auflösung des Zytoskeletts Strukturen als konfokalen Mikroskopie. Dies zeigt sich in Abbildung 1, wo F-Aktin-Netzwerk mit dem oben beschriebenen Protokoll visualisiert wurde. Ein Vergleich der konfokalen und STED Höchstauflösung Bilder von der gleichen Probe zeigt, dass die STED-Bilder einer höheren Auf...

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Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von STED-Mikroskopie, gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen, die auf Deckgläsern beschichtet mit Antikörpern gegen den B-Zell-Rezeptor, ein Modell für die Anfangsphase verbreitet haben der immun Synapse Formation.

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

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