Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Vi takker UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging anlegg for støtte og vedlikeholde STED mikroskopet. Dette arbeidet ble finansiert av stipend #68865 fra kanadiske institutter for helseforskning (til M.R.G.). Vi takker Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) for CLIP-170-GFP plasmider.

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av University of British Columbia dyr omsorg komiteen.
1. uttrykke GFP-fusion proteiner i A20 B-lymfom celler
<ol><li>Kultur A20 celler i fullføre RPMI medium (RPMI-1640 supplert med 10% inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 50 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM glutamin, 1 mM pyruvate, 50 U/mL penicillin og 50 µg/mL streptomycin) på 37 ° C i en vev kultur inkubator med 5 % CO2.</li>
	<li>Forberede transfection reagensen (se Tabell for mater...

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunter+to+gatherer+and+back:+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion.">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster.">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion.">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li><li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse.">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+organization+and+dynamics:+two+ends+in+the+limelight.">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule++TIPs+at+a+glance.">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li><li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170.">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Detaljerte bilder av cellen cytoskjelett strukturer kan oppnås ved hjelp av STED super-oppløsning mikroskopi, som kan teoretisk sett oppnå en oppløsning på 50 nm, sammenlignet med konvensjonelle AC confocal mikroskopi, som Diffraksjon-begrenset oppløsningen er ~ 200 nm 24. muligheten til å løse mindre strukturer er fremme forsterket med deconvolution programvare for å beregne sannsynligvis plasseringen av den opprinnelige lyskilden fra observerte "uklare" fluorescens signalet. Denne proto...

Når B-cellene binder seg til polarisert matriser av antigener (f.eksvises på overflaten av antigen presentere celler (APCs)), den resulterende B-celle reseptoren (BCR) signalering stasjoner dannelsen av en klassisk immun synapse struktur, som først ble beskrevet i T celler1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Først microclusters antigen-bundet BCRs skjemaet i periferien av B celle: APC kontakten nettstedet. Disse microclusters går mot midten av antigen kontakten nettstedet, hvor de koaliserer til en sentral supramolecular aktivisering-klynge (cSMAC) som er kjernen i immun synapse. Immun synapse formasjon optimaliserer BCR signalering og forenkler BCR-mediert antigen utvinning fra APC membran14. Antigen oppkjøpet, som er etterfulgt av BCR-mediert antigen internalisering og påfølgende antigen prosessering, lar B celler presentere peptid: MHC II komplekser T celler og framprovosere T celle hjelp14. Fordi immun synapse formasjon fremmer B celle aktivering, Klargjørende mekanismer som etablerer denne funksjonelle mønster av reseptor organisasjon kan gi ny er innsikt i hvordan humoral immunreaksjoner initiert og regulert.
Omorganisering av både utgangen og microtubule cytoskeletons er viktig for immun synapse formasjon. Lokaliserte BCR signalering stimulert av en romlig-polarisert rekke antigener induserer raske og dramatiske remodeling av utgangen cytoskjelett1,15. Dannelsen av dendrittiske begrepsordbok strukturer i utkanten av B-cellen utøver skyve styrker på plasma membranen og fremmer B celle spredning. Dette gjør B-cellen til å skanne et større område av antigen-bærende overflaten, og øker antallet BCRs som binder antigen og aktivere BCR signalnettverk trasé. Samtidig er MTOC og microtubule nettverket reorientert mot stedet antigen kontakt. Som MTOC tilnærminger antigen kontakten nettstedet, utvide piskehale som henger fra MTOC langs indre ansiktet av plasma membranen i grensesnittet mellom B-cellen og antigen-bærende overflaten16,-17. Disse juxtamembrane piskehale som henger så fungere som spor for dynein-mediert sentripetal bevegelsen av antigen-bundet BCR microclusters18, fører til dannelsen av en cSMAC.
Den nyorientering og polarisering av MTOC mot immun synapse krever intakt utgangen og microtubule cytoskeletons, og ofte avhenger av samspillet mellom kortikale begrepsordbok nettverks- og piskehale som henger16,17, 19,20. Kortikale begrepsordbok bindende proteiner, slik som IQGAP1, kan ta piskehale som henger av samspill med protein komplekser som dekorerer microtubule plus-ender21. Disse dynamiske komplekser plus-end bindende proteiner inkluderer EB1 og KLIPPET-170, som er kollektivt referert til som microtubule plus-end sporing proteiner (+ TIPs)21,22. + TIPs på endene av piskehale som henger kan binde proteiner som er tilknyttet plasma membranen eller kortikale begrepsordbok cytoskeleton. Dette tillater generering av force mekanismer (f.eksminus-slutten regissert av cortically-forankret dynein langs piskehale som henger) å utøve trekke styrker på piskehale som henger, og dermed endre plassering av MTOC. CLIP-170 kan binde til utgangen-assosiert stillas protein IQGAP123, og vi har vist at begge disse proteinene er nødvendig for BCR-indusert MTOC polarisering mot de immune synapse17. Dette IQGAP1-CLIP-170 samspillet kan spille en nøkkelrolle i koordineringen remodeling av utgangen cytoskeleton med reposisjonering av microtubule nettverket B-celle immun synapse.
Konvensjonelle fluorescens mikroskopi har avdekket dramatiske omorganiseringen av utgangen og microtubule cytoskeletons under B-celle immun synapse formasjon2. Men kan ikke denne tilnærmingen løse små cellular strukturer i detalj på grunn av Diffraksjon begrensning av lys, som, ifølge Abbe er lov, er avhengig av bølgelengden til lyset brukes til å belyse prøven og blenderåpning av målet24. Denne Diffraksjon grensen begrenser oppløsningen av konvensjonelle lys mikroskop 200-300 nm i laterale retning og 500-700 nm i aksial retning25. Derfor mindre subcellular strukturer, samt fine detaljer om utgangen og microtubule cytoskeletons, kan bare være observert med elektronmikroskop. Elektronmikroskop bildebehandling i cytoskeleton er tidkrevende, krever sterke utvalg fiksering og forberedelse protokoller som kan endre biologiske strukturer, og er begrenset til antistoff-mediert gjenkjenning. Evnen å immunostai og samtidig bilde flere proteiner eller cellular strukturer er en betydelig fordel av fluorescens mikroskopi. Videre uttrykke fluorescerende fusion proteiner i celler kan sanntid bildebehandling og er nyttig når effektiv antistoffer for immunostaining protein av interesse ikke er tilgjengelige.
Siste teknologiske fremskritt i super-oppløsning mikroskopi har overvinne Diffraksjon grensene av lys og lov visualisering av nanoskala cellulære strukturer24. En slik super-oppløsning mikroskopi teknikken kalles tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi. STED benytter to lasere, der en laser interesserer fluorophore og en andre laser med en smultring-formet mønster selektivt undertrykker fluorescens utslipp rundt på fluorophore. Dette reduserer spilltilbud funksjonen (tilsynelatende område) til en enkelt fluorescerende partikkel og gir en sub Diffraksjon grense fluorescerende bilde25,26. Bakken-state uttømming mikroskopi bruker også fluorescens-baserte teknikker for å hente super-oppløsning bilder. Imidlertid bilde oppkjøpet og gjenoppbygging tidene er lang, det er bare et begrenset antall fluorophores som kan brukes og samtidig med høy oppløsning avbilding av flere cellen cytoskjelett komponenter er teknisk utfordrende fordi opprettholde utgangen og microtubule strukturer krever ulike fiksering prosedyrer. Derfor STED har flere fordeler fremfor elektronmikroskop og andre super-oppløsning mikroskopi tilnærminger i at det tilbyr rask bildeopptak har minimal etterbehandling krav og benytter den samme fluorophores og flekker teknikker som brukes for konvensjonelle fluorescens mikroskopi fast prøver26.
Super-oppløsning mikroskopi er nå brukt til å visualisere begrepsordbok strukturer på immun synapse i naturlige killer (NK) celler og T celler26,27,28,29,30, 31. men super-oppløsning bildebehandling i microtubule cytoskeleton og koordinert omorganiseringen av utgangen og microtubule cytoskeletons under immun synapse formasjon, har nylig vært rapportert17. Vi brukte STED mikroskopi bilde B celler som hadde fått lov til å spre på coverslips belagt med anti-immunglobulin (anti-Ig) antistoffer, som stimulerer BCR signalering og starte cytoskjelett omorganisering. Når belagt på immobilisert anti-Ig-antistoffer, gjennomgår B-cellene dramatiske utgangen-avhengige spredning, som viser de innledende eventene under immun synapse formasjon. Viktigere, avslørte STED mikroskopi de fine detaljene av dendrittiske ringen av F-utgangen som former i periferien av immunsystemet synapse og viste at MTOC, samt piskehale som henger knyttet til det, hadde flyttet nær antigen kontakten nettstedet17. Disse piskehale som henger utvidet utover mot den ytre ringen av F-utgangen. Videre multi-farge STED imaging forskjellige kombinasjoner av F-utgangen, tubulin, IQGAP1, og GFP-merket CLIP-170 + TIPs viste at microtubule plus-ender preget av klipp-170-GFP var nært forbundet med eksterne begrepsordbok meshwork og IQGAP1, en kortikale fange protein17.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for imaging utgangen og microtubule cytoskeletons på immun synapse bruker STED mikroskopi. Disse metodene er optimalisert ved hjelp av A20 murine B celle linjen, som har blitt viden ansatt for å studere BCR signalisering og immun synapse formasjon17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. fordi kommersielle antistoffer mot CLIP-170 ikke fungerer godt for immunostaining i forrige eksperimenter, vi beskrive i detalj uttrykk for GFP-merket CLIP-170 i A20 celler, sammen med Fargeprotokoller for å visualisere samtidig på opptil tre cellen cytoskjelett komponenter eller cytoskeleton-assosiert proteiner. Metoder for å bruke STED mikroskopi til bildet utgangen på NK celle immun synapser har vært beskrevet tidligere40. Her utvide vi dette til å erverve flere super fargeoppløsning bilder av både utgangen og microtubule cytoskeletons i B-celler.
En kritisk vurdering for super-oppløsning mikroskopi bruker riktig fiksering prosedyrer for å opprettholde cellulære strukturer og forebygge skader å fluorescerende proteiner. Fiksering og flekker metoder presenteres her har blitt optimalisert for å beholde GFP fluorescens og gi høyoppløselige bilder av utgangen og microtubule nettverk. Når uttrykke fluorescerende proteiner, bør det bemerkes at B-cellene er vanligvis vanskelig å transfect. Bruker denne protokollen, 20-50% av A20 celler uttrykke vanligvis transfekterte GFP fusion protein, og blant denne befolkning protein uttrykk er variabel. Likevel super-oppløsning imaging utgangen og piskehale som henger bruke prosedyrer beskriver vi er ganske robust og bilder av høy kvalitet er lett oppnådd. Tross sin lille størrelse i forhold til A20 celler viser vi at disse prosedyrene kan også brukes til bilde microtubule nettverket i primære B celler som har aktivert kort med lipopolysakkarid (LPS). Vi har vist at LPS-aktivert primære B celler kan være transfected med siRNAs med relativt høy effektivitet (dvs.slik at protein uttømming kan oppdages av immunoblotting), noe som gjør dem et godt alternativ til bruk av B-cellelinjer for noen studier 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 mouse B-lymphoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-208</td>
			<td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;R0883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Liquid, 10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional materials for primary B cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19854</td>
			<td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS from E. coli 0111:B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B cell-activating factor (BAFF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2106-BF-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recommended transfection reagents and equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1217N81</td>
			<td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1381242</td>
			<td>Dissecting extra fine splinter forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-008</td>
			<td>For A20 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-020</td>
			<td>For primary mouse B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>340855</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52866</td>
			<td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11009</td>
			<td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>Scientific Voume Imaging</td>
			<td></td>
			<td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

B-celler som binder til membran-bundet antigener (f.ekspå overflaten av et antigen-presentasjon celle) danner en immun synapse, en spesialisert cellestruktur som optimaliserer B-celle reseptor (BCR) signalering og BCR-mediert antigen oppkjøp. Begge remodeling begrepsordbok cytoskeleton og omleggingen av microtubule nettverket mot antigen kontakten nettstedet er avgjørende for immun synapse formasjon. Ombygging av utgangen cytoskeleton i en tett perifer ring av F-utgangen er ledsaget av polarisering av microtubule-organisere sentrum mot immun synapse. Microtubule plus-end bindende proteiner, samt kortikale plus-end fange proteiner megle fysiske interaksjonene mellom utgangen og microtubule cytoskeletons, som tillater dem å bli omorganisert på en koordinert måte. Klargjørende mekanismer som kontroll denne cellen cytoskjelett omorganisering, i tillegg til å forstå hvordan disse cellen cytoskjelett strukturer forme immun synapse dannelse og BCR signalnettverk, kan gi ny innsikt i B-celle aktivering. Dette har blitt hjulpet av utviklingen av super-oppløsning mikroskopi tilnærminger som avslører nye detaljer om cellen cytoskjelett nettverk organisasjon. Her beskriver vi en metode for å bruke tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi samtidig bilde begrepsordbok strukturer, piskehale som henger og transfekterte GFP-merket microtubule plus-end bindende proteiner i B-celler. For å modellere tidlige hendelser i immun synapse formasjon, tillater vi B celler å spre på coverslips belagt med anti-immunglobulin (anti-Ig) antistoffer, som starter BCR signalisering og cytoskjelett remodeling. Vi gir trinnvise protokoller for å uttrykke GFP fusion proteiner i A20 B-lymfom celler for anti-Ig-indusert celle spredning og for påfølgende celle fiksering, immunostai-, bildeopptak og bilde deconvolution trinnene. Høyoppløselige bilder innhentet ved hjelp av disse prosedyrene kan en samtidig visualisere begrepsordbok strukturer og piskehale som henger microtubule plus-end bindende proteiner som kan koble disse to cellen cytoskjelett nettverk.

B celler sprer seg på immobilisert anti-Ig, gir STED mikroskopi brukes sammen med deconvolution programvare høyere oppløsning av cellen cytoskjelett strukturer enn AC confocal mikroskopi. Dette er tydelig i figur 1, der F-utgangen nettverket var visualisert ved hjelp av protokollen som beskrevet ovenfor. En sammenligning av AC confocal STED super-oppløsning bilder av samme prøve viser at STED bildene er av høyere oppløsning og avslører mer av utgangen...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Vi presenterer en protokoll for bruk av STED mikroskopi samtidig bilde begrepsordbok strukturer, piskehale som henger og microtubule plus-end bindende proteiner i B-celler som har spredt på coverslips belagt med antistoffer mot B-celle reseptor, en modell for startfasen immun synapse-formasjonen.

Visualisere utgangen og Microtubule Cytoskeletons på B-celle immun Synapse med tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Visualisering av den immunologiske Synapse av Dual Color Time-gated Stimulert Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Co flekker blod fartøy og Nerve fiber i fettvev

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...