Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Agradecemos o Instituto de ciências biomédicas da UBC (LSI) Imaging Facility para apoiar e manter o microscópio STED. Este trabalho foi financiado por grant #68865 dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (M.R.G.). Agradecemos o Dr. Kozo Kaibuchi (Universidade de Nagoya, Nagoya, Japão) para o plasmídeo CLIP-170-GFP.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pela Universidade de British Columbia Animal conta Comité.
1. expressar proteínas GFP-fusão células A20 B-linfoma
<ol><li>Células de cultura A20 em completar meio RPMI (RPMI-1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 50 µM 2-Mercaptoetanol, glutamina 2mm, piruvato de 1 mM, 50 penicilina U/mL e 50 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos com 5 % CO2.</li>
	<li>Pr...

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunter+to+gatherer+and+back:+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion.">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster.">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion.">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li><li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse.">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule++TIPs+at+a+glance.">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li><li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170.">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Imagens detalhadas das estruturas do citoesqueleto podem ser obtidas usando microscopia de super-resolução STED, que teoricamente pode alcançar uma resolução de 50 nm, em comparação com microscopia confocal convencional, para os quais a resolução de difração limitada é ~ 200 nm 24. a capacidade de resolver estruturas mais finas é reforçada por usando deconvolução software para calcular a posição mais provável da fonte de luz original do sinal de fluorescência "turva" observados...

Quando as células B vincular a polarizada matrizes de antígenos (por exemplo, exibido na superfície do antígeno-apresentando células (APCs)), o resultante receptor de células B (BCR) sinalização drives a formação de uma estrutura clássica sinapse imunológica, que foi primeira descrita em T células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, microclusters de antígeno-limite BCRs verbo na periferia da célula B: APC contato local. Estes microclusters, em seguida, mover em direção ao centro do site contato antígeno, onde se fundirem em um cluster de activação supramolecular central (cSMAC) que forma o núcleo da sinapse imunológica. Formação de sinapse imunológica otimiza BCR sinalização e facilita a extração de BCR-mediada do antígeno de membrana APC14. Esta aquisição do antígeno, que é seguida por internalização mediada por BCR antígeno e processamento do antígeno subsequentes, permite que as células B apresentar peptídeo: MHC complexos II para células T e obter ajuda de células T14. Porque a formação de imune sinapse promove a ativação de células B, elucidar os mecanismos que estabelecem que este padrão funcional da organização do receptor pode fornecer novos insights sobre como humorais respostas imunes são iniciadas e regulamentadas.
Reorganização do citoesqueleto de actina e microtúbulos é essencial para a formação de sinapse imunológica. BCR localizada sinalização estimulados por uma matriz espacialmente polarizado de antígenos induz rápida e dramática que remodela o citoesqueleto de actina1,15. A formação de estruturas dendríticas actina na periferia da célula B exerce forças empurra na membrana plasmática e promove a disseminação de células B. Isto permite que a célula B para fazer a varredura de uma área maior da superfície do antígeno-rolamento e aumenta o número de BCRs que ligam o antígeno e ativar BCR vias de sinalização. Ao mesmo tempo, o MTOC e a rede de microtúbulos são reorientados para o local de contato do antígeno. Como o MTOC aproxima-se o local de contato do antígeno, microtúbulos emana o MTOC se estendem ao longo da face interna da membrana plasmática na interface entre a célula B e a superfície do antígeno-rolamento16,17. Estes microtúbulos juxtamembrane podem então agir como faixas para o movimento centrípeto mediada por Dineína de antígeno-limite BCR microclusters18, levando à formação de um cSMAC.
A reorientação e a polarização do MTOC no sentido da sinapse imunológica requer actina intacta e citoesqueleto do microtúbulo e muitas vezes depende de interações entre o actin cortical rede e microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de ligação de actina corticais, como IQGAP1, podem capturar os microtúbulos interagindo com complexos de proteína que decoram o microtubule mais fins-de-21. Estes dinâmicos complexos de proteínas plus-final incluem EB1 e CLIP-170, que são coletivamente referidos como microtubule plus-final rastreamento proteínas (+ dicas)21,22. + Dicas nas extremidades dos microtúbulos podem ligar às proteínas que estão associadas com a membrana plasmática ou o citoesqueleto de actina cortical. Isso permite que os mecanismos de geração de força (por exemplo, o subtração-final dirigido movimento de Dineína corticalmente ancorada ao longo de microtúbulos) exercer forças de tração sobre os microtúbulos, e desse modo reposicionar o MTOC. CLIP-170 pode ligar à proteína associada a actina andaimes IQGAP123, e mostramos que ambos destas proteínas são necessários para a polarização induzida por BCR MTOC em direção a sinapse imunológica17. Essa interação IQGAP1-clipe-170 pode desempenhar um papel fundamental na coordenação a remodelação do citoesqueleto de actina com o reposicionamento da rede microtubule a sinapse imunológica célula B.
Microscopia de fluorescência convencional revelou a reorganização dramática do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a célula B sinapse imune formação2. No entanto, esta abordagem não pode resolver pequenas estruturas celulares em detalhe devido o limite de difração de luz, que, de acordo com a lei do Abbe, depende do comprimento de onda de luz que serve para iluminar a amostra e a abertura do objetiva24. Este limite de difração restringe a resolução dos microscópios de luz convencionais para 200-300 nm no sentido lateral e 500-700 nm na direção axial25. Portanto, menores estruturas subcelulares, bem como os detalhes do citoesqueleto de actina e microtúbulos, poderiam apenas ser observados usando microscopia eletrônica. Imagem de microscopia eletrônica do citoesqueleto é demorada, exige protocolos de fixação e preparação amostra dura que podem alterar estruturas biológicas e é limitado à detecção do anticorpo-negociada. A capacidade de delgados e simultaneamente várias proteínas de imagem ou estruturas celulares é uma vantagem substancial de microscopia de fluorescência. Além disso, expressar proteínas da fusão fluorescente em células permite a geração de imagens em tempo real e é útil quando não existem anticorpos eficazes para immunostaining da proteína de interesse.
Recentes avanços tecnológicos em microscopia de super-resolução superaram os limites de difração de luz e permitiu a visualização de estruturas celulares de nanoescala24. Uma tal técnica de microscopia de super-resolução chama-se microscopia de depleção (STED) emissão estimulada. STED emprega dois lasers, onde um laser excita o fluoróforo e um segundo laser com um padrão em forma de donut seletivamente suprime a emissão de fluorescência em torno do fluoróforo. Isto reduz a função de ponto-propagação (área aparente) de uma única partícula fluorescente e fornece um sub difração limite imagem fluorescente25,26. Microscopia de esgotamento do solo-estado também emprega técnicas baseadas em fluorescência para adquirir imagens de super-resolução. No entanto, os tempos de aquisição e reconstrução de imagem são longos, há apenas um número limitado de fluorophores que pode ser usado, e a imagem de alta resolução simultânea de vários componentes do citoesqueleto é tecnicamente desafiador porque manter estruturas de actina e microtúbulos requer procedimentos de fixação diferentes. Portanto, STED tem várias vantagens sobre microscopia eletrônica e outra microscopia de super-resolução se aproxima em que oferece aquisição de imagem rápida, tem requisitos mínimos de pós-processamento e emprega a mesma fluorophores e técnicas de coloração que são utilizados para microscopia de fluorescência convencional de amostras fixas26.
Microscopia de super-resolução agora tem sido utilizada para visualizar estruturas de actina na sinapse imunológica em assassino naturais (NK) células e T células26,,27,28,29,30, 31. no entanto, imagem de super-resolução de citoesqueleto do microtúbulo, bem como a reorganização coordenada do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a formação da sinapse imunológica, só foi recentemente relatado17. Nós costumávamos microscopia STED células de imagem B que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos que estimulam a BCR sinalização e iniciar a reorganização do citoesqueleto. Quando banhado em imobilizado anticorpos anti-Ig, células B submeter-se dramática dependente de actina se espalhando, que recapitula os eventos iniciais durante a formação da sinapse imunológica. Importante, microscopia STED revelou os detalhes do anel dendrítica de F-Actina que formulários na periferia de imune a sinapse e mostraram que o MTOC, bem como os microtúbulos ligados a ela, havia se mudado perto o antígeno contato local17. Estes microtúbulos estendido para fora para o anel periférico de F-Actina. Além disso, imagens de STED multi cor de várias combinações de F-Actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etiquetado CLIP-170 + dicas mostraram que microtubule mais fins-de-marcados pelo CLIP-170-GFP eram intimamente associados com a malha de actina periférica e com IQGAP1, um proteína de captura cortical17.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o citoesqueleto de actina e microtúbulos na sinapse imune usando microscopia STED de imagem. Esses métodos foram otimizados usando a linha de murino B célula A20, que tem sido amplamente utilizada para estudar a sinalização BCR e sinapse imune formação17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticorpos comerciais para CLIP-170 não funcionou bem para immunostaining em experiências anteriores, descrevemos em detalhe a expressão de GFP-etiquetado CLIP-170 nas células A20, juntamente com protocolos para a visualização em simultâneo de até de coloração três componentes do citoesqueleto ou proteínas de citoesqueleto associadas. Métodos para usando microscopia STED actina imagem em sinapses imunes do NK células têm sido descritos anteriormente40. Aqui, podemos estender esta para aquisição de imagens de resolução super multi cor do citoesqueleto de actina e microtúbulos nas células B.
Uma consideração crítica para microscopia de super-resolução é usando os procedimentos de fixação adequadas para a manutenção de estruturas celulares e prevenção de danos às proteínas fluorescentes. A fixação e coloração métodos aqui apresentados foram otimizados para reter a fluorescência de GFP e fornecer imagens de alta resolução das redes de actina e microtúbulos. Quando expressar proteínas fluorescentes, deve notar-se que as células B são geralmente difíceis de transfect. Usando este protocolo, 20-50% de A20 células geralmente expressam a proteína de fusão de GFP transfectada, e entre esta população, os níveis de expressão da proteína são variáveis. Não obstante, imagem latente de super-resolução de actina e microtúbulos usando os procedimentos que descrevemos é bastante robusto e imagens de alta qualidade são facilmente obtidas. Apesar de seu tamanho pequeno em relação as células A20, mostramos que esses procedimentos também podem ser usados para a rede de microtúbulos na primárias células B que foram ativados brevemente com lipopolissacarídeo (LPS) de imagem. Temos demonstrado que as células B primárias LPS-ativado podem ser transfected com siRNAs com eficiência relativamente alta (ou seja, tal que a depleção de proteína pode ser detectada pelo immunoblotting), tornando-os uma boa alternativa para o uso de linhas de células B para alguns estudos 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 mouse B-lymphoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-208</td>
			<td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;R0883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Liquid, 10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional materials for primary B cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19854</td>
			<td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS from E. coli 0111:B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B cell-activating factor (BAFF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2106-BF-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recommended transfection reagents and equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1217N81</td>
			<td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1381242</td>
			<td>Dissecting extra fine splinter forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-008</td>
			<td>For A20 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-020</td>
			<td>For primary mouse B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>340855</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52866</td>
			<td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11009</td>
			<td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>Scientific Voume Imaging</td>
			<td></td>
			<td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

Células B que se ligam aos antígenos de membrana-limite (por exemplo, na superfície de uma célula apresentadora de antígeno) formam uma sinapse imunológica, uma estrutura celular especializada que otimiza a sinalização da B-pilha do receptor (BCR) e aquisição de antígeno BCR-mediada. A remodelação do citoesqueleto de actina e a reorientação da rede microtubule em direcção ao local de contato do antígeno são essenciais para a formação de sinapse imunológica. Remodelação do citoesqueleto de actina, em um anel periférico denso de F-Actina é acompanhada de polarização do centro em direção a sinapse imunológica microtubule-organizadora. Proteínas microtubule plus-final, bem como proteínas cortical plus-final captura mediam interações físicas entre o citoesqueleto de actina e microtúbulos, que lhes permite a ser reorganizado de forma coordenada. Elucidação dos mecanismos que controle Esta reorganização do citoesqueleto, bem como a compreensão de como essas estruturas do citoesqueleto forma formação sinapse imunológica e BCR sinalização, pode fornecer novos insights sobre a ativação de células B. Isto tem sido ajudado pelo desenvolvimento de abordagens de microscopia de super-resolução que revelam novos detalhes de organização da rede do citoesqueleto. Descrevemos aqui um método para usar microscopia de depleção (STED) emissão estimulada simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule GFP-etiquetado transfectadas plus-final nas células B. Para modelar os eventos iniciais na formação de sinapse imunológica, podemos permitir que as células B espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos, que iniciam a remodelação do citoesqueleto e sinalização de BCR. Nós fornecemos protocolos passo a passo para expressar proteínas da fusão de GFP nas células A20 B-linfoma de célula anti Ig-induzida por espalhamento e para fixação da pilha subsequentes, imunocoloração, aquisição de imagem e imagem deconvolução etapas. As imagens de alta resolução obtidas usando estes procedimentos permitem visualizar simultaneamente estruturas de actina, os microtúbulos e as proteínas de ligação plus-final microtubule que podem unir essas duas redes do citoesqueleto.

Para as pilhas de B se espalhando em imobilizado anti-Ig, microscopia STED usada em conjunto com software de deconvolução fornece imagens de alta resolução de estruturas do citoesqueleto de microscopia confocal. Isto é evidente na Figura 1, onde a rede de F-Actina foi visualizada usando o protocolo descrito acima. Uma comparação de confocal e imagens de super-resolução STED da mesma amostra mostra que as imagens STED são de resolução mais alta e r...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

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Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

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