Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور جيرولد R. تيرنر، من مستشفى بريغهام والنساء، مدرسة هارفارد الطبية، لمساعدته السخية في إتمام هذه الدراسة. هذا العمل معتمد من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81470804 و 31401229 و 81200620)، ومؤسسة العلوم الطبيعية من جيانغسو (المنحة رقم BK20180838 و BK20140319)، "البحوث الابتكار برنامج" ل خريجي كلية من مقاطعة جيانغسو (رقم المنحة KYLX16-0116)، متقدمة البحث المشاريع من سوشو جامعة (المنحة رقم SDY2015_06)، وكرون والتهاب القولون مؤسسة بحوث جائزة الزمالة (منح رقم 310801).

واعتمد هذه الدراسة برعاية الحيوان واستخدام بروتوكول من كامبردج-سودا الجينوم مركز الموارد (كام-سو)، جامعة سوشو.
1-طلاء وصيانة 2bbe كربونات الكالسيوم في أغشية البولي المسامية
<ol><li>تنمو الخلايا في قارورة T75 مع وسائل الإعلام (دميم التي تحتوي على 10% FBS). وينبغي تغذية قوارير بانتظام،...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. كربونات الكالسيوم-2BBe (فرشاة الحدود-وإذ يعرب عن) خلايا تستخدم دائماً لقياس تير، مختارة من خط خلية كربونات الكالسيوم-2 للتعبير عن البروتينات الفرشاة للحدود. تحتوي الخلايا 2BBe كربونات الكالسيوم من النمط الظاهري الاستيعابية الزوائد عند متباينة تم?...

الخلايا الظهارية المعوية ليست مسؤولة عن امتصاص المواد المغذية فحسب، ولكن أيضا تشكل عائقا هاما الدفاع عن نفسه ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض والسموم الميكروبية. وينظم هذه الدالة الحاجز المعوي نفاذية مفرق ضيق والخلايا الظهارية سلامة1،،من23، والخلل الوظيفي لوظيفة الحاجز الظهارية يرتبط مع التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين). خاتم أكتوميوسين بيريجونكشونال (PAMR) تقع داخل الخلية غير متجاورة عن كثب للوصلات ضيق. تقلص PAMR، الذي ينظمه في سلسلة الميوسين الخفيفة (حركة تحرير الكونغو)، أمر حاسم لتنظيم مفرق ضيق نفاذية4،5،6،،من78، 9،10. عامل نخر الورم (تنف) أمر أساسي لفقدان جدار الأمعاء بحركة تحرير الكونغو الظهارية المعوية أوبريجولاتينج كيناز (ملكك) التعبير وحمل أوككلودين استيعاب11،،من1213.
يمكن عبور أيونات مثل Na+ و Cl– الفضاء باراسيلولار ب مسار المسامية أو تسرب14. في ظهارة "راشح"، تعكس التغييرات في تير أساسا مفرق ضيق تغيير النفاذية. قياس مكررا ثانيا نهج الكهربية المستخدمة عادة لقياس النفاذية مفرق ضيق، أساسا إلى نا+ و Cl-، استناداً إلى المقاومة مونولاييرس الخلية. وأبلغ أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا الظهارية المعوية والرئوية الخلايا الظهارية، والخلايا البطانية الوعائية، للقياسات مكررا ثانيا. فوائد هذا الأسلوب هي أن القياسات ثالثا غير الغازية ويمكن استخدامها لرصد خلايا حية في الوقت الحقيقي. وباﻹضافة إلى ذلك، تقنية قياس تير مفيد ل الدراسات السمية المخدرات15.
كربونات الكالسيوم-2BBe الخلايا خلايا غدية القولون الظهارية البشرية مع هيكل ووظيفة مشابهة للخلايا الظهارية المعوية صغيرة متباينة: فعلى سبيل المثال، يكون هذه الخلايا زغيبات والأنزيمات المرتبطة بفرشاة صغيرة في الأمعاء الحدود. ولذلك، ومثقف 2BBe كربونات مونولاييرس تستخدم كنموذج في المختبر لاختبار وظيفة الحاجز.
في الفئران، إحدى الطرق لدراسة نفاذية الأمعاء باراسيلولار بقياس قدرة فيتك-ديكستران على عبور الدم من التجويف. وهكذا، يمكن تقييم نفاذية الأمعاء قبل جافاجينج فيتك-ديكستران مباشرة في الفئران وقياس الأسفار داخل الدم. البروتوكول التالية توضح هذه المقالة طريقتين بسيطة لتقييم نفاذية ظهارة الأمعاء في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

الحاجز المعوي يدافع ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض، والسمية الجرثومية. ينظم وظيفتها نفاذية مفرق ضيق وسلامة الخلايا الظهارية، وتعطيل وظيفة جدار الأمعاء يسهم في تطور الأمراض المعدية المعوية والجهازية. أسلوبي بسيط يرد هنا لقياس نفاذية ظهارة الأمعاء. في المختبر، يتم مطلي الخلايا 2BBe كربونات الكالسيوم في الآبار زراعة الأنسجة كأحادي الطبقة والمقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال (ثالثا) يمكن أن تقاس بمقياس الظهارية (فولت/أوم). هذا الأسلوب مقنع بسبب عملية سهلة الاستعمال والتكرار. الفئران الحية، جافاجيد مع 4 كاتشين fluorescein isothiocyanate (فيتك)-يتم قياس تركيزات فيتك-ديكستران ديكستران وفي عينات مصل الدم التي تم جمعها من الفئران لتحديد نفاذية الظهارية. تزقيمية شفوي يقدم جرعة دقيقة، وذلك هو الأسلوب المفضل لقياس النفاذية المعوية في فيفو. أخذت معا، هاتين الطريقتين يمكن قياس النفاذية ظهارة الأمعاء في المختبر و في فيفو، ومن ثم استخدامها لدراسة العلاقة بين الأمراض ووظيفة الحاجز.

في الثقافة، وتنمو كأحادي الطبقة خلايا 2BBe كربونات الكالسيوم وتفرق ببطء في النضج انتيروسيتيس الاستيعابية التي لها حدود الفرشاة. في هذا البروتوكول، كانت مطلية 2BBe كربونات الخلايا ذات كثافة عالية في أغشية البولي وخلايا بلغت 100% كونفلوينسي يوم واحد بعد البذر. ومع ذلك، خلايا غ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

أسلوبي ترد هنا لتحديد وظيفة الحاجز المعوي. مقياس الظهارية (فولت/أوم) يستخدم لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال من ابيثيليا مثقف مباشرة في الآبار زراعة الأنسجة. في الفئران، يتم استخدام الأسلوب تزقيمية فيتك-ديكستران لتحديد نفاذية الأمعاء في الجسم الحي.

في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة الأمراض الناجمة عن خلل الحاجز الظهاري عن طريق قياس نفاذية الخلايا الظهارية المعوية في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال وظيفة الحاجز المعوي ، مثل تلك المتعلقة بمرض التهاب الأمعاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم نفاذية الخلايا الظهارية المعوية في كل من المختبر وفي الجسم الحي.الآثار المترتبة على هذه التقنية يمتد نحو العلاج أو تشخيص أمراض الجهاز الهضمي، وذلك لأن خلل حاجز الظهارية المعوية يساهم في تلك الأمراض. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظيفة الحاجز المعوي، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل دراسات سمية المخدرات وسلامة حاجز أنواع الخلايا الأخرى. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم بعض الخطوات.يمكن الآن فهم عملية دقيقة من هذا الأسلوب بواسطة وصف نصي. للبدء، تنمو خلايا كاكو-2bbe في قارورة T75 مع المتوسطة. تغذية القارورة بانتظام، اعتمادا على كثافة الخلية.عندما تكون الخلايا 80٪ التقاء، وإزالة المتوسطة واستخدام 1-2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة دون الكالسيوم لشطف لهم. إضافة 1.5 ملليلتر من تريبسين-EDTA، وروك بلطف القارورة. ثم، وضعه في حاضنة درجة 37 مئوية لمدة 20 دقيقة، دون هزاز.في حين أن الخلايا هي trypsinizing، مكان إدراج تحتوي على أغشية البولي كربونات المسامية في 24 لوحات جيدا. ثم إضافة 1 ملليلتر من المتوسط الثقافة في الغرفة القاعدية التي هي المساحة السفلى من الغشاء. إضافة 5 ملليلتر من المتوسطة إلى القارورة، والميصة بقوة الخلايا ضد داخل قارورة 5 إلى 10 مرات، لفصل الثقافة في الخلايا الفردية فضفاضة، أو كتل الخلايا اثنين إلى ثلاثة.لوحة 0.166 ملليلتر من الخلايا في غرفة apical الذي هو الفضاء العلوي للغشاء. ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. تغذية الخلايا ثلاث مرات أسبوعيا، وذلك باستخدام مضخة الضغط لpirate بعناية المتوسطة من المقصورة القاعدية من كل بئر.ثم بالتنقيط بلطف ملليلتر واحد من المتوسطة في غرفة apical من كل إدراج. بالنسبة لدراسات السيتوكين، قبل يوم واحد من المقاومة الكهربائية عبر سفحلية أو قياسات TER، استبدل الوسيط القاعدي بالوسط، الذي يحتوي على 10 نانوجرامات لكل ملليلتر من إنترفيرون غاما. في يوم التجربة، استبدل الوسيط بـ HBSS يحتوي على 2.5 أو 7.5 نانوغرام لكل ملليلتر من TNF.لتصحيح المقياس، أدخل قطب التصحيح في منفذ الإدخال واختر وضع أوم. ثم استخدم مفك لضبط المسمار تعديل R حتى يعرض العداد قراءة 1000 أوم. تعقيم الأقطاب الكهربائية في 70٪ الإيثانول لمدة 15 إلى 30 دقيقة والسماح لهم للهواء الجاف لمدة 15 ثانية.ثم شطف الأقطاب الكهربائية في المتوسطة ثقافة الخلايا التجريبية. بعد ذلك، قم بتشغيل الطاقة واختر وضع أوم. مع الحفاظ على الأقطاب العمودية، ضع بعناية نهايات طويلة من جسور القطب في الغرفة القاعدية، وضمان أنها تلمس الطبق.ثم ضع النهايات القصيرة في غرفة الزهاء ، وضمان بقائها تحت سطح الوسط ، ولكن فوق إدراج ثقافة الأنسجة. قياس مقاومة العينة وإدراج فارغة في 0، 1، 2، 3 و 4 ساعات بعد العلاج السيتوكين. ثم سجل المقاومة.لتحقيق الاتساق عبر مختلف صيغ لوحة، وحساب نتاج المقاومة ومنطقة غشاء فعالة كما هو مبين هنا. بالنسبة لـ 24 من الآبار، تبلغ مساحة الغشاء الفعال 0.33 سنتيمتر مربع. للحث على التهاب القولون، إضافة DSS إلى الماء autoclaved إلى تركيز النهائي من 3.5٪ الوزن لكل وحدة تخزين.ثم استخدم حل DSS لاستبدال مياه الشرب في أقفاص الذكور البالغ من العمر 8 أسابيع C57 فئران ستة سوداء لما مجموعه سبعة أيام. إعطاء مياه الشرب العادية دون DSS للسيطرة على الفئران. بعد اليوم السابع، قم بتحويل مياه DSS إلى مياه الشرب العادية.كل يوم، وزن الفئران وتقييم الدرجات السريرية على النحو المحدد وفقا لشدة المرض من قبل أربعة المعلمات: هبوط المستقيم، واتساق البراز، والنزيف، والنشاط. جمع الدرجات من هذه المعلمات لدرجة سريرية النهائي. لتحليل الحالة الهستويولوجية للأنسجة القولون سبعة أيام بعد العلاج DSS، بعد القتل الرحيم الفئران وفقا لبروتوكول النص، وعزل القولون و cecum، وقياس طول القولون.قطع 0.5 شرائح سنتيمتر من القولون القعد، وإصلاح الأنسجة في أنبوب صقر 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من 10٪ formalin بين عشية وضحاها. غسل الأنسجة الثابتة مع الإيثانول متدرج والزيلين. ثم تضمين الأنسجة في البارافين وقطع ستة مقاطع ملليمتر للهماوكسيلين وosin تلطيخ.لقياس نفاذية الحاجز الظهارية في الفئران الناجمة عن DSS ، بعد سبعة أيام من بدء إدارة DSS ، تسرع الفئران لمدة ثلاث ساعات. الأوتوكلاف إبرة غافاج لضمان العقم، ثم استخدام 150 ميكرولترات من 80 ملليغرام لكل ملليلتر أربعة كيلودالون FITC dextran في الماء المعقم لgavage الفئران، والحفاظ على dextran FITC غير المستخدمة لقياس المنحنى القياسي بعد جمع المصل. بعد ذلك، قم بوزن الفئران لحساب نفاذية.أربع ساعات في وقت لاحق، بعد تخدير الفئران عن طريق حقن IP، تأكيد التخدير السليم من عدم وجود ردود الفعل وحركة شعيرات. ثم ضع الفئران على كتلة الحرارة لمدة خمس دقائق. باستخدام زوج من مقص، مقطع قطعة سنتيمتر واحد من الذيل وجمع 100 ميكرولترات من الدم من الذيل في أنبوب جمع المصل.تدور الدم الذي تم جمعه في 10،000 مرات ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بالماء، تمييع المصل من واحد إلى أربعة. ثم، لجعل منحنى قياسي، واستخدام المياه لإعداد التخفيفات من dextran FITC غير المستخدمة.إضافة 100 ميكرولترات لكل بئر من المصل وعينات منحنى القياسية في 96 لوحات جيدا. باستخدام قارئ لوحة ، وقراءة الفلوريسنس في استثارة من 485 وانبعاث 528. حساب القيم نفاذية استناداً إلى منحنى القياسية، وضرب أربعة لتصحيح لتخفيف.تقسيم تركيز dextran في المركز حسب الوزن لتطبيع القيم. وهذا يساعد على تطبيع الفرق في تسليم dextran في المركز إذا كانت الفئران مريضة، وفقدت الوزن. تم تسمية خلايا كاكو-2bb المعروضة هنا ببقع نوى و إف أكتين لإظهار الفرق بين الخلايا غير المتمايزة والمتمايزة.ألياف الإجهاد واضحة في الخلايا غير المتمايزة. تحتوي الخلايا المتمايزة على حجم أصغر، ونوى أكبر، وألياف إجهاد أقل من الخلايا غير المتمايزة. TNF هو مركزي لفقدان الحاجز المعوي من خلال تنظيم تقاطع ضيق يعتمد على MLCK.كما رأينا في هذا الرقم، TNF يقلل بشكل كبير من TER من أحادية caco-2bbe بطريقة تعتمد على الجرعة، مما يشير إلى أن TNF يزيد من نفاذية الظهارية. بالمقارنة مع وزن الجسم الأولي، تفقد الفئران المعالجة بـ DSS كمية كبيرة من الوزن. يتم تسجيل شدة التهاب القولون عن طريق هبوط المستقيم ، واتساق البراز ، والنزيف ، والنشاط.تظهر المقاطع العرضية للأنسجة القولونية الملطخة بالهماوكسيلين واليوسين تلف الغشاء المخاطي القولوني في الفئران المعالجة DSS. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل طول سرداب القولون ، وكذلك القولون نفسه ، في الفئران المعالجة DSS. وأخيراً، هناك زيادة بمقدار الضعفين تقريباً في مستويات dextran في فيتC تلطيخ في الفئران المعالجة DSS، مقارنة بالفئران التحكم.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر تقليل الخطأ ، من خلال توحيد الإجراءات التشغيلية واستخدام الطرق الإحصائية. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال وظيفة الحاجز المعوي لاستكشاف أمراض الجهاز الهضمي في كل من الكائنات العضوية النموذجية وخطوط الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد نفاذية الظهارية المعوية من خلال قياس TER، dextran 1000، ومراقبة التغيرات المورفولوجية والهسجائية.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Glomerular Outgrowth كما مُجرا السابق Vivo لتحليل المسارات المشاركة في تنشيط الخلية الظهارية Parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

الطبقة الظهارية الأحادية المشتقة من المواد العضوية: نموذج ذو صلة سريريا في المختبر لوظيفة الحاجز المعوي

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

التجديد الظهاري المعوي استجابة للإشعاع المؤين

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

في الجسم الحي كشف نفاذية الأوعية الدموية في الغدة تحت الفك السفلي للفأر

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...