Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

Vi takker Dr. Jerrold R. Turner, fra Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, for hans generøse hjælp med at gennemføre denne undersøgelse. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation i Kina (grant nummer 81470804, 31401229 og 81200620), Natural Science Foundation i Jiangsu provinsen (grant nummer BK20180838, og BK20140319), The forskning Innovation Program for College kandidater af Jiangsu provinsen (grant nummer KYLX16-0116), avanceret forskning projekter af Soochow University (grant nummer SDY2015_06), og Crohns & Colitis Foundation Research Fellowship Award (giver nummer 310801).

Denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug protokollen af Cambridge-Suda genomisk Resource Center (CAM-SU), Soochow Universitet.
1. plating og vedligeholdelse af Caco-2bbe på porøse polycarbonat membraner
<ol><li>Vokser celler i en T75 kolbe med media (DMEM indeholder 10% FBS). Kolberne skal fodres regelmæssigt, afhængigt af den celle tæthed. Bemærk: For optimal plating, celler bør deler sig hurtigt og har en flad "stegt-æg" form, som angiver, at cellerne er i vækst...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

Der er flere kritiske trin i protokollen. CaCO-2BBe (pensel grænse-udtrykker) celler er altid anvendes til TER måling, valgt fra Caco-2 cellelinie for udtryk for pensel-grænsen proteiner. CaCO-2BBe celler har en villus lydabsorberende fænotype når fuldt differentierede (efter ca 3 ugers kultur efter sammenløbet)17. Det er nødvendigt at undgå forurening under målingen og sterilisere elektrode. Fordi proceduren, der er ikke-sterile, kan der kun udføres målinger for op til 8 h i de fleste ...

Tarm epitelceller er ikke kun ansvarlig for absorptionen af næringsstoffer, men også udgør en væsentlig hindring for forsvare mod patogene mikroorganismer og mikrobielle toksiner. Denne intestinal barriere funktion reguleres af stram vejkryds permeabilitet og epitelcelle integritet1,2,3, og dysfunktion af epitel barriere funktion er forbundet med inflammatoriske tarm disease (IBD). Perijunctional actomyosin ring (Mobilkommunikationstjenester) ligger inden for den celle, der er nært sammenhængende med de stramme kryds. Sammentrækning af Mobilkommunikationstjenester, som er reguleret af myosin lys kæde (MLC), er afgørende for reguleringen af stram vejkryds permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumornekrosefaktor (TNF) er centralt for intestinal barriere tab af upregulating tarm epitel MLC kinase (MLCK) udtryk og overtalelse occludin internalisering11,12,13.
Ioner som Na+ og Cl- kan krydse paracellular plads ved enten pore eller lækage vej14. I en "utæt" epitel afspejler ændringer i TER primært ændrede tight junction permeabilitet. TER måling er et almindeligt anvendte elektrofysiologiske tilgang til at kvantificere tight junction permeabilitet, primært til Na+ og Cl-, baseret på impedans af celle monolag. Forskellige celletyper, herunder tarm epitelceller, pulmonal epitel celler og vaskulære endotel celler, er blevet rapporteret til TER målinger. Fordelene ved denne metode er at TER målinger er ikke-invasive og kan bruges til at overvåge levende celler i realtid. Derudover er TER måleteknik nyttige for lægemiddel toksicitet undersøgelser15.
CaCO-2BBe celler er menneskelige epitelial kolorektal adenocarcinom celler med en struktur og funktion svarende til de differentierede lille tarm epitelceller: for eksempel, disse celler har microvilli og enzymer forbundet med lille tarm børste grænsen. Derfor er kulturperler Caco-2BBe encellelag udnyttet som en in vitro- model for at teste barriere funktion.
I mus er en måde at studere tarm paracellular permeabilitet ved at måle FITC-dextran evne til at krydse fra lumen i blodet. Således kan gavaging FITC-dextran direkte ind i musene og måle fluorescens i blodet vurderes intestinal permeabilitet. Følgende protokol beskriver to enkle metoder til at vurdere intestinale epitel permeabilitet både in vitro- og in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

Den intestinale barriere beskytter mod sygdomsfremkaldende mikroorganisme og mikrobielle toksin. Dens funktion er reguleret af stram vejkryds permeabilitet og epitelcelle integritet, og forstyrrelse af tarmens barriere funktion bidrager til udviklingen af gastrointestinale og systemiske sygdomme. To enkle metoder er beskrevet her til at måle permeabilitet af intestinale epitel. In vitro, Caco-2BBe celler er belagt i vævskultur brønde som en éncellelag og transepithelial elektrisk modstand (TER) kan måles ved en epitel (volt/ohm) meter. Denne metode er overbevisende på grund af sin brugervenlig betjening og repeterbarhed. In vivo mus er gavaged med 4 kDa fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran og FITC-dextran koncentrationer er målt i indsamlede serumprøver fra mus til at bestemme den epitel permeabilitet. Mundtlige sonde giver en nøjagtig dosis, og derfor er den foretrukne metode til at måle intestinal permeabilitet i vivo. Taget sammen, disse to metoder kan måle permeabilitet af den intestinale epitel in vitro og i vivo, og dermed bruges til at studere sammenhængen mellem sygdomme og barriere funktion.

I kultur, Caco-2BBe celler vokse som en éncellelag og differentiere langsomt i modne lydabsorberende enterocytes, der har pensel grænser. I denne protokol, Caco-2BBe celler var belagt med en høj tæthed på polycarbonat membraner og celler nået 100% confluency en dag efter såning. Cellerne er imidlertid udifferentierede på dette stadium: for at fuldt differentiere cellerne, medierne ændres hver 2-3 dage til 3 uger. Celler var plettet med kerner og F-actin pletter for at vise forske...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

To metoder er præsenteret her for at bestemme intestinal barriere funktion. En epitelial meter (volt/ohm) bruges til målinger af transepithelial elektrisk modstand af kulturperler epitheler direkte i vævskultur brønde. I mus bruges metoden FITC-dextran sonde til at bestemme intestinal permeabilitet i vivo.

In Vitro og In Vivo tilgange til at bestemme Intestinal epitelcelle permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Det overordnede mål med dette eksperiment er at studere de sygdomme, der forårsages af epitelbarriere dysfunktion ved at måle tarm epitelcellepermeabilitet in vitro og in vivo. Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i tarmbarriere funktion område, såsom dem, der er relateret til den inflammatoriske tarmsygdom. Den største fordel ved denne teknik er, at intestinal epitelcellepermeabilitet kan vurderes både in vitro og in vivo.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig i retning af behandling eller diagnosticering af gastrointestinale sygdomme, fordi intestinal epitelbarriere dysfunktion bidrager til disse sygdomme. Selv om denne metode kan give indsigt i tarmbarriere funktion, det kan også anvendes til andre systemer, såsom lægemiddeltoksicitet undersøgelser og barriere integritet af andre celletyper. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da nogle trin er svære at lære.En nøjagtig funktion af denne metode kan nu forstås ved tekstbeskrivelse. Til at begynde, dyrke Caco-2bbe celler i en T75 kolbe med medium. Kolben tilføds regelmæssigt, afhængigt af celletætheden.Når cellerne er 80%sammenløb, fjerne mediet og bruge 1-2 milliliter sterile PBS uden calcium til at skylle dem. Der tilsættes 1,5 milliliter Trypsin-EDTA, og kolben stenes forsigtigt. Derefter placere den i 37 grader Celsius inkubator i 20 minutter, uden rokkende.Mens cellerne er trypsinizing, placere skær, der indeholder porøse polycarbonat membraner i 24 brøndplader. Derefter tilsættes 1 milliliter kulturmedium i basalkammeret, som er membranens nederste rum. Der tilsættes 5 milliliter medium til kolben, og cellerne pipetters kraftigt mod kolbens inderste 5 til 10 gange for at adskille kulturen i løse individuelle celler eller to til tre celleklumper.Plade 0,166 milliliter af cellerne ind i det apikale kammer, som er det øverste rum af membranen. Derefter inkubere pladerne ved 37 grader Celsius i op til tre uger. Fodre cellerne tre gange ugentligt, ved hjælp af en trykpumpe til omhyggeligt at aspirere mediet fra basalrummet i hver brønd.Drypper derefter forsigtigt en milliliter medium ind i det apikale kammer i hvert skær. Ved cytokinundersøgelser erstattes basalmediet med medium, der indeholder 10 nanogram pr. milliliter interferon gamma, en dag før transepitheliel elektrisk modstand eller TER-målinger. På forsøgsdagen udskiftes mediet med HBSS indeholdende 2,5 eller 7,5 nanogram pr. milliliter TNF.For at korrigere måleren skal du sætte korrektionselektroden i indgangsporten og vælge Ohm-tilstand. Brug derefter en skruetrækker til at justere R Justeringsskruen, indtil måleren viser en aflæsning på 1.000 ohm. Steriliser elektroderne i 70% ethanol i 15 til 30 minutter og lad dem lufttørre i 15 sekunder.Skyl derefter elektroderne i eksperimentel cellekulturmedium. Tænd derefter for strømmen, og vælg Ohm-tilstand. Mens elektroderne lodret, omhyggeligt placere de lange ender af elektrodebroer i basal kammer, sikre, at de rører fadet.Placer derefter de korte ender i det apikale kammer, der sikrer, at de bliver under mediets overflade, men over vævskulturindsatserne. Prøvens og blindprøverne måles ved 0, 1, 2, 3 og 4 timer efter behandling med cytokin. Så optag modstandsbevægelsen.For at opnå konsistens på tværs af forskellige pladeformater beregnes produktet af modstanden og det effektive membranområde som vist her. For 24 brøndskær er det effektive membranområde 0,33 kvadratcentimeter. For at fremkalde colitis skal du tilføje DSS til automatisk tilladt vand til en endelig koncentration på 3,5 % vægt pr. volumen.Brug derefter DSS-opløsningen til at erstatte drikkevandet i burene hos 8 uger gamle mandlige C57 sorte seks mus i i alt syv dage. Giv almindeligt drikkevand uden DSS til at kontrollere mus. Efter dag syv, skifte DSS vand til almindeligt drikkevand.Hver dag, veje musene og vurdere de kliniske scores som defineret i henhold til sygdommens sværhedsgrad ved fire parametre: rektal prolaps, afføring konsistens, blødning, og aktivitet. Summer scorerne fra disse parametre for en endelig klinisk score. At analysere den histopatologiske tilstand af kolon væv syv dage efter DSS behandling, efter aflive mus i henhold til tekstprotokollen, isolere tyktarmen og cecum, og måle længden af tyktarmen.Skær 0,5 centimeter segmenter fra det distale kolon, og fastgør vævet i et 15 milliliter falkerør indeholdende 10 milliliter 10% formalin natten over. Det faste væv vaskes med sorteret ethanol og xylen. Derefter integrere væv i paraffin og skære seks millimeter sektioner for hæmatoxylin og eosin farvning.For at måle epitelbarrierens permeabilitet i DSS-inducerede mus, syv dage efter starten på DSS-administrationen, skal musene køre i tre timer. Autoklave en sonde nål for at sikre sterilitet, derefter bruge 150 mikroliter på 80 mg pr. milliliter fire kilodalton FITC dextran i sterilt vand til at sonde musene, og holde den ubrugte FITC dextran at måle standardkurven efter serum indsamling. Dernæst vægt musene for permeabilitetsberegningen.Fire timer senere, efter bedøvelse af mus ved IP injektion, bekræfte korrekt bedøvelse af manglen på reflekser og whisker bevægelse. Derefter placere musene på en varmeblok i fem minutter. Ved hjælp af en saks, klip en en centimeter stykke af halen og indsamle 100 mikroliter blod fra halen i et serum indsamling rør.Spin det indsamlede blod ved 10,000 gange g og stuetemperatur i ti minutter. Med vand fortyndes serummet 1-4. Derefter, at lave en standard kurve, bruge vand til at forberede fortyndinger af den ubrugte FITC dextran.Der tilsættes 100 mikroliter pr. brønd af serum og standardkurveprøverne i 96 brøndplader. Ved hjælp af en pladelæser skal du læse fluorescensen ved en excitation på 485 og en emission på 528. Beregn permeabilitetsværdierne baseret på standardkurven, og gang med fire for at korrigere for fortyndingen.Divider koncentrationen af FITC dextran med vægten for at normalisere værdierne. Dette hjælper med at normalisere forskellen i FITC dextran levering, hvis mus er syge, og har tabt sig. De Caco-2bbe celler vist her var mærket med kerner og F-actin pletter for at vise forskellen mellem udifferentierede og differentierede celler.Stressfibre ses tydeligt i udifferentierede celler. Differentierede celler har en mindre volumen, større kerner, og færre stressfibre end udifferentierede celler. TNF er centralt for tab af tarmbarrierer gennem MLCK-afhængig stram krydsregulering.Som det ses i dette tal, TNF betydeligt nedsætter TER af Caco-2bbe monolayer i en dosis-afhængig måde, tyder på, at TNF øger epitelpermeabilitet. Sammenlignet med deres oprindelige kropsvægt, mus behandlet med DSS mister en betydelig mængde vægt. Sværhedsgraden af colitis er scoret af rektal prolaps, afføring konsistens, blødning, og aktivitet.Tværsnit af colon væv plettet med hæmatoxylin og eosin viser colon slimhindeskader i DSS-behandlede mus. Desuden er længden af kolon krypt, samt tyktarmen selv, faldt i DSS-behandlede mus. Endelig er der en ca. dobbelt stigning i niveauet af FITC dextran farvning i DSS-behandlede mus, sammenlignet med kontrol mus.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at minimere fejl, ved at standardisere operationelle procedurer og udnytte statistiske metoder. Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for tarmbarriere funktion til at udforske gastrointestinale sygdomme i både model organismer og cellelinjer. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man kan bestemme intestinal epitelperabilitet ved at måle TER, såaging FITC dextran, og observere morfologiske og histokemiske ændringer.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering af ribo Bundet Gryende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; Til at identificere Translationelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse af metaboliske profil i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mus Intestinal Crypt organoide Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetiske og Biokemiske metoder til<em&gt; In vivo</em&gt; og<em&gt; In vitro</em&gt; Vurdering af Protein Oligomerisering: Den Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Glomerular udvækst som en Ex Vivo Assay at analysere veje involveret i Parietal Epitelial Cell Aktivering

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoidafledt epitelmonolag: En klinisk relevant in vitro-model til tarmbarrierefunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelregenerering som reaktion på ioniserende bestråling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In vivo Vaskulær permeabilitetsdetektion i mus submandibulær kirtel

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...