Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
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हम डॉ Jerrold आर टर्नर, ब्रिघम और महिला अस्पताल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल से, इस अध्ययन को पूरा करने में उनकी उदार मदद के लिए धंयवाद । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (अनुदान संख्या ८१४७०८०४, ३१४०१२२९, और ८१२००६२०), Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या BK20180838, और BK20140319), के लिए अनुसंधान नवाचार कार्यक्रम Jiangsu प्रांत के कॉलेज स्नातकों (अनुदान संख्या KYLX16-0116), Soochow विश्वविद्यालय के उंनत अनुसंधान परियोजनाओं (अनुदान संख्या SDY2015_06), और Crohn और कोलाइटिस फाउंडेशन रिसर्च फेलोशिप पुरस्कार (अनुदान संख्या ३१०८०१) ।

यह अध्ययन पशु देखभाल और कैंब्रिज-सूडा जीनोमिक रिसोर्स सेंटर (सांचा-सु), Soochow विश्वविद्यालय के उपयोग प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. चढ़ाना और कएको छैन-2bbe के रख-रखाव को असुरक्षित कार्बो...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । कएको छैन-2BBe (ब्रश सीमा-व्यक्त) कोशिकाओं को हमेशा के लिए उपयोग किया जाता है तेर माप, ब्रश की अभिव्यक्ति के लिए कएको छैन-2 सेल लाइन से चयनित-सीमा प्रोटीन । कएको छैन-2BBe कोश?...

आंत्र उपकला कोशिकाओं केवल पोषक तत्वों के अवशोषण के लिए जिम्मेदार नहीं हैं, लेकिन यह भी रोगजनक सूक्ष्मजीवों और माइक्रोबियल विषाक्त पदार्थों के खिलाफ की रक्षा के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा फार्म । इस आंत्र बाधा समारोह तंग जंक्शन पारगम्यता और उपकला कोशिका अखंडता द्वारा विनियमित है1,2,3, और उपकला बाधा समारोह की शिथिलता भड़काऊ आंत्र के साथ जुड़ा हुआ है रोग (आईबीडी) । perijunctional actomyosin रिंग (PAMR) उस सेल के भीतर निहित है जो तंग जंक्शनों के निकट है । PAMR के संकुचन, जो मायोसिन प्रकाश श्रृंखला (विधान परिषद) द्वारा विनियमित है, तंग जंक्शन पारगम्यता के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है4,5,6,7,8, 9,10. ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) आंत्र उपकला विधान परिषद कळेनासे (MLCK) अभिव्यक्ति और उत्प्रेरण occludin internalization11,12,13द्वारा आंत्र बाधा घटाने के लिए केंद्रीय है ।
ऐसे एनए+ और सीएल के रूप में आयनों या तो ताकना या रिसाव मार्ग14से paracellular अंतरिक्ष को पार कर सकते हैं । एक "टपका हुआ" उपकला में, तेर में परिवर्तन मुख्य रूप से बदल तंग जंक्शन पारगम्यता को प्रतिबिंबित. तेर माप एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया electrophysiological दृष्टिकोण है तंग जंक्शन पारगम्यता, मुख्य रूप से नाकरने के लिए+ और सीएल, सेल monolayers के प्रतिबाधा पर आधारित है । आंत्र उपकला कोशिकाओं, फेफड़े के उपकला कोशिकाओं, और संवहनी endothelial कोशिकाओं सहित विविध कोशिका प्रकार, तेर माप के लिए सूचित किया गया है. इस विधि के लाभ कर रहे है कि तेर माप गैर इनवेसिव रहे है और वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तेर माप तकनीक दवा विषाक्तता अध्ययन के लिए उपयोगी है15.
कएको छैन-2BBe कोशिकाओं मानव उपकला कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं के साथ एक संरचना और समारोह विभेदित छोटे आंत्र उपकला कोशिकाओं के लिए समान हैं: उदाहरण के लिए, इन कोशिकाओं microvilli और छोटे आंत्र ब्रश के साथ जुड़े एंजाइमों है बॉर्डर. इसलिए, कल्चरल कएको छैन-2BBe monolayers में एक इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है बैरियर समारोह परीक्षण के लिए.
चूहों में, आंतों paracellular पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए एक तरीका रक्त में लुमेन से पार करने के लिए FITC-dextran की क्षमता को मापने के द्वारा है । इस प्रकार, आंतों पारगम्यता gavaging FITC द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता-dextran सीधे चूहों में और रक्त के भीतर प्रतिदीप्ति को मापने. निम्नलिखित प्रोटोकॉल दोनों विट्रो में और vivo मेंआंतों उपकला पारगम्यता का आकलन करने के लिए दो सरल तरीकों का वर्णन करता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

आंतों बाधा रोगजनक सूक्ष्मजीवों और माइक्रोबियल विष के खिलाफ बचाव । अपने कार्य तंग जंक्शन पारगम्यता और उपकला कोशिका अखंडता द्वारा विनियमित है, और आंत्र बाधा समारोह के विघटन जठरांत्र और प्रणालीगत रोग की प्रगति के लिए योगदान देता है. आंतों उपकला की पारगम्यता को मापने के लिए दो सरल तरीके यहाँ वर्णित हैं. इन विट्रो में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं ऊतक संस्कृति कुओं में एक monolayer और transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तेर) के रूप में चढ़ाया जाता है एक उपकला (वाल्ट/ओम) मीटर से मापा जा सकता है । यह विधि अपने उपयोगकर्ता के अनुकूल संचालन और दोहराव की वजह से कायल है । vivo में, चूहों 4 केडीए fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran के साथ gavaged हैं, और FITC-dextran सांद्रता चूहों से एकत्र सीरम नमूनों में मापा जाता है उपकला पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए. मौखिक gavage एक सटीक खुराक प्रदान करता है, और इसलिए vivo मेंआंतों पारगम्यता को मापने के लिए पसंदीदा तरीका है. एक साथ ले लिया, इन दो तरीकों इन विट्रो और vivoमें आंतों उपकला की पारगम्यता को मापने कर सकते हैं, और इसलिए रोगों और बाधा समारोह के बीच कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा.

संस्कृति में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को एक monolayer के रूप में विकसित और धीरे परिपक्व अवशोषण enterocytes कि ब्रश सीमाओं है में अंतर । इस प्रोटोकॉल में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं को पाली कार्बोनेट झिल्ली पर एक उच?...

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In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

दो तरीके आंतों बाधा समारोह का निर्धारण करने के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं. एक उपकला मीटर (वाल्ट/ओम) सीधे टिशू कल्चर कुओं में कल्चरल epithelia के transepithelial विद्युत प्रतिरोध की माप के लिए प्रयोग किया जाता है । चूहों में, FITC-dextran gavage विधि vivo मेंआंतों पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

इन विट्रो में और Vivo में आंतों उपकला कोशिका पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

इस प्रयोग का समग्र लक्ष्य विट्रो और वीवो में आंतों के एपिथेलियल सेल पारगम्यता को मापकर एपिथेलियल बैरियर डिसफंक्शन के कारण होने वाली बीमारियों का अध्ययन करना है। यह विधि आंतों के बाधा समारोह क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जैसे कि भड़काऊ आंत्र रोग से संबंधित। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि आंतों की एपिथेलियल सेल पारमेबिलिटी का आकलन विट्रो और वीवो दोनों में किया जा सकता है।इस तकनीक के निहितार्थ चिकित्सा या गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों के निदान की ओर फैली हुई है, क्योंकि आंतों के एपिथेलियल बैरियर दोष उन बीमारियों में योगदान देता है। हालांकि यह विधि आंतों के बाधा समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि दवा विषाक्तता अध्ययन और अन्य सेल प्रकारों की बाधा अखंडता। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुछ कदम सीखना मुश्किल है।इस विधि का सटीक संचालन अब पाठ्य विवरण से समझा जा सकता है। शुरू करने के लिए, मध्यम के साथ एक T75 फ्लास्क में Caco-2bbe कोशिकाओं को विकसित करें। सेल घनत्व के आधार पर फ्लैक्स को नियमित रूप से खिलाएं।जब कोशिकाएं 80% कॉन्फ्ल्यूरेंट हों, तो मीडियम को हटा दें और उन्हें कुल्ला करने के लिए कैल्शियम के बिना बाँझ पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर का उपयोग करें। ट्रिप्पसिन-ईडीटीए के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे फ्लास्क को रॉक करें। इसके बाद इसे बिना कमाल के 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।जबकि कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज किया जाता है, 24 अच्छी प्लेटों में असुरक्षित पॉली कार्बोनेट झिल्ली युक्त सम्मिलित आवेषण रखें। फिर बेसल कक्ष में संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें जो झिल्ली की निचली जगह है। फ्लास्क में मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और संस्कृति को ढीले व्यक्तिगत कोशिकाओं, या दो से तीन सेल झुरमुटों में अलग करने के लिए फ्लास्क के अंदर 5 से 10 बार के खिलाफ कोशिकाओं को सख्ती से पिपेट करें।प्लेट 0.166 कोशिकाओं की मिलीलीटर एपिकल कक्ष में जो झिल्ली का ऊपरी स्थान है। फिर तीन सप्ताह तक के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें । कोशिकाओं को साप्ताहिक रूप से तीन बार खिलाएं, एक दबाव पंप का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के बेसल डिब्बे से माध्यम को ध्यान से आकांक्षी करें।फिर धीरे-धीरे प्रत्येक डालने के एपिकल कक्ष में माध्यम के एक मिलीलीटर को ड्रिप करें। साइटोकिन अध्ययनों के लिए, ट्रांसेपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध या टीईआर माप से एक दिन पहले, बेसल माध्यम को मध्यम से प्रति मिलीलीटर इंटरफेरॉन गामा के 10 नैनोग्राम युक्त बदल देते हैं। प्रयोग के दिन, टीएनएफ के मिलीलीटर प्रति 2.5 या 7.5 नैनोग्राम वाले एचबीएसएस के साथ माध्यम को प्रति मिलाकर बदलें।मीटर को सही करने के लिए, इनपुट पोर्ट में सुधार इलेक्ट्रोड डालें और ओम मोड चुनें। फिर आर समायोजन पेंच को समायोजित करने के लिए एक पेचकश का उपयोग करें जब तक मीटर 1, 000 ओम की रीडिंग प्रदर्शित नहीं करता है। इलेक्ट्रोड को 15 से 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में स्टरलाइज करें और उन्हें 15 सेकंड के लिए सूखने दें।इसके बाद प्रायोगिक कोशिका संस्कृति माध्यम में इलेक्ट्रोड कुल्ला करें। इसके बाद, शक्ति चालू करें और ओम मोड चुनें। इलेक्ट्रोड को ऊर्ध्वाधर रखते समय, इलेक्ट्रोड पुलों के लंबे सिरों को बेसल कक्ष में सावधानी से रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे पकवान को छूते हैं।फिर छोटे सिरों को एपिकल कक्ष में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे माध्यम की सतह से नीचे रहें, लेकिन ऊतक संस्कृति आवेषण से ऊपर रहें। साइटोकिन उपचार के बाद 0, 1, 2, 3 और 4 घंटे में नमूने और खाली आवेषण के प्रतिरोध को मापें। फिर प्रतिरोध रिकॉर्ड करें।विभिन्न प्लेट प्रारूपों में स्थिरता प्राप्त करने के लिए, प्रतिरोध के उत्पाद और प्रभावी झिल्ली क्षेत्र की गणना करें जैसा कि यहां दिखाया गया है। 24 अच्छी तरह से आवेषण के लिए, प्रभावी झिल्ली क्षेत्र 0.33 वर्ग सेंटीमीटर है। कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए, प्रति मात्रा 3.5% वजन की अंतिम एकाग्रता के लिए स्वचालित पानी में डीएसएस जोड़ें।फिर डीएसएस समाधान का उपयोग करने के लिए 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57 काले छह चूहों के पिंजरों में पीने के पानी की जगह कुल सात दिनों के लिए । चूहों को नियंत्रित करने के लिए डीएसएस के बिना नियमित पेयजल दें। सात दिन के बाद, डीएसएस पानी को नियमित पेयजल में बदल दें।प्रत्येक दिन, चूहों का वजन करें और चार मापदंडों द्वारा रोग की गंभीरता के अनुसार परिभाषित नैदानिक स्कोर का आकलन करें: गुदा प्रोलैप्स, मल स्थिरता, रक्तस्राव और गतिविधि। अंतिम नैदानिक स्कोर के लिए इन मापदंडों से स्कोर का योग करें। कोलन ऊतकों की हिस्टोपैथोलॉजिकल स्थिति का विश्लेषण करने के लिए सात दिन DSS उपचार के बाद, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को इच्छामृत्यु के बाद, पेट और सीकम को अलग करें, और पेट की लंबाई को मापें।डिस्टल कोलन से 0.5 सेंटीमीटर सेगमेंट काटें, और ऊतक को 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में ठीक करें जिसमें रात भर 10% फॉर्मेलइन के 10 मिलीलीटर होते हैं। ग्रेडेड इथेनॉल और जाइलीन के साथ तय ऊतकों को धोएं। फिर पैरफिन में ऊतकों को एम्बेड करें और हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग के लिए छह मिलीमीटर सेक्शन काटें।डीएसएस-प्रेरित चूहों में एपिथेलियल बैरियर पारमशीलता को मापने के लिए, डीएसएस प्रशासन की शुरुआत के सात दिन बाद, चूहों को तीन घंटे तक उपवास करें। बंध्यता सुनिश्चित करने के लिए एक गैवर सुई को ऑटोक्लेव करें, फिर चूहों को ग्रैव करने के लिए बाँझ पानी में 80 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर चार किलोडलटन फिटसी डेक्सट्रान के 150 माइक्रोलीटर का उपयोग करें, और सीरम संग्रह के बाद मानक वक्र को मापने के लिए अप्रयुक्त फिटसी डेक्सट्रान रखें। इसके बाद, पारमी गणना के लिए चूहों का वजन करें।चार घंटे बाद, आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करने के बाद, सजगता और मूंछ आंदोलन की कमी से उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। फिर चूहों को पांच मिनट के लिए हीट ब्लॉक पर रखें। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, पूंछ का एक सेंटीमीटर टुकड़ा क्लिप और एक सीरम संग्रह ट्यूब में पूंछ से रक्त के १०० माइक्रोलीटर इकट्ठा ।एकत्र किए गए रक्त को दस मिनट के लिए 10, 000 बार जी और कमरे के तापमान पर स्पिन करें। पानी के साथ सीरम को एक से चार तक पतला करें। फिर, एक मानक वक्र बनाने के लिए, अप्रयुक्त फिटसी डेक्सट्रान के कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए पानी का उपयोग करें।सीरम के प्रति कुएं 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और मानक वक्र नमूनों को 96 अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़ें। एक प्लेट रीडर का उपयोग करके, 485 की उत्तेजन और 528 के उत्सर्जन पर फ्लोरेसेंस पढ़ें। मानक वक्र के आधार पर पारमशीलता मूल्यों की गणना करें, और कमजोर पड़ने के लिए सही करने के लिए चार से गुणा करें।मूल्यों को सामान्य करने के लिए वजन से फिटसी डेक्सट्रान की एकाग्रता को विभाजित करें। यह यदि चूहों बीमार हैं, और वजन कम कर दिया है तो फिटसी डेक्सट्रान डिलीवरी में अंतर को सामान्य करने में मदद करता है। यहां दिखाए गए कैको-2bbe कोशिकाओं को अविभेदित और विभेदित कोशिकाओं के बीच अंतर दिखाने के लिए नाभिक और एफ-ऐक्टिन दाग के साथ लेबल किया गया था ।तनाव फाइबर अविभेदित कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से देखा जाता है। विभेदित कोशिकाओं में एक छोटी मात्रा, बड़ा नाभिक, और अविभेदित कोशिकाओं की तुलना में कम तनाव फाइबर होते हैं। टीएनएफ एमएलएसके-निर्भर टाइट जंक्शन विनियमन के माध्यम से आंतों के बाधा नुकसान के लिए केंद्रीय है।जैसा कि इस आंकड़े में देखा गया है, टीएनएफ खुराक-निर्भर तरीके से कैको-2बीबी मोनोलेयर के टीआर को काफी कम कर देता है, यह सुझाव देता है कि टीएनएफ एपिथेलियल पारफली बढ़ाता है। उनके प्रारंभिक शरीर के वजन की तुलना में, डीएसएस के साथ इलाज किए गए चूहों का वजन काफी कम हो जाता है। कोलाइटिस की गंभीरता गुदा प्रोलैप्स, मल स्थिरता, रक्तस्राव और गतिविधि द्वारा अर्जित की जाती है।हेमाटॉक्सीलिन और ियोसिन के साथ दाग वाले कोलोनिक ऊतकों के क्रॉस-सेक्शन डीएसएस-इलाज चूहों में कोलोनिक म्यूकोसल क्षति दिखाते हैं। इसके अलावा, कोलन तहखाने की लंबाई, साथ ही पेट, डीएसएस-इलाज चूहों में कम हो जाती है। अंत में, चूहों को नियंत्रित करने की तुलना में डीएसएस-इलाज चूहों में फिटसी डेक्सट्रान स्टेनिंग के स्तर में लगभग दो गुना वृद्धि हुई है।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, परिचालन प्रक्रियाओं को मानकीकृत करके और सांख्यिकीय तरीकों का उपयोग करके त्रुटि को कम करना याद रखना महत्वपूर्ण है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने मॉडल जीवों और सेल लाइनों दोनों में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगों का पता लगाने के लिए आंतों के बाधा समारोह के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त किया। इस वीडियो को देखने के बाद, आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि टीईआर को मापकर आंतों की एपिथेलियल पारगम्यता का निर्धारण कैसे किया जाए, फिटसी डेक्सट्रान को देखा जाए और रूपात्मक और हिस्टोकेमिकल परिवर्तन ों को देख रहे हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

MG53 मध्यस्थता सेल झिल्ली का प्रयोग मरम्मत के विज़ुअलाइज़ेशन Vivo में और इन विट्रो में सिस्टम

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

शाही सेना शोधन द्वारा chromatin अलगाव (कूजन)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribosome बाध्य नवजात polypeptides का अलगाव<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; MRNA के साथ translational रोकें ब्लॉग की पहचान के लिए

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

बाल उत्थान के दौरान तेजी से उपकला-mesenchymal संकेतन की आनुवांशिक विश्लेषण

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

में मेटाबोलिक प्रोफ़ाइल के वास्तविक समय विश्लेषण<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; माउस आंतों तहखाना Organoid संस्कृति

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

के लिए आनुवंशिक और जैव रासायनिक दृष्टिकोण<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; प्रोटीन oligomerization का आकलन: Ryanodine रिसेप्टर केस स्टडी

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

पैराइटल एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन में शामिल रास्तों का विश्लेषण करने के लिए एक पूर्व वीवो परख के रूप में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoid-व्युत्पन्न उपकला monolayer: आंत्र बाधा समारोह के लिए एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

आयनीकरण विकिरण के जवाब में आंतों के उपकला पुनर्जनन

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Vivo में माउस सबमैंडिबुलर ग्रंथि में संवहनी पारगम्यता का पता लगाना

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...