Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
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이 연구를 완료에 그의 관대 한 도움에 감사 박사 제럴드 R. 터너, Brigham와 여자의 병원, 하버드의과 대학에서에서 하 고. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81470804, 31401229, 및 81200620)의 국가 자연과학 기초는 자연 과학 재단의 장쑤 성 (보조금 번호 BK20180838, 및 BK20140319)에 의해 지원의 연구 혁신 프로그램 대학 졸업생의 장쑤 성 (보조금 번호 KYLX16-0116), 고급 연구 프로젝트의 Soochow 대학 (보조금 번호 SDY2015_06), 그리고 크 론 및 Colitis 재단 연구 펠로 십 수상 (310801 번호 부여).

이 연구는 동물 관리 및 사용 프로토콜의 캠브리지 스 게놈 자원 센터 (캠-수), Soochow 대학에 의해 승인 되었다.
1. 도금 및 Caco-2bbe에 다공성 폴 리 카보 네이트 막의 유지 보수
<ol><li>미디어 T75 플라스 크에 세포를 성장 (10% 포함 된 DMEM FBS). 플라스 크는 셀 밀도 따라 정기적으로 먹여야 한다. 참고: 최적의 도금, 셀 해야 빠르게 분할 및 세포 성장 단계에가 평면 "튀김-계란" 모...

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	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. Caco-2BBe (브러쉬 국경-표현) 셀 테 측정, 브러쉬-테두리 단백질의 표현 위한 Caco-2 셀 라인에서 선택한 항상 사용 됩니다. Caco-2BBe 세포는 모 흡수 형 때 (문화 후 합류의 약 3 주) 후 완전히 분화17. 측정, 동안 오염 방지 하 고 전극 소독이 필요 하다. 절차는 비 살 균, 측정은 최대 8 h 대부분의 경우에만 수행할 수 있습니다. 측정, 동안 우리 두...

장 상피 세포는 영양분의 흡수에 대 한 책임 뿐만 아니라 그러나 또한 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 중요 한 방 벽을 형성. 이 장의 장벽 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성1,2,3, 통제 되 고 상피 장벽 기능 부전은 염증 성 창 자 연관 질병 (IBD)입니다. Perijunctional actomyosin 반지 (PAMR)는 단단한 접속점에 밀접 하 게 인접 셀 이내에 거짓말. Myosin 빛 사슬 (MLC)에 의해 규제 됩니다, PAMR의 수축은 꽉 접합 침투성4,5,6,7,8, 규제에 대 한 중요 한 9,10. 종양 괴 사 인자 (TNF) upregulating 장 상피 MLC 니 (MLCK) 식과 유도 occludin 국제화11,,1213에 의해 장 방 벽 손실에 중앙 이다.
이온+ Na와 Cl- 기 공 또는 누출 통로14paracellular 공간을 교차 수 있습니다. "새" 상피에서 TER에 변화는 주로 변경된 꽉 접합 침투성을 반영합니다. TER 측정 꽉 접합 침투성,+ Na와 Cl-, 하 셀 monolayers의 임피던스에 따라 계량 하는 일반적으로 사용 되 electrophysiological 접근 이다. 장 상피 세포, 혈관 내 피 세포, 폐 상피 세포 등 다양 한 세포 유형 테 측정을 위해 보고 되었다. 이 방법의 이점은 TER 측정 비 침략 적 이며 실시간 라이브 셀 모니터링에 사용할 수 있습니다. 또한, 테 측정 기술은 약물 독성 연구15에 대 한 유용합니다.
Caco-2BBe 세포는 인간 상피 대 장 선 암 세포 구조와 차별화 된 작은 창 자 상피 세포와 유사한 기능: 예를 들어 이러한 세포는 microvilli 및 작은 창 자 브러시와 관련 된 효소 테두리입니다. 따라서, 교양된 Caco-2BBe monolayers 장벽 기능을 테스트 하기 위한 생체 외에서 모델 활용 됩니다.
쥐, 한 장 paracellular 침투성 공부 방법은 혈액으로 루멘에서 교차 FITC dextran 수를 측정 하 여. 따라서, 창 자 침투성 gavaging FITC dextran 직접 마우스와 혈액 내에서 형광을 측정에 의해 평가 될 수 있다. 다음 프로토콜 설명 장 상피 침투성을 평가 하기 위해 두 가지 간단한 방법 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

장 방 벽은 병원 성 미생물 및 미생물 독 소에 대 한 방어. 그것의 기능은 꽉 접합 침투성 및 상피 세포 무결성에 의해 규제 됩니다 그리고 위장과 전신 질환의 진행에 기여 하는 장의 장벽 기능 장애. 두 가지 간단한 방법 장 상피의 투과율을 측정 하 여기 설명 되어 있습니다. 생체 외에서Caco 2BBe 세포는 조직 문화 우물에는 단층으로 도금 및 transepithelial 전기 저항 (TER)는 상피 (볼트/옴) 미터에 의해 측정 될 수 있다. 이 메서드는 사용자 친화적인 작동과 반복성 때문에 설득력이 있다. Vivo에서, 마우스는 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)와 gavaged-dextran, 그리고 FITC dextran 농도 상피 침투성을 결정 하는 마우스에서 수집 된 혈 청 샘플으로 측정 된다. 구강 정확한 복용량을 제공 하 고 따라서 vivo에서창 자 침투성 측정을 선호 하는 방법 이다. 함께 찍은, 이러한 두 가지 방법을 장 상피 체 외 그리고 vivo에서의 침투성을 측정할 수 있다 하 고 따라서 질병 및 장벽 기능 사이의 연결을 공부 하는 데 사용 될.

문화, Caco 2BBe 세포를 단층으로 성장 하 고 천천히 테두리 브러시를가지고 성숙한 흡수 성 enterocytes로 분화. 이 프로토콜에서 Caco 2BBe 셀 폴 리 카보 네이트 막에 높은 밀도와 도금 했다 하 고 셀에 도달 100 %confluency 시드 후에 1 일. 그러나 세포는 차별화 된이 단계에서: 완전히 셀 구분, 미디어 3 주 동안 2-3 일 마다 변경 됩니다. 세포 핵으로 물 했다 고 F 걸 미 분화 및 분화 세...

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In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

두 가지 방법은 여기 장 장벽 기능을 결정 하 되 게 됩니다. 상피 미터 (볼트/옴)의 조직 문화 우물에서 직접 경작된 epithelia의 transepithelial 전기 저항 측정에 사용 됩니다. 쥐, FITC dextran gavage 메서드는 vivo에서창 자 침투성 결정 하 사용 됩니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

이 실험의 전반적인 목표는 시험관 내 및 생체 내장 상피 세포 투과성을 측정하여 상피 장벽 기능 장애로 인한 질병을 연구하는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환과 관련된 장 장벽 기능 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장 상피 세포 투과성을 시험관 내 및 생체 내 모두 평가할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 위장 질환의 치료 또는 진단으로 확장, 장 상피 장벽 기능 장애는 그 질병에 기여하기 때문에. 이 방법은 장 장벽 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 약물 독성 연구 및 다른 세포 유형의 장벽 무결성과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 일부 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 메서드의 시각적 데모는 매우 중요합니다.이제 텍스트 설명으로 이 메서드의 정확한 작업을 이해할 수 있습니다. 시작하려면, 배지와 T75 플라스크에서 Caco-2bbe 세포를 성장. 세포 밀도에 따라 플라스크를 정기적으로 공급합니다.세포가 80%의 컨실루물일 때, 매체를 제거하고 칼슘 없이 멸균 PBS의 1-2 밀리리터를 사용하여 헹구는 다. 트립신-EDTA의 1.5 밀리리터를 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 주세요. 그런 다음, 흔들지 않고 20 분 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 놓습니다.세포가 트립시닝하는 동안 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 포함하는 인서트를 24 개의 웰 플레이트에 배치하십시오. 그런 다음 멤브레인의 낮은 공간인 기저 챔버에 배양 배지 1 밀리리터를 넣습니다. 플라스크에 배지 5밀리리터를 추가하고, 플라스크 내부에 대해 세포를 5~10회 적극적으로 피펫하여 배양을 느슨한 개별 세포 또는 2~3개의 세포 덩어리로 분리합니다.플레이트 0.166 밀리리터는 멤브레인의 상부 공간인 정액 챔버로 세포의 밀리리터를 입력한다. 그런 다음 최대 3 주 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 압력 펌프를 사용하여 각 우물의 기저 구획에서 배지를 조심스럽게 흡인시켜 세포를 일주일에 세 번 공급합니다.그런 다음 배지 1 밀리리터를 각 삽입의 정량 챔버에 부드럽게 떨어 뜨립니다. 사이토카인 연구의 경우, 환피성 전기 저항 또는 TER 측정 하루 전에, 인터페론 감마의 밀리리터 당 10 나노그램을 포함하는 배지로 기저 매체를 대체합니다. 실험 당일, TNF의 밀리리터당 2.5 또는 7.5 나노그램을 함유한 HBSS로 배지를 교체한다.미터를 수정하려면 보정 전극을 입력 포트에 삽입하고 Ohm 모드를 선택합니다. 그런 다음 드라이버드라이버를 사용하여 미터가 1, 000 ohms의 판독값을 표시할 때까지 R 조정 나사를 조정합니다. 전극을 70%에 15~30분 동안 살균하고 15초 동안 공기 건조를 허용합니다.그런 다음 실험 세포 배양 배지에서 전극을 헹구는 다. 다음으로 전원을 켜고 옴 모드를 선택합니다. 전극을 수직으로 유지하면서 전극 교량의 긴 끝을 기저 챔버에 조심스럽게 배치하여 접시에 닿을 수 있도록 합니다.그런 다음 짧은 끝을 정문 챔버에 배치하여 매체의 표면 아래에 머무르지만 조직 배양 삽입 위에 유지되도록 합니다. 시토카인 치료 후 0, 1, 2, 3 및 4시간 시료 및 빈 인서트의 내성을 측정합니다. 그런 다음 저항을 기록합니다.다양한 플레이트 형식에 걸쳐 일관성을 얻으려면 여기에 표시된 바와 같이 저항 및 유효 멤브레인 영역의 생성물을 계산합니다. 24개의 웰 인서츠의 경우 유효 멤브레인 영역은 0.33 평방 센티미터입니다. 대장염을 유도하기 위해, 부피당 3.5%의 중량의 최종 농도에 자동으로 된 물에 DSS를 추가합니다.그런 다음 DSS 용액을 사용하여 8주된 남성 C57 블랙 6마우스의 케이지내식수를 총 7일 동안 교체한다. 쥐를 제어하기 위해 DSS없이 일반 식수를 제공합니다. 7일 후, DSS 물을 일반 식수로 전환합니다.매일, 마우스를 계량하고 4개의 매개변수에 의해 질병 엄격에 따라 정의된 임상 점수를 평가합니다: 직장 탈출, 대변 일관성, 출혈 및 활동. 최종 임상 점수에 대한 이러한 매개 변수에서 점수를 합산합니다. 결장 조직의 조직 병리학 적 상태를 분석하기 위해 7 일 후 DSS 치료 후, 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 한 후, 결장과 cecum을 분리하고 결장의 길이를 측정한다.탈경 결장에서 0.5 센티미터 세그먼트를 잘라 내고 하룻밤 사이에 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 팔콘 튜브에서 조직을 수정합니다. 등급에 따라 고정 된 조직을 에탄올과 자일렌으로 씻으시다. 그런 다음 파라핀에 조직을 포함하고 헤마톡시린과 에신 염색을위한 6 밀리미터 섹션을 잘라.DSS 유도 마우스에서 상피 장벽 투과성을 측정하기 위해, DSS 투여 시작 후 7일 후, 마우스를 3시간 동안 빠르게 한다. 독클을 사용하여 살균을 보장하기 위해 gavage 바늘을 오토클레이브한 다음, 밀리리터 당 80 밀리그램의 150 마이크로리터를 멸균 물에 4킬로달톤 FITC 도비텐을 사용하여 생쥐를 휘저고 사용하지 않은 FITC dextran을 유지하여 세럼 수집 후 표준 곡선을 측정합니다. 다음으로, 투과성 계산을 위해 마우스의 가중치를 가린다.4시간 후, IP 주입에 의한 마우스를 마취한 후 반사 신경 및 수염 운동의 부족에 의해 적절한 마취를 확인한다. 그런 다음 마우스를 열 블록에 5 분 동안 놓습니다. 한 쌍의 가위를 사용하여 꼬리의 1센티미터 조각을 클립하고 꼬리에서 100 마이크로리터의 혈액을 세럼 수집 튜브로 수집합니다.수집된 혈액을 10, 000배, 실온에서 10분 간 회전시합니다. 물로 혈청을 1~4개 희석시 희석시다. 그런 다음, 표준 곡선을 만들기 위해, 사용하지 않은 FITC dextran의 희석을 준비하기 위해 물을 사용합니다.세럼의 웰당 100 마이크로리터를 추가하고 표준 곡선 샘플을 96 개의 웰 플레이트에 넣습니다. 플레이트 판독기를 사용하여 485의 흥분과 528의 방출에서 형광을 읽으십시오. 표준 곡선을 기반으로 투과성 값을 계산하고 4로 곱하여 희석을 수정합니다.FITC dextran의 농도를 가중치로 나누어 값을 정규화합니다. 이것은 마우스가 아프고 체중이 감소한 경우 FITC dextran 전달의 차이를 정상화하는 데 도움이됩니다. 여기에 표시된 Caco-2bbe 세포는 미분화 세포와 분화 된 세포의 차이를 보여주기 위해 핵과 F-액틴 얼룩으로 표지되었습니다.스트레스 섬유는 미분화 된 세포에서 명확하게 볼 수 있습니다. 분화 된 세포는 미분화 세포보다 더 작은 부피, 더 큰 핵 및 적은 스트레스 섬유를 갖는다. TNF는 MLCK 의존적인 단단한 접합 규정을 통해 장 장벽 손실의 중심입니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, TNF는 용량 의존적인 방식으로 Caco-2bbe 단층의 TER를 현저히 감소시키고, TNF가 상피 투과성을 증가시킨다는 것을 시사합니다. 초기 체중에 비해 DSS로 치료된 마우스는 상당한 양의 체중을 잃습니다. 대장염의 중증도는 직장 탈출, 대변 일관성, 출혈 및 활동에 의해 점수가 매겨집니다.헤마톡실린과 에오신으로 얼룩진 대장 조직의 단면은 DSS 처리된 마우스에 있는 결장 점막 손상을 보여줍니다. 또한, 결장 토굴의 길이뿐만 아니라 결장 자체, DSS 처리 마우스에서 감소된다. 마지막으로, 대조군 마우스에 비해 DSS 처리 마우스에서 FITC dextran 염색의 수준에 약 2 배 증가가 있다.이 절차를 시도하는 동안 운영 절차를 표준화하고 통계 방법을 활용하여 오류를 최소화하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 모델 유기체와 세포주 모두에서 위장 질환을 탐구하는 장 장벽 기능 분야의 연구자에 대한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 TER를 측정하고 FITC dextran을 측정하고 형태학적 및 조직화학적 변화를 관찰하여 장 상피 투과성을 결정하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

연구

생물학

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

대사 프로파일의 실시간 분석<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...