Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

Vi takker Dr. Jerrold R. Turner, fra Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, for hans sjenerøs hjelp i å fullføre denne studien. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina (bevilgning nummer 81470804, 31401229 og 81200620), Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (bevilgning nummer BK20180838 og BK20140319), The forskningsprogram innovasjon for College nyutdannede i Jiangsu provinsen (bevilgning nummer KYLX16-0116), avansert forskning prosjekter av Soochow University (bevilgning nummer SDY2015_06), Crohns og kolitt Foundation forskning Fellowship Award (gi nummer 310801).

Denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk protokollen av Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow universitet.
1. plating og vedlikehold av Caco-2bbe på porøse polykarbonat membraner
<ol><li>Vokse celler i en MT75 bolle med media (DMEM inneholder 10% FBS). Kolber skal fôres regelmessig, avhengig av den celle tettheten. Merk: For optimal plating, bør celler deler seg raskt og flat "stekt egg" form, som angir at cellene er i vekstfase.</li>
	<li>Når cellene er 8...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

Det er flere viktige skritt i protokollen. Caco-2BBe (pensel grensen-uttrykke) celler brukes alltid for TER måling, valgt fra Caco-2 cellen linje for uttrykk for brush-grensen proteiner. Caco-2BBe celler har en villus absorberende fenotypen når fullt differensiert (etter ca 3 uker kultur etter samløpet)17. Er det nødvendig å unngå forurensning under målingen, og å sterilisere elektroden. Prosedyren er ikke-steril, kan målinger bare utføres for opptil 8 timer i de fleste tilfeller. Under ...

Intestinal epitelceller er ikke bare ansvarlig for absorpsjon av næringsstoffer, men også danne en viktig barriere for å forsvare seg mot sykdomsfremkallende mikroorganismer og mikrobiell giftstoffer. Intestinal barriere funksjonen er regulert av tett krysset permeabilitet og epithelial celle integritet1,2,3, og dysfunksjon av funksjonen epithelial barriere er forbundet med inflammatorisk tarm sykdom (IBD). Perijunctional actomyosin ringen (PAMR) ligger i cellen som er tett siden de trange knutepunktene. Sammentrekning av PAMR, som reguleres av myosin lys kjeden (MLC), er avgjørende for regulering av tett krysset permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumor nekrose faktor (TNF) er sentralt for intestinal barriere tap upregulating intestinal epithelial MLC kinase (MLCK) uttrykk og inducing occludin internalisering11,12,13.
Ioner som Na+ og Cl- kan krysse paracellular plassen med enten pore eller lekkasje veien14. I en "lekk" epitel gjenspeiler endringer i TER primært endret tett krysset permeabilitet. TER måling er en brukte elektrofysiologiske tilnærming å kvantifisere tett krysset permeabilitet, primært til Na+ og Cl-, basert på impedans på celle monolayers. Ulike celletyper, inkludert intestinal epitelceller, lunge epitelceller og vaskulær endotelceller, er rapportert for TER målinger. Fordelene med denne metoden er at TER målinger er ikke-invasiv og kan brukes til å overvåke lever celler i sanntid. I tillegg er TER måleverdien teknikken nyttig for narkotika toksisitet studier15.
Caco-2BBe celler er menneskelig epithelial colorectal adenocarcinoma celler med struktur og funksjon som ligner på differensiert liten intestinal epitelceller: disse cellene har for eksempel microvilli og enzymer assosiert med liten intestinal børste grensen. Derfor benyttes kulturperler Caco-2BBe monolayers som en i vitro modell for testing barriere-funksjonen.
I mus er en måte å studere intestinal paracellular permeabilitet ved å måle evne til FITC-dekstran å krysse fra lumen i blodet. Dermed kan intestinal permeabilitet vurderes av gavaging FITC-dekstran direkte til mus og måle fluorescens i blodet. Følgende protokollen beskriver to enkle metoder for å vurdere intestinal epitel permeabilitet både i vitro og i vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

Intestinal barriere beskytter mot sykdomsfremkallende microorganism og mikrobiell gift. Dens funksjon er regulert av tett krysset permeabilitet og epithelial celle integritet og forstyrrelse av funksjonen intestinal barriere bidrar til utviklingen av mage og systemisk sykdom. To enkle metoder er beskrevet her for å måle permeabilitet av intestinal epitel. In vitro, Caco-2BBe celler er belagt i vev kultur brønner som en monolayer og transepithelial motstand (TER) kan måles ved en epiteliale (volt/ohm) meter. Denne metoden er overbevisende grunn av sin bruker-vennlig operasjon og repeterbarhet. I vivo, mus er gavaged med 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran og FITC-dekstran-konsentrasjoner er målt i samlet serumprøver fra mus til å bestemme epithelial permeabilitet. Muntlige gavage gir en nøyaktig dose, og derfor er den foretrukne metoden å måle intestinal permeabilitet i vivo. Sammen disse to metodene kan måle permeabilitet av intestinal epitel i vitro og i vivo, og derfor brukes til å studere sammenhengen mellom sykdommer og barriere-funksjonen.

I kultur, Caco-2BBe cellene vokse som en monolayer og skille sakte ut modne absorberende enterocytes som pensel kantlinjer. I denne protokollen, Caco-2BBe celler var belagt med en høy tetthet på polykarbonat membraner og celler nådd 100% confluency en dag etter seeding. Men celler er udifferensierte på dette stadiet: Å fullt skille cellene, media endres hver 2-3 dager til 3 uker. Celler var farget med kjerner og F-utgangen flekker for å vise forskjellene mellom udifferensierte og di...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

To metoder presenteres her for å finne intestinal barriere-funksjonen. En epithelial meter (volt/ohm) brukes for målinger av transepithelial motstand av kultivert epithelia direkte i vev kultur brønner. I mus brukes FITC-dekstran gavage metoden til å bestemme intestinal permeabilitet i vivo.

In Vitro og i Vivo tilnærminger til å bestemme Intestinal tarmepitelet permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Det overordnede målet med dette eksperimentet er å studere sykdommene forårsaket av epitelbarrieredysfunksjon ved å måle tarmepitelcellens permeabilitet in vitro og in vivo. Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i tarmbarrierefunksjonsfeltet, for eksempel de som er relatert til den inflammatoriske tarmsykdommen. Den største fordelen med denne teknikken er at intestinal epitelcellepermeabilitet kan vurderes både in vitro og in vivo.Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot terapi eller diagnose av gastrointestinale sykdommer, fordi intestinal epitelbarrieredysfunksjon bidrar til disse sykdommene. Selv om denne metoden kan gi innsikt i tarmbarrierefunksjonen, kan den også brukes på andre systemer, for eksempel legemiddeltoksisitetsstudier og barriereintegritet av andre celletyper. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, da noen trinn er vanskelige å lære.En nøyaktig drift av denne metoden kan nå forstås av tekstbeskrivelse. Til å begynne med, vokse Caco-2bbe celler i en T75 kolbe med medium. Mat kollene regelmessig, avhengig av celletettheten.Når cellene er 80% samløpet, fjern mediet og bruk 1-2 milliliter steril PBS uten kalsium for å skylle dem. Tilsett 1,5 milliliter Trypsin-EDTA, og klipp forsiktig kolben. Deretter plasserer du den i 37 grader Celsius inkubator i 20 minutter, uten gynge.Mens cellene prøver å hjelpe, plasser innsatser som inneholder porøse polykarbonatmembraner i 24 brønnplater. Tilsett deretter 1 milliliter kulturmedium i basalkammeret som er det nedre rommet i membranen. Tilsett 5 milliliter medium til kolben, og rør cellene kraftig mot innsiden av kolben 5 til 10 ganger, for å skille kulturen i løse individuelle celler, eller to til tre celleklumper.Plate 0,166 milliliter av cellene inn i det apikale kammeret som er det øvre rommet av membranen. Deretter inkubere platene ved 37 grader Celsius i opptil tre uker. Mat cellene tre ganger i uken, ved hjelp av en trykkpumpe for å forsiktig aspirere mediet fra basalrommet i hver brønn.Drypp deretter forsiktig en milliliter medium inn i det apikale kammeret for hver innsats. For cytokinstudier, en dag før transepithelial elektrisk motstand eller TER-målinger, erstatter du basalmediet med medium, som inneholder 10 nanogram per milliliter interferon gamma. På dagen for eksperimentet erstatter du mediet med HBSS som inneholder 2,5 eller 7,5 nanogram per milliliter TNF.For å rette måleren, sett korreksjonselektroden inn i inngangsporten og velg Ohm-modus. Bruk deretter en skrutrekker til å justere R-justeringsskruen til måleren viser en avlesning på 1000 ohm. Steriliser elektrodene i 70% etanol i 15 til 30 minutter og la dem lufttørke i 15 sekunder.Skyll deretter elektrodene i eksperimentelt cellekulturmedium. Deretter slår du på strømmen og velger Ohm-modus. Mens du holder elektrodene vertikale, plasser forsiktig de lange endene av elektrodebroer i basalkammeret, slik at de berører parabolen.Plasser deretter de korte endene i det apikale kammeret, slik at de holder seg under overflaten av mediet, men over vevskulturen setter inn. Mål motstanden til prøven og tomme innsatser ved 0, 1, 2, 3 og 4 timer etter cytokinbehandling. Deretter registrerer du motstanden.For å oppnå konsistens på tvers av forskjellige plateformater, beregn produktet av motstanden og det effektive membranområdet som vist her. For 24 brønninnlegg er det effektive membranområdet 0, 33 kvadratcentimeter. For å indusere kolitt, tilsett DSS til autoklavet vann til en endelig konsentrasjon på 3,5% vekt per volum.Bruk deretter DSS-løsningen til å erstatte drikkevannet i burene til 8 uker gamle hann C57 svarte seks mus i totalt syv dager. Gi vanlig drikkevann uten DSS for å kontrollere mus. Etter dag sju bytter du DSS-vannet til vanlig drikkevann.Hver dag, veie musene og vurdere kliniske score som definert i henhold til sykdommen alvorlighetsgrad av fire parametere:rektal prolaps, avføring konsistens, blødning, og aktivitet. Sum score fra disse parametrene for en endelig klinisk score. For å analysere den histopatologiske tilstanden til kolonvev syv dager etter DSS-behandling, etter eutanisering av mus i henhold til tekstprotokollen, isolere tykktarmen og cecum, og måle lengden på tykktarmen.Klipp 0,5 centimeter segmenter fra det distale tykktarmen, og fest vevet i et 15 milliliter falkerør som inneholder 10 milliliter 10% formalin over natten. Vask det faste vevet med gradert etanol og xylen. Deretter legger vevet i parafin og kutter seks millimeter seksjoner for hematoksylin og eosinfarging.For å måle epitelbarrierepermeabilitet hos DSS-induserte mus, syv dager etter starten av DSS-administrasjon, må musene raskt i tre timer. Autoklav en gavage nål for å sikre sterilitet, deretter bruke 150 mikroliter på 80 milligram per milliliter fire kilodalton FITC dextran i sterilt vann for å gavage musene, og holde ubrukte FITC dextran å måle standard kurve etter serum samling. Deretter vekt musene for permeabilitet beregning.Fire timer senere, etter å ha bedøvet musene ved IP-injeksjon, bekrefter riktig bedøvelse av mangel på reflekser og whisker bevegelse. Plasser deretter musene på en varmeblokk i fem minutter. Bruk en saks, klipp en en centimeter del av halen og samle 100 mikroliter blod fra halen til et serumsamlingsrør.Spinn det oppsamlede blodet ved 10 000 ganger g og romtemperatur i ti minutter. Med vann fortynner du serumet en til fire. Deretter, for å lage en standard kurve, bruk vann til å forberede fortynningene av ubrukte FITC dextran.Tilsett 100 mikroliter per brønn av serumet og standard kurveprøver i 96 brønnplater. Ved hjelp av en plateleser, les fluorescensen ved en eksitasjon på 485 og et utslipp på 528. Beregn permeabilitetsverdiene basert på standardkurven, og multipliser med fire for å korrigere for fortynningen.Del konsentrasjonen av FITC dextran med vekten for å normalisere verdiene. Dette bidrar til å normalisere forskjellen i FITC dextran levering hvis mus er syke, og har gått ned i vekt. Caco-2bbe cellene vist her ble merket med kjerner og F-actin flekker for å vise forskjellen mellom udifferensiert og differensierte celler.Stressfibre er tydelig sett i udifferensierte celler. Differensierte celler har et mindre volum, større kjerner og færre stressfibre enn udifferensierte celler. TNF er sentral for tap av tarmbarrieren gjennom MLCK-avhengig tett veikryssregulering.Som vist i dette tallet, TNF reduserer TER av Caco-2bbe monolayer på en doseavhengig måte, noe som tyder på at TNF øker epitelpermeabilitet. Sammenlignet med deres opprinnelige kroppsvekt, mister mus behandlet med DSS en betydelig mengde vekt. Alvorlighetsgraden av kolitt scores av rektal prolaps, avføringkonsistens, blødning og aktivitet.Tverrsnitt av kolonvev farget med hematoksylin og eosin viser kolonslimhinneskade hos DSS-behandlede mus. I tillegg reduseres lengden på kolonkrypten, så vel som selve tykktarmen, i DSS-behandlede mus. Til slutt er det en omtrent to ganger økning i nivåene av FITC dextran farging i DSS-behandlede mus, sammenlignet med kontrollmus.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å minimere feil, ved å standardisere operasjonelle prosedyrer og bruke statistiske metoder. Etter utviklingen banet denne teknikken veien til forskere innen tarmbarrierefunksjon for å utforske gastrointestinale sykdommer i både modellorganismer og cellelinjer. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du fastslår intestinal epitelpermeabilitet ved å måle TER, gavaging FITC dextran, og observere morfologiske og histokjemiske endringer.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse av metabolsk profil i<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Tarm Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetiske og biokjemiske tilnærminger for<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; In Vitro</em&gt; Vurdering av Protein Oligomerisering: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Glomerulær utvekst som en Ex Vivo-analyse for å analysere veier involvert i parietal epitelcelleaktivering

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoid-avledet epitelmonolayer: En klinisk relevant in vitro-modell for tarmbarrierefunksjon

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelial regenerering som respons på ioniserende bestråling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vaskulær permeabilitetsdeteksjon i mus submandibulær kjertel

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...