Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

Мы благодарим д-р Тернер Джерролд р., от Бригама и женской больнице, Гарвардской медицинской школы, за его щедрую помощь в завершении этого исследования. Эта работа поддерживается Национальный фонд естественных наук Китая (номер гранта, 81470804, 31401229 и 81200620), естественные науки фонд провинции Цзянсу (номер гранта BK20180838 и BK20140319), программа исследований инноваций для Выпускники колледжа провинции Цзянсу (номер KYLX16-0116 Грант), передовых исследовательских проектов Soochow университета (Грант № SDY2015_06) и крона и колит Стипендия фонда научных исследований (Грант номер 310801).

Это исследование было одобрено животное уход и использование протокола из Кембриджа-Suda геномной ресурсный центр (CAM-Су), Soochow университета.
1. обшивка и поддержание Како 2bbe на пористых поликарбоната мембраны
<ol><li>Рост клеток в колбе T75 с СМИ (DMEM, содержащие 10% FBS). Фляги должн...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

Есть несколько важных шагов в протоколе. Како 2BBe (кисть границы выражая) клетки всегда используются для измерения тер, от линии клеток Caco-2 для выражения кисти границы белков. Како 2BBe клетки имеют ворсинок освоения фенотип когда полностью дифференцированной (примерно через 3 недели посл?...

Кишечные эпителиальные клетки отвечают не только за поглощение питательных веществ, но также образуют важный барьер для защиты от патогенных микроорганизмов и токсинов, микроорганизмов. Эта функция кишечный барьер регулируется жесткой перехода проницаемость и эпителиальных клеток целостности1,2,3, и дисфункции эпителиальных барьерной функции ассоциируется с воспалительных кишечника болезнь (IBD). Кольцо actomyosin perijunctional (PAMR) лежит в пределах ячейки, тесно примыкать плотные соединения. Сокращение PAMR, который регулируется лёгкие цепи миозина (док), имеет решающее значение для регулирования туго Джанкшен проницаемость4,5,6,,78, 9,10. Фактор некроза опухоли (ФНО) является центральным элементом кишечный барьер потери по upregulating кишечного эпителия док киназы (MLCK) выражение и вызывая occludin интернализации11,,12-13.
Ионы Na+ и Cl– могут пересекать пространство параклеточный поры или утечки путь14. В «Дырявый» эпителия изменения в Тер главным образом отражают изменены туго Джанкшен проницаемости. Измерение тер представляет собой часто используемые электрофизиологических подход к количественно туго Джанкшен проницаемость, главным образом в+ Na и Cl-, основанный на сопротивление клетки монослои. Типов различных клеток, включая клетки кишечного эпителия, легочной эпителиальных клеток и сосудов эндотелиальных клеток, были зарегистрированы для измерения тер. Преимущества этого метода, что Тер измерения неинвазивные и может быть использован для мониторинга живой клетки в режиме реального времени. Кроме того метод измерения Тер полезен для исследования токсичности препарата15.
Како 2BBe клетки являются клетки человека эпителия кишки аденокарциномы с структурой и функцией похож на дифференцированной малого кишечника эпителиальных клеток: к примеру, эти клетки имеют микроворсинки и ферментов, связанных с щеточкой кишечника границы. Таким образом искусственный монослои Како 2BBe используются как модель в пробирке для тестирования барьерную функцию.
В мышей один из способов изучить проницаемость кишечного параклеточный является путем измерения способности FITC-декстран крест из просвета в кровь. Таким образом Кишечная проницаемость может оцениваться gavaging FITC-декстран непосредственно в мышей и измерения флуоресценции в крови. Следующий протокол описывает два простых методов для оценки проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условиях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

Кишечный барьер защищает от патогенных микроорганизмов и микробного токсина. Его функция регулируется жесткой перехода проницаемость и целостности эпителиальных клеток, и нарушение функции кишечника барьер способствует прогрессирование заболевания желудочно-кишечного тракта и системные. Два простых способа описаны здесь для измерения проницаемость кишечного эпителия. В пробирке, Како 2BBe клетки покрыты в культуре ткани скважин как монослоя и transepithelial электрического сопротивления (тер) может быть измерена по счётчикам эпителиальных (ом/вольт). Этот метод является убедительным из-за его удобного операции и повторяемость. В естественных условиях, мышей gavaged с 4 кДа флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран и концентрации FITC-декстран измеряются в пробах сыворотки, собранных мышей для определения эпителиальной проницаемости. Пероральная затравка обеспечивает точную дозу и поэтому является предпочтительным методом для измерения проницаемости кишечника в естественных условиях. Взятые вместе, эти два метода могут измерять проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условияхи таким образом быть использованы для изучения связи между заболеваниями и барьерную функцию.

В культуре Како 2BBe клетки растут как монослоя и медленно дифференцироваться в зрелых освоения enterocytes, имеющих кисть границы. В этом протоколе Како 2BBe клетки были покрытие с высокой плотностью на поликарбонат мембраны, и клетки достигли 100% confluency один день после посева. ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Здесь представлены два метода для определения функции, кишечный барьер. Эпителиальный метр (ом/вольт) используется для измерения электрического сопротивления transepithelial культивировали эпителия непосредственно в скважинах культуры ткани. В мышей FITC-декстран затравки метод используется для определения кишечную проницаемость в естественных условиях.

In Vitro и In Vivo подходы для определения проницаемости кишечной эпителиальных клеток

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Общая цель этого эксперимента заключается в изучении заболеваний, вызванных эпителиальной дисфункцией барьера путем измерения кишечной эпителиальной проницаемости клеток in vitro и in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функции кишечного барьера, такие как те, которые связаны с воспалительными заболеваниями кишечника. Основным преимуществом этого метода является то, что проницаемость кишечных эпителиальных клеток может быть оценена как в пробирке, так и in vivo.Последствия этого метода распространяется на терапию или диагностику заболеваний желудочно-кишечного тракта, потому что дисфункция кишечного эпителиального барьера способствует этим заболеваниям. Хотя этот метод может обеспечить понимание функции кишечного барьера, он также может быть применен к другим системам, таким как исследования токсичности наркотиков и барьерной целостности других типов клеток. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как некоторые шаги трудно узнать.Точную работу этого метода теперь можно понять по текстовому описанию. Для начала вырастите клетки caco-2bbe в колбе T75 со средой. Кормите колбы регулярно, в зависимости от плотности клеток.Когда клетки 80% стекут, удалить средний и использовать 1-2 миллилитров стерильных PBS без кальция, чтобы промыть их. Добавьте 1,5 миллилитров трипсина-ЭДТА и аккуратно раскачивайте колбу. Затем поместите его в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 20 минут, без качания.В то время как клетки трипсинизации, место вставки, содержащие пористые поликарбонатные мембраны в 24 хорошо пластин. Затем добавьте 1 миллилитр среды культуры в базальную камеру, которая является нижним пространством мембраны. Добавьте 5 миллилитров среды в колбу и энергично пипетку клетки против внутренней стороны колбы 5-10 раз, чтобы разделить культуру на свободные отдельные клетки, или два-три клеточных сгустка.Плита 0,166 миллилитров клеток в апикал-камеру, которая является верхним пространством мембраны. Затем инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию на срок до трех недель. Кормите клетки три раза в неделю, используя насос давления, чтобы тщательно аспирировать среду из базального отсека каждой хорошо.Затем аккуратно капать один миллилитр среды в апикал-камеру каждой вставки. Для исследований цитокинов, за день до трансепителиальной электрической устойчивости или измерения TER, заменить базальной среды со средой, содержащей 10 нанограмм на миллилитр интерферона гамма. В день эксперимента замените среду HBSS, содержащую 2,5 или 7,5 нанограмма на миллилитр TNF.Чтобы исправить счетчик, вставьте электрод коррекции в порт ввода и выберите режим Ohm. Затем используйте отвертку, чтобы настроить винт R регулировки до тех пор, пока метр отображает показания 1000 ohms. Стерилизовать электроды в 70% этанола в течение 15 до 30 минут и дать им высохнуть в течение 15 секунд.Затем промыть электроды в экспериментальной среде культуры клеток. Затем включите питание и выберите режим Ohm. Сохраняя вертикальные электроды, аккуратно поместите длинные концы электродных мостов в базальную камеру, гарантируя, что они коснутся блюда.Затем поместите короткие концы в апиалогическую камеру, гарантируя, что они остаются ниже поверхности среды, но выше вставки культуры ткани. Измерьте устойчивость образца и пустые вставки на 0, 1, 2, 3 и 4 часа после лечения цитокинов. Затем завехать сопротивление.Для достижения согласованности между различными форматами пластин, рассчитать продукт сопротивления и эффективной мембранной области, как показано здесь. Для 24 хорошо вставки, эффективная площадь мембраны составляет 0,33 квадратных сантиметров. Чтобы вызвать колит, добавьте DSS в автоклавную воду до конечной концентрации 3,5% веса на объем.Затем используйте раствор DSS для замены питьевой воды в клетках 8-недельного самца C57 черных шести мышей в общей сложности семь дней. Дайте регулярную питьевую воду без DSS для управления мышами. После седьмого дня переключит воду DSS на обычную питьевую воду.Каждый день взвешивать мышей и оценивать клинические оценки, как определено в зависимости от тяжести заболевания по четырем параметрам: ректальный пролапс, консистенция стула, кровотечение, и активность. Сумма баллов из этих параметров для окончательного клинического балла. Для анализа гистопатологического состояния тканей толстой кишки семь дней после лечения DSS, после усыплять мышей в соответствии с текстовым протоколом, изолировать толстой кишки и cecum, и измерить длину толстой кишки.Вырезать 0,5 сантиметра сегментов от дистальной толстой кишки, и исправить ткани в 15 миллилитров сокола трубки, содержащей 10 миллилитров 10%формалин ночь. Вымойте фиксированные ткани градуированным этанолом и ксиленом. Затем вставлять ткани в парафин и вырезать шесть миллиметров разделов для гематоксилина и эозина окрашивания.Для измерения проницаемости эпителиального барьера у мышей, вызванных DSS, через семь дней после начала введения DSS, быстро мышей в течение трех часов. Автоклав гаваж иглы для обеспечения стерильности, а затем использовать 150 микролитров 80 миллиграммов на миллилитр четыре килодальтона FITC dextran в стерильной воде, чтобы gavage мышей, и сохранить неиспользованные FITC декстран для измерения стандартной кривой после сбора сыворотки. Далее вес мышей для расчета проницаемости.Четыре часа спустя, после обезболивания мышей путем инъекций ИС, подтверждают правильное обезболивания из-за отсутствия рефлексов и усов движения. Затем поместите мышей на тепловой блок в течение пяти минут. Используя ножницы, зарезать один сантиметр кусок хвоста и собрать 100 микролитров крови из хвоста в трубку сбора сыворотки.Спин собранной крови при 10 000 раз г и комнатной температуре в течение десяти минут. С водой разбавить сыворотку от одного до четырех. Затем, чтобы сделать стандартную кривую, используйте воду, чтобы подготовить разбавления неиспользованных FITC dextran.Добавьте 100 микролитров на колодец сыворотки и стандартные образцы кривой в 96 пластин. Используя считыватель пластин, прочитайте флуоресценцию при возбуждении 485 и выбросе 528. Рассчитайте значения проницаемости на основе стандартной кривой и умножьте на четыре, чтобы исправить для разбавления.Разделите концентрацию FITC dextran на вес для нормализации значений. Это помогает нормализовать разницу в FITC декстран доставки, если мыши больны, и потеряли вес. Клетки како-2bbe показаны здесь были помечены ядрами и F-актин пятна, чтобы показать разницу между недифференцированными и дифференцированными клетками.Стрессовые волокна хорошо видны в недифференцированных клетках. Дифференцированные клетки имеют меньший объем, большие ядра и меньше стрессовых волокон, чем недифференцированные клетки. TNF имеет центральное значение для потери кишечного барьера через MLCK-зависимых жесткой регулировки соединения.Как видно из этой цифры, TNF значительно снижает TER монослойного caco-2bbe в зависимости от дозы образом, предполагая, что TNF увеличивает эпителиабельную проницаемость. По сравнению с их первоначальной массы тела, мышей, обработанных DSS потерять значительное количество веса. Тяжесть колита забил ректальный пролапс, стул консистенции, кровотечения, и деятельность.Поперечные сечения тканей толстой кишки, окрашенные гематоксилином и эозином, показывают повреждение слизистой оболочки толстой кишки у мышей, обработанных DSS. Кроме того, длина склепа толстой кишки, как и сама толстая кишка, снижается у обработанных DSS мышей. Наконец, есть примерно в два раза больше уровней FITC декстрана окрашивания в DSS-обработанных мышей, по сравнению с контрольных мышей.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы свести к минимуму ошибки, путем стандартизации оперативных процедур и использования статистических методов. После своего развития, этот метод проложил путь к исследователям в области функции кишечного барьера для изучения желудочно-кишечных заболеваний в обоих модельных организмов и клеточных линий. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как определить кишечной эпителиальной проницаемости путем измерения TER, gavaging FITC dextran, и наблюдения морфологических и гистохимических изменений.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Визуализация MG53-опосредованной клеточной мембраны Ремонт Использование В естественных условиях И В пробирке Системы

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Генетические и биохимические подходы к<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; In Vitro</em&gt; Оценка белка олигомеризации: The Рианодин Рецептор Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Гломерулярный рост, как Ex Vivo Assay для анализа путей, участвующих в пареталальной активации клеток

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Органоидный эпителиальный монослой: клинически значимая модель in vitro для кишечной барьерной функции

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Регенерация эпителия кишечника в ответ на ионизирующее облучение

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

В городе Виво Обнаружение сосудистой проницаемости в подчелюстной железе мыши

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...