Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
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Agradecemos al Dr. Jerrold R. Turner, del Hospital Brigham y de mujeres, escuela de medicina de Harvard, por su generosa ayuda en la realización de este estudio. Este trabajo es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número de licencia 81470804, 31401229 y 81200620), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (número BK20180838 y BK20140319), el programa de innovación de investigación para Graduados de Colegio de la provincia de Jiangsu (número de concesión KYLX16-0116), avanzado de investigación proyectos de Suchow Universidad (número SDY2015_06) y de Crohn & Colitis Fundación Premio de beca de investigación (concesión número 310801).

Este estudio fue aprobado por el cuidado Animal y uso protocolo de Cambridge-Suda genómica Resource Center (CAM-SU), Universidad de Suzhou.
1. revestimiento y mantenimiento de Caco-2bbe en las membranas de policarbonato porosas
<ol><li>Crecer las células en un frasco de T75 con medios de comunicación (DMEM con 10% FBS). Frascos deben ser alimentados con regularidad, dependiendo de la densidad celular. Nota: Para planchado óptimo, las células deben dividir rápidamente y tienen forma ...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

Hay varios pasos críticos en el protocolo. Las células Caco-2BBe (cepillo expresando de frontera) siempre se utilizan para la medición de la TER, seleccionado a partir de la línea celular Caco-2 expresión de proteínas del borde en cepillo. Las células Caco-2BBe tienen un fenotipo de la vellosidad absortiva cuando totalmente diferenciadas (aproximadamente 3 semanas después de la confluencia de cultura)17. Es necesario para evitar la contaminación durante la medición y para esterilizar el ...

Células epiteliales intestinales no sólo son responsables de la absorción de nutrientes, pero también forman una barrera importante para defenderse de los microorganismos patógenos y toxinas microbianas. Esta función de barrera intestinal está regulada por la permeabilidad de la ensambladura apretada y célula epitelial integridad1,2,3, y la disfunción de la función de barrera epitelial se asocia con inflamatoria intestinal enfermedad (EII). El anillo de actomyosin de perijunctional (PAMR) se encuentra dentro de la célula que es estrechamente contigua a las ensambladuras apretadas. La contracción de PAMR, regulado por la cadena ligera de miosina (MLC), es crucial para la regulación de la ensambladura apretada permeabilidad4,5,6,7,8, 9,10. Factor de necrosis tumoral (TNF) es central a la pérdida de la barrera intestinal por regular expresión de cinasa (MLCK) MLC epitelial intestinal e inducir occludin internalización11,12,13.
Iones tales como Na+ y Cl– puede cruzar el espacio paracelular por el poro o fuga vía14. En un epitelio "agujereado", cambios en TER reflejan principalmente la permeabilidad alterada ensambladura apretada. Medición de TER es un enfoque electrofisiológico utilizado para cuantificar la permeabilidad de la ensambladura apretada, sobre todo a Na+ y Cl-, basada en la impedancia de monocapas de células. Tipos de diversas células, incluyendo células epiteliales intestinales, las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares, se han divulgado para mediciones de TER. Ventajas de este método son que las mediciones de TER son no invasivos y pueden utilizarse para supervisar células vivas en tiempo real. Además, la técnica de medición de TER es útil para drogas toxicidad estudios15.
Las células Caco-2BBe son células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano con una estructura y función similar a las células epiteliales intestinales pequeñas diferenciadas: por ejemplo, estas células tienen microvellosidades y enzimas asociadas con pequeño cepillo intestinal frontera. Por lo tanto, monocapas de Caco-2BBe cultivadas se utilizan como modelo para las pruebas de función de la barrera en vitro .
En ratones, una forma de estudio de permeabilidad intestinal paracelular es mediante la medición de la capacidad de FITC-los dextranos para cruzar desde el lumen a la sangre. Por lo tanto, la permeabilidad intestinal puede ser evaluada por gavaging FITC-los dextranos directamente en ratones y medir la fluorescencia dentro de la sangre. El siguiente protocolo describe dos métodos simples para evaluar la permeabilidad del epitelio intestinal in vitro e in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

La barrera intestinal defiende contra microorganismos patógenos y toxinas microbianas. Su función está regulada por permeabilidad ensambladura apretada y la integridad de la célula epitelial, y alteración de la función de barrera intestinal contribuye a la progresión de la enfermedad gastrointestinal y sistémica. Aquí se describen dos métodos simples para medir la permeabilidad del epitelio intestinal. In vitro, las células Caco-2BBe se platean en los pocillos de cultivo de tejidos como una monocapa y resistencia eléctrica transepitelial (TER) puede ser medida por un medidor de epitelial (voltios/ohmios). Este método es convincente debido a su utilización y capacidad de repetición. En vivo, los ratones son gavaged con 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano y las concentraciones de FITC-los dextranos se miden en las muestras de suero recogidas en ratones para determinar la permeabilidad epitelial. Sonda oral proporciona una dosis precisa y por lo tanto es el método preferido para medir la permeabilidad intestinal en vivo. Tomados juntos, estos dos métodos pueden medir la permeabilidad del epitelio intestinal in vitro e in vivoy por lo tanto ser utilizados para estudiar la conexión entre enfermedades y función de la barrera.

En la cultura, las células Caco-2BBe crecen como una monocapa y lentamente se diferencian en enterocitos absorbentes maduras cepillo bordes. En este protocolo, las células Caco-2BBe fueron plateadas con una alta densidad en las membranas de policarbonato, y las células alcanzaron confluencia 100% un día después de la siembra. Sin embargo, las células son indiferenciadas en esta etapa: distinguir completamente las células, los medios de comunicación se cambiaron cada 2-3 días dura...

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In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

El objetivo general de este experimento es estudiar las enfermedades causadas por la disfunción de la barrera epitelial midiendo la permeabilidad de las células epiteliales intestinales in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la función de barrera intestinal, como las relacionadas con la enfermedad inflamatoria intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que la permeabilidad de las células epiteliales intestinales se puede evaluar tanto in vitro como in vivo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales, porque la disfunción de la barrera epitelial intestinal contribuye a esas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar información sobre la función de barrera intestinal, también se puede aplicar a otros sistemas, tales como estudios de toxicidad de fármacos y la integridad de la barrera de otros tipos de células. La demostración visual de este método es crítica, ya que algunos pasos son difíciles de aprender.Una operación precisa de este método ahora se puede entender por descripción textual. Para empezar, haga crecer células caco-2bbe en un matraz T75 con medio. Alimentar los matraces regularmente, dependiendo de la densidad celular.Cuando las células sean 80%confluentes, retire el medio y utilice 1-2 mililitros de PBS estéril sin calcio para enjuagarlas. Añadir 1,5 mililitros de Trypsin-EDTA, y balancear suavemente el matraz. A continuación, colóquelo en la incubadora de 37 grados Celsius durante 20 minutos, sin balancearse.Mientras que las células son tripsinas, coloque inserciones que contengan membranas de policarbonato porosa en 24 placas de pozo. A continuación, añadir 1 mililitro de medio de cultivo en la cámara basal que es el espacio inferior de la membrana. Añadir 5 mililitros de medio al matraz, y pipetear vigorosamente las células contra el interior del matraz de 5 a 10 veces, para separar el cultivo en células individuales sueltas, o dos o tres grumos celulares.Placa 0.166 mililitros de las células en la cámara apical que es el espacio superior de la membrana. Luego incubar las placas a 37 grados centígrados durante un máximo de tres semanas. Alimentar las células tres veces por semana, mediante el uso de una bomba de presión para aspirar cuidadosamente el medio desde el compartimiento basal de cada pozo.A continuación, gotee suavemente un mililitro de medio en la cámara apical de cada plaquita. Para estudios de citoquinas, un día antes de la resistencia eléctrica transepitelial o mediciones TER, reemplace el medio basal por medio, que contiene 10 nanogramos por mililitro de interferón gamma. El día del experimento, sustituya el medio por HBSS que contenga 2,5 o 7,5 nanogramos por mililitro de TNF.Para corregir el medidor, inserte el electrodo de corrección en el puerto de entrada y elija el modo Ohm. A continuación, utilice un destornillador para ajustar el tornillo de ajuste R hasta que el medidor muestre una lectura de 1.000 ohmios. Esterilice los electrodos en 70%etanol durante 15 a 30 minutos y démútelos secar al aire durante 15 segundos.A continuación, enjuague los electrodos en un medio de cultivo celular experimental. A continuación, encienda la alimentación y elija el modo Ohm. Mientras mantiene los electrodos verticales, coloque cuidadosamente los extremos largos de los puentes de electrodos en la cámara basal, asegurándose de que toquen el plato.A continuación, coloque los extremos cortos en la cámara apical, asegurándose de que permanezcan por debajo de la superficie del medio, pero por encima de los insertos de cultivo de tejido. Mida la resistencia de la muestra y las plaquitas en blanco a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas después del tratamiento con citoquinas. Entonces registra la resistencia.Para lograr la consistencia en diferentes formatos de placa, calcule el producto de la resistencia y el área de membrana efectiva como se muestra aquí. Para 24 inserciones de pozos, el área efectiva de la membrana es de 0,33 centímetros cuadrados. Para inducir la colitis, agregue DSS al agua autoclavada a una concentración final de 3,5% de peso por volumen.A continuación, utilice la solución DSS para reemplazar el agua potable en las jaulas de seis ratones C57 negros C57 negros de 8 semanas de edad durante un total de siete días. Dar agua potable regular sin DSS para controlar ratones. Después del día siete, cambie el agua del DSS por agua potable regular.Cada día, sopesar a los ratones y evaluar las puntuaciones clínicas según se define de acuerdo con la gravedad de la enfermedad por cuatro parámetros: prolapso rectal, consistencia de las heces, sangrado y actividad. Sume las puntuaciones de estos parámetros para una puntuación clínica final. Analizar la condición histopatológica de los tejidos del colon siete días después del tratamiento con DSS, después de eutanasiar ratones de acuerdo con el protocolo de texto, aislar el colon y el cecum, y medir la longitud del colon.Corte segmentos de 0,5 centímetros del colon distal y fije el tejido en un tubo de halcón de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de 10% de formalina durante la noche. Lave los tejidos fijos con etanol y xileno clasificados. A continuación, incruste los tejidos en la parafina y corte seis secciones milimétricas para la tinción de hematoxilina y eosina.Para medir la permeabilidad de la barrera epitelial en ratones inducidos por DSS, siete días después del inicio de la administración de DSS, ayúdenlos durante tres horas. Autoclave una aguja de gavage para asegurar la esterilidad, luego utilice 150 microlitros de 80 miligramos por mililitro de cuatro kilodatones FITC dextran en agua estéril para gavage los ratones, y mantenga el dextran FITC no utilizado para medir la curva estándar después de la recolección de suero. A continuación, ponderar a los ratones para el cálculo de la permeabilidad.Cuatro horas más tarde, después de anestesiar los ratones por inyección IP, confirme la anestesia adecuada por la falta de reflejos y movimiento del bigote. A continuación, coloque los ratones en un bloque de calor durante cinco minutos. Usando un par de tijeras, sujeta una pieza de un centímetro de la cola y recoge 100 microlitros de sangre de la cola en un tubo de recolección de suero.Gire la sangre recogida a 10.000 veces g y a temperatura ambiente durante diez minutos. Con agua, diluya el suero de uno a cuatro. A continuación, para hacer una curva estándar, utilice agua para preparar las diluciones del dextrán FITC no utilizado.Agregue 100 microlitros por pozo del suero y las muestras de curva estándar en 96 placas de pozo. Usando un lector de placas, lea la fluorescencia con una excitación de 485 y una emisión de 528. Calcule los valores de permeabilidad en función de la curva estándar y multiplique por cuatro para corregir la dilución.Divida la concentración de FITC dextran por el peso para normalizar los valores. Esto ayuda a normalizar la diferencia en el parto de dextran FITC si los ratones están enfermos y han perdido peso. Las células caco-2bbe que se muestran aquí fueron etiquetadas con núcleos y manchas de F-actina para mostrar la diferencia entre las células indiferenciadas y diferenciadas.Las fibras de estrés se ven claramente en las células indiferenciadas. Las células diferenciadas tienen un volumen más pequeño, núcleos más grandes y menos fibras de tensión que las células indiferenciadas. El TNF es fundamental para la pérdida de barrera intestinal a través de la regulación de unión estrecha dependiente de MLCK.Como se ve en esta cifra, TNF disminuye significativamente el TER de la monocapa Caco-2bbe de una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que TNF aumenta la permeabilidad epitelial. En comparación con su peso corporal inicial, los ratones tratados con DSS pierden una cantidad significativa de peso. La gravedad de la colitis se obtiene por prolapso rectal, consistencia de las heces, sangrado y actividad.Las secciones transversales de los tejidos colónicos manchados con hematoxilina y eosina muestran daño de la mucosa colónica en ratones tratados con DSS. Además, la longitud de la cripta de colon, así como el colon en sí, se reduce en ratones tratados con DSS. Por último, hay un aumento de aproximadamente el doble en los niveles de tinción de dextrano FITC en ratones tratados con DSS, en comparación con los ratones de control.Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar el error, estandarizando los procedimientos operativos y utilizando métodos estadísticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino a los investigadores en el campo de la función de barrera intestinal para explorar enfermedades gastrointestinales tanto en organismos modelo como en líneas celulares. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo determinar la permeabilidad epitelial intestinal midiendo el TER, gavaging FITC dextran, y la observación de cambios morfológicos e histoquímicos.

Research

JoVE Journal

Biology

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...