Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

Vi tackar Dr. Jerrold R. Turner, från Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, för hans generösa hjälp att slutföra denna studie. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation Kina (licensnummer 81470804, 31401229 och 81200620), den naturvetenskapliga grunden av Jiangsu-provinsen (licensnummer BK20180838 och BK20140319), The Research Innovation Program för College utexaminerade i Jiangsu-provinsen (licensnummer KYLX16-0116), avancerade projekt av Soochow forskningsuniversitet (licensnummer SDY2015_06), och Crohns & kolit Foundation Research Fellowship Award (bevilja nummer 310801).

Denna studie godkändes av djur vård och använda protokoll för Cambridge-Suda genomisk Resource Center (CAM-SU), Soochow universitet.
1. plätering och underhåll av Caco-2bbe på porösa polykarbonat membran
<ol><li>Odla cellerna i en T75 kolv med media (DMEM innehållande 10% FBS). Kolvar ska matas regelbundet, beroende på cell densiteten. Obs: För optimal plätering, bör celler delar snabbt och har en platt ”stekt ägg” form, vilket tyder på att cellerna är i tillväxtfasen...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

Det finns flera kritiska steg i protokollet. Caco-2BBe (borste gränsen-uttryckande) celler används alltid för TER mätning, utvalda från Caco-2 cell raden för uttrycket borsten gränserna proteiner. Caco-2BBe celler har en villus absorptive fenotyp när fullt differentierade (efter ca 3 veckor av kultur efter sammanflödet)17. Det är nödvändigt att undvika kontaminering under mätningen, och att sterilisera elektroden. Eftersom förfarandet är icke-sterila, kan mätningar endast utföras ...

Tarmepitelceller ansvarar inte bara för absorption av näringsämnen, men utgör också ett viktigt hinder att försvara mot patogena mikroorganismer och mikrobiell gifter. Detta intestinal barriärfunktion regleras av åtsittande föreningspunkt permeabilitet och epitelceller integritet1,2,3, och dysfunktion av epitelial barriärfunktionen är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom (IBD). Perijunctional actomyosin ringen (PAMR) ligger inom cellen som är nära sammanhängande till de åtsittande föreningspunkterna. Sammandragning av den PAMR, som regleras av myosin lätta kedjan (MLC), är avgörande för reglering av åtsittande föreningspunkt permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumörnekrosfaktor (TNF) är central för tarmbarriären förlust av upregulating intestinal epitelial MLC kinase (MLCK) uttryck och förmå occludin internalisering11,12,13.
Joner som Na+ och Cl– kan passera paracellular utrymmet av antingen pore eller läcka väg14. I en ”läckande” epitel återspeglar förändringar i TER primärt förändrade åtsittande föreningspunkt permeabilitet. TER mätning är en vanligt förekommande elektrofysiologiska strategi att kvantifiera åtsittande föreningspunkt permeabilitet, primärt till Na+ och Cl-, baserat på impedansen i cell enskiktslager. Olika celltyper, däribland tarmepitelceller, pulmonell epitelceller och vaskulära endotelceller, har rapporterats för TER-mätningar. Fördelarna med denna metod är att TER-mätningar är icke-invasiv och kan användas för att övervaka levande celler i realtid. Dessutom är TER mätning tekniken användbar för drug toxicitet studier15.
Caco-2BBe celler är mänskliga epitelceller kolorektal adenocarcinom celler med en struktur och funktion liknande de differentierade små tarmepitelceller: till exempel dessa celler ha Mikrovilli och enzymer som är associerad med liten intestinal borste gränsen. Därför utnyttjas odlade Caco-2BBe enskiktslager som en in vitro- modell för testning barriärfunktion.
Hos möss är ett sätt att studera intestinal paracellular permeabilitet genom att mäta FITC-dextran förmåga att korsa från lumen in i blodet. Intestinal permeabilitet kan således bedömas av gavaging FITC-dextran direkt in möss och mäta fluorescensen i blodet. Följande protokoll beskriver två enkla metoder för att bedöma intestinal epitel permeabilitet både in vitro- och in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

Tarmbarriären försvarar mot patogena mikroorganismer och mikrobiell toxin. Dess funktion regleras av åtsittande föreningspunkt permeabilitet och epitelceller integritet, och störningar i funktionen tarmbarriären bidrar till utvecklingen av gastrointestinala och systemisk sjukdom. Här presenteras två enkla metoder för att mäta genomträngligheten av intestinal epitel. In vitro, Caco-2BBe celler är klädd i vävnadsodling brunnar som en enskiktslager och transepithelial elektriska motstånd (TER) kan mätas genom en epitelial (volt/ohm) mätare. Denna metod är övertygande på grund av dess användarvänlighet och repeterbarhet. In vivo möss är gavaged med 4 kDa fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran och FITC-dextran koncentrationerna mäts i insamlade serumprover från möss till avgöra epitelial permeabilitet. Oral sondmatning ger en korrekt dos, och därför är den rekommenderade metoden att mäta av intestinal permeabilitet i vivo. Sammantaget dessa två metoder kan mäta genomträngligheten av intestinal epitel in vitro och in-vivo, och därmed användas för att studera kopplingen mellan sjukdomar och barriärfunktion.

I kultur, Caco-2BBe celler växer som en enskiktslager och differentieras långsamt till mogen absorptive enterocyter som har borsten gränserna. I detta protokoll, Caco-2BBe celler var klädd med en hög densitet på polykarbonat membran och celler nådde 100% konfluens en dag efter sådd. Cellerna är dock odifferentierade i detta skede: för att helt skilja cellerna, media ändras varje 2-3 dagar i 3 veckor. Cellerna var fläckade av atomkärnor och F-aktin fläckar för att visa skill...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Här presenteras två metoder för att fastställa intestinal barriärfunktion. En epitelial mätare (volt/ohm) används för mätningar av transepithelial elektriska motståndet av odlade epitel direkt i vävnadsodling brunnar. Hos möss används metoden FITC-dextran sondmatning att avgöra den intestinala permeabilitet i vivo.

In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Det övergripande målet med detta experiment är att studera de sjukdomar som orsakas av epitelbarriären dysfunktion genom att mäta tarm epitelial cellen permeabilitet in vitro och in vivo. Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor i tarmbarriären funktionsfältet, såsom de som rör den inflammatoriska tarmsjukdom. Den största fördelen med denna teknik är att tarmepiteletial cellpermeabilitet kan bedömas både in vitro och in vivo.Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi eller diagnos av mag-tarmsjukdomar, eftersom intestinala epitelial barriär dysfunktion bidrar till dessa sjukdomar. Även om denna metod kan ge insikt i tarmbarriären funktion, det kan också tillämpas på andra system, såsom läkemedelstoxicitet studier och barriär integritet andra celltyper. Visuell demonstration av den här metoden är kritisk, eftersom vissa steg är svåra att lära sig.En korrekt operation av denna metod kan nu förstås med textbeskrivning. Till att börja med odlar Caco-2bbe celler i en T75 kolv med medium. Mata kolvarna regelbundet, beroende på celltätheten.När cellerna är 80%konfluenta, ta bort mediet och använd 1-2 milliliter steril PBS utan kalcium för att skölja dem. Tillsätt 1,5 milliliter Trypsin-EDTA, och försiktigt klippa kolven. Sedan, placera den i 37 grader Celsius inkubator i 20 minuter, utan att gunga.Medan cellerna är trypsinizing, placera skär som innehåller porösa polykarbonat membran i 24 brunnsplattor. Tillsätt sedan 1 milliliter odlingsmedium i basalkammaren som är det nedre utrymmet i membranet. Tillsätt 5 milliliter medium till kolven, och kraftigt pipettera cellerna mot insidan av kolven 5 till 10 gånger, för att separera kulturen i lösa enskilda celler, eller två till tre cellklump.Plate 0,166 milliliter av cellerna i den apikala kammaren som är det övre utrymmet i membranet. Sedan inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i upp till tre veckor. Mata cellerna tre gånger i veckan, genom att använda en tryckpump för att noggrant aspirera mediet från basalfacket i varje brunn.Droppa sedan försiktigt en milliliter medium i den apikala kammaren i varje skär. För cytokinstudier ersätter, en dag före transepitelialt elektriskt motstånd eller TER-mätningar, basalt medium med medium, innehållande 10 nanogram per milliliter interferon gamma. På dagen för experimentet, ersätta mediet med HBSS som innehåller 2,5 eller 7,5 nanogram per milliliter av TNF.För att korrigera mätaren, sätt in korrigeringselektroden i inmatningsporten och välj Ohm-läge. Använd sedan en skruvmejsel för att justera R Justeringsskruven tills mätaren visar en avläsning på 1, 000 ohm. Sterilisera elektroderna i 70%etanol i 15 till 30 minuter och låt dem lufttorka i 15 sekunder.Skölj sedan elektroderna i experimentellt cellodlingsmedium. Därefter slår du på strömmen och väljer Ohm-läge. Samtidigt som elektroderna håller vertikala, placera försiktigt de långa ändarna av elektrodbroar i basalkammaren, se till att de rör skålen.Placera sedan de korta ändarna i den apikala kammaren, se till att de stannar under ytan av mediet, men ovanför vävnadskulturen skär. Mät provets och blindinsatsens resistens vid 0, 1, 2, 3 och 4 timmar efter cytokinbehandling. Spela in motståndet då.För att uppnå konsistens över olika plåtformat, beräkna produkten av motståndet och det effektiva membranområdet som visas här. För 24 brunnsinsatser är det effektiva membranområdet 0,33 kvadratcentimeter. För att inducera kolit, tillsätt DSS till autoklaverat vatten till en slutlig koncentration av 3,5%vikt per volym.Använd sedan DSS-lösningen för att ersätta dricksvattnet i burarna på 8 veckor gamla manliga C57 svarta sexmöss i totalt sju dagar. Ge regelbundet dricksvatten utan DSS för att kontrollera möss. Efter dag sju, byt DSS-vatten till vanligt dricksvatten.Varje dag, väga mössen och bedöma de kliniska poängen enligt definitionen enligt sjukdomens svårighetsgrad av fyra parametrar:rektal framfall, avföring konsistens, blödning, och aktivitet. Summera poängen från dessa parametrar för en slutlig klinisk poäng. För att analysera histopatologiska tillståndet i kolon vävnader sju dagar efter DSS behandling, efter euthanizing möss enligt textprotokollet, isolera kolon och cecum, och mäta längden på tjocktarmen.Skär 0,5 centimeter segment från den distala kolon, och fixa vävnaden i en 15 milliliter falk rör som innehåller 10 milliliter av 10%formalin över natten. Tvätta de fasta vävnaderna med graderad etanol och xylen. Sedan bädda vävnaderna i paraffin och skär sex millimeter sektioner för hematoxylin och eosin färgning.För att mäta epitelisk barriärpermeabilitet hos DSS-inducerade möss, sju dagar efter starten av DSS-administrering, snabbar mössen i tre timmar. Autoklav en sondmatning nål för att säkerställa sterilitet, sedan använda 150 mikroliter på 80 milligram per milliliter fyra kilodalton FITC dextran i sterilt vatten till sondmatning mössen, och hålla oanvända FITC dextran att mäta standardkurvan efter serum insamling. Därefter viktmössen för permeabilitetsberäkningen.Fyra timmar senare, efter att ha sövt mössen genom IP-injektion, bekräftar korrekt anesthetization av bristen på reflexer och morrhår rörelse. Placera sedan mössen på ett värmeblock i fem minuter. Med hjälp av en sax, klipp en en centimeter bit av svansen och samla 100 mikroliter blod från svansen i ett serum samlingsrör.Snurra det insamlade blodet i 10, 000 gånger g och rumstemperatur i tio minuter. Med vatten, späd serumet ett till fyra. Sedan, för att göra en standardkurva, använd vatten för att förbereda utspädningarna av den oanvända FITC dextran.Tillsätt 100 mikroliter per brunn av serumet och standardkurvproverna i 96 brunnsplattor. Med hjälp av en tallriksläsare, läs fluorescensen vid en excitation av 485 och ett utsläpp av 528. Beräkna permeabilitetsvärdena baserat på standardkurvan, och multiplicera med fyra för att korrigera för utspädningen.Dela koncentrationen av FITC dextran med vikten för att normalisera värdena. Detta bidrar till att normalisera skillnaden i FITC dextran leverans om möss är sjuka, och har gått ner i vikt. De Caco-2bbe celler som visas här var märkta med atomkärnor och F-aktin fläckar för att visa skillnaden mellan odifferentierade och differentierade celler.Stressfibrer ses tydligt i odifferentierade celler. Differentierade celler har en mindre volym, större kärnor, och färre stress fibrer än odifferentierade celler. TNF är centralt för intestinal barriär förlust genom MLCK-beroende snäva korsningen reglering.Som man ser i denna siffra minskar TNF avsevärt TER av Caco- 2bbe monolayer på ett dosberoende sätt, vilket tyder på att TNF ökar epitelial permeabilitet. Jämfört med deras ursprungliga kroppsvikt, möss som behandlats med DSS förlora en betydande mängd vikt. Svårighetsgraden av kolit poängsätts av rektal framfall, avföring konsekvens, blödning, och aktivitet.Tvärsnitt av colonic vävnader färgas med hematoxylin och eosin visa colonic mucosal skador i DSS-behandlade möss. Dessutom är längden på kolonkryptan, liksom kolon själv, minskade i DSS-behandlade möss. Slutligen finns det en ungefär tvåfaldig ökning av nivåerna av FITC dextran färgning i DSS-behandlade möss, jämfört med kontroll möss.Medan du försöker denna procedur, Det är viktigt att komma ihåg att minimera fel, genom att standardisera operativa förfaranden och utnyttja statistiska metoder. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen till forskare inom tarmbarriärens funktion för att utforska gastrointestinala sjukdomar i både modellorganismer och cellinjer. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man bestämmer intestinala epitelial permeabilitet genom att mäta TER, gavaging FITC dextran, och observera morfologiska och histokemiska förändringar.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualisering av MG53-medierad cellmembranet reparera med hjälp av In vivo Och In vitro System

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analys av Metabolic profil i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetiska och biokemiska metoder för<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; In Vitro</em&gt; Bedömning av Protein Oligomerisering: ryanodin Receptor Fallstudie

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Glomerular Utväxt som en Ex Vivo-analys för att analysera vägar som är inblandade i parietal epitelial cellaktivering

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoid-härledd epitelial monolager: En kliniskt relevant in vitro-modell för tarmbarriärfunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Intestinal epitelregenerering som svar på joniserande bestrålning

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In vivo Detektion av vaskulär permeabilitet i musens submandibulära körtel

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...