Name: in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

Bu çalışmada tamamlanmasında cömert yardım için Dr Jerrold R. Turner, Brigham ve kadın Hastanesi, Harvard Tıp Okulu, teşekkür ederim. Bu eser desteklenen (grant numarası 81470804, 31401229 ve 81200620) Çin'in ulusal doğal Bilim Vakfı, Doğa Bilimleri Vakfı, Jiangsu Province (grant numarası BK20180838 ve BK20140319), araştırma Innovation programı için Jiangsu Province, üniversite mezunları (grant numarası KYLX16-0116), ileri araştırma projeleri Soochow Üniversitesi (grant sayı SDY2015_06) ve Crohn ve kolit Vakfı Araştırma Bursu Ödülü (sayı 310801 vermek).

Bu çalışmada hayvan bakım ve kullanım iletişim kuralı, Cambridge-Suda genomik Kaynak Merkezi (CAM-SU), Soochow Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kaplama ve Caco-2bbe gözenekli Polikarbonat membranlar üzerinde bakım
<ol><li>Bir T75 şişesi ile kitle iletişim araçları içinde hücrelerin büyümesine (% 10 içeren DMEM FBS). Şişeler düzenli olarak, hücre yoğunluğu bağlı olarak beslenmeleri gerekir. Not: optimum kaplama için hücreleri hızla Böl ve hücr...

<ol>
	<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target?.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; hepatology. 14, 9-21 (2017).</li><li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets.">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase,+MLCK1,+regulates+epithelial+tight+junction+permeability.">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis.">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis.">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells.">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1.">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li><li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice.">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development.">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li><li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo.">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li><li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity.">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li><li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+molecular+remodeling+in+differential+regulation+of+tight+junction+300+permeability.">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction.">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li><li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2.">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease.">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li></ol>

Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Caco-2BBe (fırça sınır-ifade) hücreler her zaman TER ölçüm, Caco-2 hücre kültürünü ifade sınır ötesi fırça proteinlerin için seçildiği için kullanılır. Caco-2BBe hücreleri villus dinsel fenotip var ne zaman tam-Ayrıştırılan (kültür sonrası izdiham yaklaşık 3 hafta sonra)17. Ölçüm sırasında kontaminasyon ve elektrot sterilize etmek için gereklidir. Yordamı non-steril olduğundan, ölçümleri yalnızca en fazl...

Bağırsak epitel hücreleri sadece besin emilimi için sorumlu değildir, ama aynı zamanda patojen mikroorganizmaların ve mikrobiyal toksinler karşı savunmak için önemli bir bariyer oluşturmak. Bu bağırsak bariyer fonksiyonu sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlüğü1,2,3tarafından düzenlenir ve epitel bariyer fonksiyonunun disfonksiyon iltihabi bağırsak ile ilişkilidir hastalığı (IBD). Perijunctional actomyosin yüzük (PAMR) sıkı kavşak yakından bitişik hücre içinde yatıyor. Myosin hafif zincir (MLC) tarafından düzenlenir, PAMR daralma sıkı kavşak geçirgenliği4,5,6,7,8düzenlenmesi için önemlidir, 9,10. Tümör nekroz faktör (TNF) bağırsak bariyer kaybı etkinleşmiş Bağırsak epitel MLC kinaz (MICK) ifade ve occludin içselleştirilmesi11,12,13inducing için merkezi bir noktada bulunuyor.
İyonlar Na+ ve Cl- gibi gözenek veya sızıntı yolu14tarafından paracellular alan çapraz. "Sızan" bir epitel içinde TER değişiklikleri öncelikle değişmiş sıkı kavşak geçirgenliği yansıtmak. TER ölçüm hücre monolayers empedans göre sıkı Kavşağı geçirgenliği, Na+ ve-, Cl için öncelikle ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir elektrofizyolojik yaklaşımdır. Farklı hücre tipleri, Bağırsak epitel hücreleri, pulmoner epitel hücreleri ve vasküler endotel hücreleri, gibi TER ölçülerini bildirilmiştir. Bu yöntemin avantajları, TER ölçümleri non-invaziv ve canlı hücreleri gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılan vardır. Buna ek olarak, TER ölçüm tekniği uyuşturucu toksisite çalışmaları15için yararlıdır.
Caco-2BBe hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom hücre yapısı ve farklılaştırılmış küçük bağırsak epitel hücrelere benzer işlev vardır: Örneğin, microvilli ve küçük bağırsak fırça ile ilişkili enzimler bu hücreler var sınır. Bu nedenle, kültürlü Caco-2BBe monolayers bariyer fonksiyonu test etmek için bir vitro model olarak kullanılmaktadır.
Farelerde, kana lümen geçmeye FITC dextran yeteneği ölçerek bağırsak paracellular geçirgenliği çalışmaya yollarından biridir. Böylece, bağırsak geçirgenliği gavaging FITC dextran doğrudan içine fare ve kan içinde floresans ölçme tarafından tespit edilebilir. Aşağıdaki iletişim kuralı Bağırsak epitel geçirgenliği değerlendirmek için iki basit yöntem açıklanır vitro ve içinde vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>22G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 kDa FITC-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plates for fluorescence</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-245-197A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caco-2BBe cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulphate sodium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMED with high glucose and sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial (Volt/Ohm) Meter&#160;</td>
			<td>Millicell-ERS</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFNg</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Tissue Embedding Center&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EG1150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum collection tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1378.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask&#160;</td>
			<td>corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parraffin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6330-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes (Transwell)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure pump</td>
			<td>AUTOSCIENCE</td>
			<td>AP-9925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtomy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sinopharm ChemicalReagent</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability

Bağırsak bariyer patojen mikroorganizma ve mikrobiyal toksin karşı savunur. İşlevi sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlük tarafından düzenlenir ve bağırsak bariyer fonksiyonu bozulma gastrointestinal ve sistemik hastalık ilerleme katkıda bulunur. Burada Bağırsak epitel geçirgenliği ölçmek için iki basit yöntem anlatılmaktadır. Vitro, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer doku kültürü wells kaplama ve transepithelial elektrik direnci (TER) bir epitel (volt/ohm) metre ile ölçülür. Bu yöntem olan Kullanıcı dostu işlem ve tekrarlanabilirlik nedeniyle ikna edici. İçinde vivo fareler 4 kDa floresein isothiocyanate (FITC) ile gavaged-dextran ve FITC dextran konsantrasyonları epitel geçirgenliği belirlemek için fare üzerinden toplanan serum örneklerinde ölçülen. Oral gavaj doğru bir doz sağlar ve bu nedenle bağırsak geçirgenliği vivoölçmek için tercih edilen yöntemdir. Birlikte ele alındığında, bu iki yöntem bağırsak epitel içinde in vitro ve in vivogeçirgenliği ölçüm yapabilir ve bu nedenle hastalıklar ve bariyer fonksiyonu arasındaki bağlantıyı çalışmaya kullanılması.

Kültür, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer büyümek ve yavaşça fırça kenarlıklara sahip olgun dinsel enterositler ayırt etmek. Bu iletişim kuralı, Caco-2BBe hücreleri yüksek yoğunluklu Polikarbonat membranlar üzerinde kaplama ve hücrelerin % 100 confluency bir gün tohum sonra ulaştı. Ancak, bu aşamada farklılaşmamış hücreleri olan: tam hücreleri ayırt etmek için medya her 2-3 gün 3 hafta için değiştirilir. Hücre çekirdeği ile lekeli ve farklılaşmamış...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Bu deneyin genel amacı in vitro ve in vivo bağırsak epitel hücre geçirgenliğini ölçerek epitel bariyer disfonksiyonu neden olduğu hastalıkları incelemektir. Bu yöntem bağırsak bariyeri fonksiyon alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, bu inflamatuar barsak hastalığı ile ilgili olanlar gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı bağırsak epitel hücre geçirgenliğinin hem in vitro hem de in vivo olarak değerlendirilebiliyor olmasıdır.Bu tekniğin etkileri gastrointestinal hastalıkların tedavisi veya tanısına kadar uzanır, çünkü intestinal epitel bariyer disfonksiyonu bu hastalıklara katkıda bulunur. Bu yöntem bağırsak bariyer fonksiyonu içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir, ilaç toksisite çalışmaları ve diğer hücre türlerinin bariyer bütünlüğü gibi. Bazı adımları öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.Bu yöntemin doğru bir işlem artık metin açıklaması ile anlaşılabilir. Başlamak için, orta ile bir T75 şişesinde Caco-2bbe hücreleri büyümek. Hücre yoğunluğuna bağlı olarak şişeleri düzenli olarak besleyin.Hücreler %80 konca olduğunda, ortayı çıkarın ve 1-2 mililitre steril PBS kullanın. Trypsin-EDTA 1,5 mililitre ekleyin ve yavaşça şişe kaya. Sonra, 37 derece santigrat antiktoruna 20 dakika boyunca, sallanmadan yerleştirin.Hücreler denerken, gözenekli polikarbonat membranlar içeren kesici uçları 24 kuyu plakasına yerleştirin. Daha sonra membranın alt alanı olan bazal odaya 1 mililitre kültür ortamı ekleyin. Şişeye 5 mililitre orta litre ekleyin ve gevşek bireysel hücrelere kültürü ayırmak için, şişenin içine karşı hücreleri 5 ila 10 kez veya iki ila üç hücre kümeleri halinde şiddetle pipet.Plaka 0.166 hücrelerin mililitre membranın üst alanı olan apikal odasına. Sonra plakaları 37 derecede üç haftakadar kuluçkaya yatırın. Her kuyunun bazal bölmesinden ortayı dikkatlice aspire etmek için bir basınç pompası kullanarak hücreleri haftada üç kez besleyin.Daha sonra her kesici uça bir mililitre orta damlatın. Sitokin çalışmaları için, transepitel elektrikdirenci veya TER ölçümlerinden bir gün önce, bazal ortayı, mililitre interferon gama başına 10 nanogram içeren orta ile değiştirin. Deney günü, tnf mililitre başına 2,5 veya 7,5 nanogram içeren HBSS ile orta değiştirin.Sayacı düzeltmek için, düzeltme elektrotunu giriş noktasına takın ve Ohm modunu seçin. Daha sonra sayaç 1.000 ohm'luk bir okuma görüntüleyene kadar R Ayar vidasını ayarlamak için bir tornavida kullanın. Elektrotları 15 ila 30 dakika boyunca %70 etanolile sterilize edin ve 15 saniye boyunca kurumasını bekleyin.Daha sonra elektrotları deneysel hücre kültürü ortamında durulayın. Ardından, gücü açın ve Ohm modunu seçin. Elektrotları dikey tutarken, elektrot köprülerinin uzun uçlarını dikkatlice bazal odaya yerleştirin ve çanağa dokunmalarını sağlar.Daha sonra kısa uçları apikal odaya yerleştirin, ortam yüzeyinin altında kalmalarını sağlamak, ancak doku kültürünün üzerinde ekler. Sitokin tedavisinden sonra numunenin direncini ve boş kesici uçları 0, 1, 2, 3 ve 4 saat ölçün. O zaman direnişi kaydet.Farklı plaka biçimleri arasında tutarlılık elde etmek için, direnç ürün ve etkili membran alanı burada gösterildiği gibi hesaplayın. 24 kuyu kesici uç için etkili membran alanı 0,33 santimetre karedir. Kolitin indüklenebilmek için, otoklavlı suya dss ekleyin ve hacim başına %3,5 ağırlıkta son konsantrasyona ekleyin.Daha sonra 8 haftalık erkek C57 siyah altı fare kafeslerinde içme suyu yerine yedi gün toplam DSS çözeltisi kullanın. Fareleri kontrol etmek için DSS olmadan düzenli içme suyu verin. Yedinci günden sonra, DSS suyunu normal içme suyuna çevirin.Her gün, fareleri tartın ve hastalığın şiddetine göre tanımlanan klinik skorları dört parametre ile değerlendirin: rektal prolapsus, dışkı tutarlılığı, kanama ve aktivite. Son klinik puan için bu parametrelerden puanları toplamı. Kolon dokularının histopatolojik durumunu analiz etmek için yedi gün sonra DSS tedavisi, metin protokolüne göre fareler ötenazi sonra, kolon ve çekum izole, ve kolon uzunluğunu ölçmek.Distal kolondan 0.5 santimetrelik parçalar kesin ve bir gecede 10 mililitre formalin içeren 15 mililitrelik şahin tüpündeki dokuyu düzeltin. Sabit dokuları dereceli etanol ve ksilen ile yıkayın. Sonra parafin dokuları gömmek ve hematoksilin ve eozin boyama için altı milimetrelik kesitler kesti.DSS'ye bağlı farelerde epitel bariyer geçirgenliğini ölçmek için, DSS uygulamasının başlamasından yedi gün sonra, fareleri üç saat boyunca hızlı layın. Otoklav bir gavaj iğne kısırlık sağlamak için, sonra mililitre dört kilodalton FITC dextran steril suda fareler gavage başına 80 miligram 150 mikrolitre kullanın ve serum toplama sonra standart eğriyi ölçmek için kullanılmayan FITC dextran tutmak. Sonra, geçirgenlik hesaplamaiçin fareler ağırlık.Dört saat sonra, IP enjeksiyonu ile fareler anestezi sonra, refleksleri ve bıyık hareketi eksikliği ile uygun anestezi onaylamak. Sonra fareleri beş dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin. Bir makas kullanarak, kuyruğun bir santimetrelik parçasını kırpın ve kuyruktan 100 mikrolitre kan toplayıp serum toplama tüpüne yerleştirin.Toplanan kanı 10,000 kez g ve oda sıcaklığında on dakika döndürün. Suyla serumu 1'den 4'e seyrelt. Daha sonra, standart bir eğri yapmak için, kullanılmayan FITC dextran seyreltme hazırlamak için su kullanın.96 kuyu plakası içine serum ve standart eğri örnekleri kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin. Bir plaka okuyucu kullanarak, 485 bir uyarma ve 528 bir emisyon floresan okuyun. Standart eğriyi temel alarak geçirgenlik değerlerini hesaplayın ve seyreltme için düzeltmek için dörtle çarpın.Değerleri normalleştirmek için FITC dextran konsantrasyonu ağırlığına bölün. Bu fareler hasta ise FITC dextran teslimat farkı normalleştirmek için yardımcı olur, ve kilo vermiş. Burada gösterilen Caco-2bbe hücreleri, farklılaşmamış ve farklılaşmış hücreler arasındaki farkı göstermek için çekirdek ve F-aktin lekeleri ile etiketlenmiştir.Stres lifleri açıkça farklılaşmamış hücrelerde görülür. Farklılaşmış hücreler, farklılaşmamış hücrelere göre daha küçük hacimli, daha büyük çekirdeklere ve daha az stres liflerine sahiptir. TNF MLCK bağımlı sıkı kavşak regülasyonu ile bağırsak bariyer kaybı merkezidir.Bu şekilde görüldüğü gibi, TNF doza bağımlı bir şekilde Caco-2bbe monolayer TER önemli ölçüde azalır, TNF epitel geçirgenliği artırır düşündürmektedir. İlk vücut ağırlıklarıyla karşılaştırıldığında, DSS ile tedavi edilen fareler önemli miktarda kilo kaybederler. Kolitin şiddeti rektal prolapsus, dışkı tutarlılığı, kanama ve aktivite ile puanlandırılır.Hematoksilin ve eozin ile boyanmış kolon dokularının kesitleri DSS ile tedavi edilen farelerde kolon mukozal hasarı göstermektedir. Buna ek olarak, kolon mahzeninin uzunluğu ve kolon kendisi, DSS ile tedavi farelerde azalır. Son olarak, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, DSS ile tedavi edilen farelerde FITC dekstran boyama düzeylerinde yaklaşık iki kat artış vardır.Bu yordamı denerken, operasyonel prosedürleri standartlaştırarak ve istatistiksel yöntemler kullanarak hatayı en aza indirmeyi unutmamak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra hem model organizmalarda hem de hücre hatlarında gastrointestinal hastalıkları araştırmak için bağırsak bariyeri fonksiyonu alanında araştırmacıların önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, TER ölçerek, FITC dextran'ı katarak ve morfolojik ve histokimyasal değişiklikleri gözlemleyerek bağırsak epitelyal geçirgenliğini nasıl belirleyebildiğinizi iyi anlamalısınız.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal Epitel Hücre Aktivasyonunda Yer Alan Yolları Analiz Etmek Için Ex Vivo Analizi olarak Glomerüler Büyüme

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

İn Vivo Fare Submandibuler Bezinde Vasküler Geçirgenlik Tespiti

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...