Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

يشكر المؤلفون البروفيسور رود دلول والبروفيسور إيفو تو لتزويدنا بخط الخلية 32D/ز-CSF آر، والبروفيسور دانيال زاي تينين على تزويدنا بخط الخلية Bosc23. أيد منح الوكالة منحة للجمهورية التشيكية (جاكر 15-03796S وجاكر 17-02177S) لما ي هذا العمل، ودعم من معهد علم الوراثة الجزيئي "أكاديمية العلوم التشيكية" (رفو 68378050) MA-ي، زمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 341015) من جامعة تشارلز في براغ لعضو الكنيست، وزمالة المملكة المتحدة GA (المشروع رقم 1278217) من جامعة تشارلز في براغ للمشتريات.

ملاحظة: الخطوات تصف التوسع، التمايز، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF آر ترد أدناه.
1-إعداد
<ol><li>إعداد الوسائط
	<ol>
<li>تحضير 250 مل من الثقافة المتوسطة: المتوسطة 1640 RPMI (معهد ميموريال بارك روزويل) تستكمل مع الحرارة 10% إبطال FBS (الجنين المصل البقري)، وايل-3 مورين (10 نانوغرام/مل).<ol>
<li>وب?...

اختيار نموذج تجريبي إحدى القضايا الرئيسية في مجال البحوث. على الرغم من أن يعتقد أن الخلايا الحيوانية والبشرية الأساسية لإنتاج البيانات ذات الصلة الأكثر بيولوجيا، هذه النماذج قد تشمل الشواغل الأخلاقية وغالباً ما تكون مقترنة بإجراءات مكلفة و/أو المتطورة العزلة/استزراع. الخلايا الأولية مح...

إمدادات السكان المكونة للدم الجذعية والسلف الكائن مع مجموعة كبيرة من الخلايا الناضجة، بما في ذلك الخلايا من نسب النقوي (العَدلات، الحمضات، الاسسه، ووحيدات). العملية التي تقود إنتاج خلايا النقوي من الخلايا الجذعية المكونة للدم يعرف باسم ميلوبويسيس، ويكفي إنتاج خلايا النقوي ناضجة في الاستجابة للمتطلبات المتغيرة شرط مسبق للتعامل السليم في الحي مع الإجهاد الشروط، مثل الالتهابات وفقدان الدم. قد يؤدي عدم كفاية إنتاج خلايا النقوي ناضجة للتمكن من القضاء على مسببات الأمراض وتخثر الدم المخفضة، وأخرى تهدد الحياة ظروف1،2. وبالإضافة إلى ذلك، تعديلات في نسب النقوي التنمية قد يكون مرتبطاً أيضا بالأورام الخبيثة الدموية، مثل سرطان الدم النقوي الحاد (AML)3. قد تحدث تغييرات في ميلوبويسيس لأسباب مختلفة، مثل عيوب في خلايا المستقبلات السطحية4، تعبيرات غيرت من عوامل النسخ5، ضعف مسارات الإشارات6، الطفرات أسفر عن تشكيل/ تفعيل المسرطنة7، أو المنظمة من ورم المكثف الجينات8.
وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة التنمية النقوي، وتقييم أثر التعديلات الوراثية المحددة في هذه العملية. ينطوي النهج المشتركة المستخدمة لدراسة ميلوبويسيس الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا. على الرغم من أن هذه النماذج تسمح الحصول على البيانات ذات الصلة بيولوجيا، لديهم بعض القيود. واجه استخدام الخلايا الأولية على عدد محدود من الخلايا وفترة مقيدة للثقافة، وتضييق إمكانيات لتغيير التعبير الجيني وتحليل البيولوجية أو الكيميائية الحيوية اللاحقة. الفئران المعدلة وراثيا هي مكلفة وتتطلب درجة معقولة من التبرير البيولوجي. وبالإضافة إلى ذلك، يضيف العامل مع نماذج في فيفو على درجة من التعقيد في فهم دور الجينات للاهتمام بعملية معينة. ولذلك، يلزم نهج بديلة للتحايل على هذه القيود. خطوط الخلية لها مزايا لا جدال فيه: (1) أنها تمتلك قدرة الانتشار غير المحدود الذي يسمح لتوليد ما يكفي من المواد للدراسات البيوكيميائية والبيولوجية، (2) فعرضه للتلاعب الوراثي (ضربة قاضية، خروج المغلوب، overexpression)، (3) التكلفة منخفضة نسبيا، و (4) أنها تسمح بقدر من التبسيط البيولوجية المطلوبة في بعض النهج التجريبي.
3 إيل الأبوية (انترلوكين-3) 32D تعتمد خط الخلية أنشئت في عام 1983 جرينبيرجير وزملاؤه بعدوى خلايا نخاع العظام من الفئران C3H/HeJ مع صديق اللوكيميا مورين الفيروسات9. ووصفت استنساخ 32D عدة في الأدب: cl-239و cl-310و cl-1011. وعرضت 32D cl-3 الخلايا تتكاثر في إيل-3 والخضوع للتمايز بيضاء على المعاملة مع مستعمرة المحببات التحفيز عامل (ز-CSF)10. على العكس من ذلك، 32D cl-10 خلايا، حين أنها تعتمد على 3 إيل، أصلاً كانت لا التفريق في الاستجابة للعلاج ز-CSF. وفي عام 1995 ترانسدوسيد مجموعة الدكتور إيفو تو ريتروفيرالي 32D cl-10 خلايا مع نوع البرية وأشكال المسخ من مستقبلات ز-CSF (ز-CSF آر)، بغية تحديد المناطق الهامة وظيفيا لهذا مستقبلات11. وأسفرت هذه الدراسة جيل الخلايا 32D/ز-CSF آر، التي تعتمد على نحو مماثل في إيل-3، ولكن في غضون 6 إلى 10 يوما بعد استبدال إيل-3 مع ز-CSF، تتوقف الخلايا تتكاثر وتفرق بلا رجعة في العَدلات الناضجة. هذه الخصائص تجعل 32D cl-3 والخلايا 32D/ز-CSF آر نماذج مبسطة من التمايز بالعدلات مورين التي يمكن أن تكون عن طريق اثنين من نمو محددة تحديداً جيدا وعوامل التمايز-إيل-3 وز-CSF التضمين. خلال العقود الماضية قد استخدمت مجموعات متعددة الخلايا 32D/ز-CSF آر لدراسة دور الجينات خاصة في الانتشار وتمايز الخلايا النقوي في الثقافة12،13،،من1415 , 16، ودراسة ز-CSF مما يشير إلى17،18. الأهم من ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الخط خلية ترتبط مع البيانات التي تم الحصول عليها مع الخلايا الأولية والفئران المعدلة وراثيا16،19،،من2021. ونتيجة لذلك، نعتقد أن الخلايا 32D/ز-CSF آر، يجري نموذج الراسخة والمستخدمة على نطاق واسع، تمثل نظاما قيماً لدراسة النقوي التمايز التي يمكن استخدامها بالتوازي مع نهج أخرى التصدي لهذه المسألة.
هنا، يرد بروتوكولات مفصلة تصف التعامل مع خط الخلية 32D/ز-CSF آر، التي توسع الغطاء والتمايز وتقييم الانتشار والتفريق بين هذه الخلايا. للتعديل الوراثي للخلايا 32D/ز-CSF آر، أما عن طريق توصيل النسخ العكسي أو لينتيفيرال، فضلا عن البروتوكولات لمعايرة الفيروس هي معلومات تفصيلية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير العديد من النتائج التمثيلية التي تثبت التطبيقات المحتملة للخلايا 32D/ز-CSF آر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم على آثار هامة للطب التجديدي، وعلاج أمراض الدم. على الرغم من البيانات الأكثر أهمية التي يمكن الحصول عليها باستخدام النماذج في فيفو أو الثقافات الأولية، يقيد وفرة منخفضة للخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم إلى حد كبير مجموعة تقنيات مناسبة للتحقيق فيها. ولذلك، يسمح استخدام خطوط الخلايا يكفي إنتاج المواد البيولوجية لأداء عروض أو الاختبارات التي تتطلب إعداد كبيرة من الخلايا. وهنا يقدم وصفاً مفصلاً، وقراءات، وتفسير لفحوصات الانتشار والتفرقة التي تستخدم لتحقيق العمليات التي ينطوي عليها ميلوبويسيس والتمايز بالعدلات. وتستخدم هذه التجارب خط الخلية النقوي مورين التابعة سيتوكين 32D/ز-CSF آر، التي تمتلك القدرة على تكاثر حضور إيل-3 والتفريق في ز-CSF. نحن نقدم الأمثل بروتوكولات للتعامل مع الخلايا 32D/ز-CSF آر ومناقشة المزالق الرئيسية والسلبيات التي قد تضر بوصف فحوصات والنتائج المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي هذه المقالة على بروتوكولات لإنتاج لينتيفيرال والفيروسات التراجعية، والمعايرة، وتوصيل الخلايا 32D/ز-CSF-R. علينا أن نظهر أن التلاعب الوراثي لهذه الخلايا يمكن أن تستخدم لإجراء الدراسات الفنية والجزيئية، التي يمكن أن تكمل النتائج التي تم الحصول عليها مع الأولية المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف أو نماذج في فيفو بنجاح.

انتشار وتمايز الخلايا 32D/ز-CSF-R
لتقييم انتشار الخلايا 32D/ز-CSF آر تحت ظروف برو التكاثري والمؤيدة التمايز، كان مثقف خلايا 32D/ز-CSF-R في الوسائط التي تحتوي على 3 إيل وز-CSF، على التوالي. ولوحظ أن انقسام الخلايا المستزرعة في إيل-3 التي تحتوي على المتوسط (...

Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

وترد هنا بروتوكولات مفصلة لاستزراع خط الخلية 32D/ز-CSF آر السلائف النقوي مورين وأداء العدوى الفيروسية، والقيام بفحوصات الانتشار والتفرقة. هذا الخط خلية مناسبة لدراسة التنمية الخلية النقوي، ودور جينات فائدة في نمو الخلايا النقوي والتمايز بيضاء.

انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات تكون الميالين

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

الكشف السريع عن النماء العصبي تعمل في خلايا الإنسان العصبية السلائف (الشخصيات)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...