Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Forfatterne takke Prof. Ruud Delwel og Prof. Ivo Touw for at give os med 32 d/G-CSF-R cellelinie og Prof. Daniel G. Tenen for at forsyne os med linjen Bosc23 celle. Dette arbejde blev støttet af tilskud af Grant agenturet af Den Tjekkiske Republik (GACR 15-03796S og GACR 17-02177S) til MA-Jørgensen, støtte fra Institut for molekylær genetik af det tjekkiske Videnskabsakademi (RVO 68378050) til MA-J, en GA UK fellowship (projekt nr. 341015) fra Charles Universitet i Prag til MK og en GA UK fellowship (projekt nr. 1278217) fra Charles Universitet i Prag til PD.

Bemærk: Trin beskriver ekspansion, differentiering og transduktion af 32 d/G-CSF-R celler er præsenteret nedenfor.
1. forberedelse
<ol><li>Media forberedelse
	<ol>
<li>Forberede 250 mL af næringssubstratet: RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium suppleret med 10% varme inaktiveret FBS (føtal bovint serum) og murine IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>Alternativt kan du bruge hjemmelavet IL-3. At producere hjemmelavet IL-3, transduce HEK293 celler med IL-3 udtrykke vekto...

Valget af en eksperimentel model er en af de vigtigste spørgsmål i forskning. Selvom primære dyre- og humane celler menes at producere de mest biologisk relevante data, disse modeller kan inddrage etiske overvejelser og er ofte forbundet med dyre og/eller sofistikeret isolation/dyrkning procedurer. Primærelementer er begrænset i antal og det er svært at genmanipulere dem. Derudover repræsenterer primærelementer en heterogen population bestående af forskellige celletyper, som kan komplicere data fortolkning<sup c...

Hæmatopoietisk stilk og stamfader befolkningen leverer organisme med et stort udvalg af modne celler, herunder celler fra myeloide slægt (neutrofiler, eosinofile, basofile og monocytter). Den proces, der drev produktion af myeloide celler fra hæmatopoietisk stamceller er kendt som myelopoiesis, og tilstrækkelig produktion af modne myeloide celler som reaktion på skiftende krav er en forudsætning for korrekt håndtering af organismen med stress betingelser, såsom infektioner og blodtab. Utilstrækkelig produktion af modne myeloide celler kan føre til manglende evne til at fjerne patogener, reduceret blood Koagulering og andre livstruende forhold1,2. Derudover kan forandringer i myeloide lineage udvikling også være forbundet med hematological maligniteter, såsom akut myeloid leukæmi (AML)3. Ændringer i myelopoiesis kan forekomme af forskellige årsager, såsom fejl i celle overfladen receptorer4, ændrede udtryk for transskription faktorer5, nedsat signaling veje6, mutationer resulterer i dannelse / aktivering af onkogener7eller inaktivering af tumor suppressor gener8.
Forskellige metoder er blevet udviklet for at studere myeloide udvikling, og vurdere effekten af specifikke genetiske ændringer i denne proces. Fælles tilgange bruges til at studere myelopoiesis involverer primærelementer og Transgene mus. Selv om disse modeller tillade erhvervelsen af biologisk relevante data, har de visse begrænsninger. Brugen af primærelementer støder på et begrænset antal celler og en begrænset periode af kultur, indsnævre mulighederne for at ændre genekspression og efterfølgende biologiske eller biokemiske analyser. Transgene mus er dyre og kræver en rimelig grad af biologisk begrundelse. Derudover tilføjer arbejder med i vivo modeller en grad af kompleksitet i oplysninger om betydningen af et gen af interesse i en given proces. Derfor er der behov for alternative metoder til at omgå disse begrænsninger. Cellelinjer har ubestridelige fordele: (1) de besidder ubegrænset spredning kapacitet, der tillader generere nok materiale til biokemiske og biologiske undersøgelser, (2) de er modtagelige for genetiske manipulationer (knockdown, knockout, overekspression), (3) omkostningerne er forholdsvis lave, og (4) de tillader en grad af biologisk forenkling kræves i visse eksperimenterende tilgange.
Af forældrenes IL-3 (Interleukin-3) afhængig af 32 d cellelinie blev etableret i 1983 af Greenberger og kolleger ved infektion af knoglemarv celler fra C3H/HeJ mus med ven murine leukæmi virus9. Flere 32D kloner var beskrevet i litteraturen: cl-239, cl-310og cl-1011. De 32D cl-3 celler viste sig at formere sig i IL-3 og gennemgå neutrophilic differentiering efter behandling med granulocyt koloni stimulation faktor (G-CSF)10. Tværtimod 32D cl-10 celler, mens at være IL-3 afhængige, oprindeligt ikke differentiere som svar på G-CSF behandling. I 1995 transduced gruppe af Dr. Ivo Touw Retroviralt 32D cl-10 celler med vildtype og mutante former for G-CSF receptor (G-CSF-R), for at identificere funktionelt vigtige områder af denne receptor11. Denne undersøgelse resulterede i generation af 32 d/G-CSF-R celler, som er ligeledes afhængige af IL-3, men inden for 6-10 dage efter udskiftning af IL-3 med G-CSF, stop celler for at formere sig og uigenkaldeligt differentiere i modne neutrofiler. Disse egenskaber gør 32D cl-3 og 32 d/G-CSF-R celler forenklede modeller af murine neutrophilic differentiering, der kan tilpasses af to veldefinerede vækst og differentiering faktorer - IL-3 og G-CSF. I løbet af de sidste årtier har flere grupper brugt 32 d/G-CSF-R celler til at studere rollen af bestemte gener i spredning og differentiering af myeloide celler i kultur12,13,14,15 , 16, og at studere G-CSF signaling17,18. Vigtigere, resultaterne ved hjælp af denne cellelinie korreleret med oplysninger indhentet med primærelementer og Transgene mus16,19,20,21. Vi mener derfor, at 32 d/G-CSF-R celler, er et almindeligt anvendte og veletableret model, udgør et værdifuldt system til at studere myeloide differentiering, som kan anvendes parallelt med andre tilgange tackle dette spørgsmål.
Her, detaljerede protokoller der beskriver håndtering af 32 d/G-CSF-R cellelinie, som dækker ekspansion, differentiering og vurdering af spredning og differentiering af disse celler er præsenteret. Detaljerede oplysninger for gensplejsning af 32 d/G-CSF-R celler, enten ved retroviral eller lentiviral transduktion samt protokoller for virus titrering leveres. Derudover findes flere repræsentative resultater, der viser potentielle anvendelser af 32 d/G-CSF-R celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

Forståelse af den hæmatopoietisk stilk og stamfader cellebiologi har stor betydning for regenerativ medicin og behandling af hematological patologier. Trods de mest relevante data, der kan erhverves ved hjælp af i vivo modeller eller primære kulturer, begrænser den lave overflod af hæmatopoietisk stilk og stamfader celler betydeligt puljen af egnede teknikker til deres undersøgelse. Derfor giver brugen af cellelinjer tilstrækkelig produktion af biologisk materiale for udførelsen af screeninger eller assays, der kræver stor celle numre. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse, udlæsning og fortolkning af spredning og differentiering assays, der anvendes til undersøgelse af processerne i myelopoiesis og neutrophilic differentiering. Disse eksperimenter ansætte linjen 32 d/G-CSF-R cytokin afhængige murine myeloide celler, som besidder evnen til at formere sig i nærværelse af IL-3 og differentiere i G-CSF. Vi leverer optimerede protokoller til håndtering af 32 d/G-CSF-R celler og diskutere store faldgruber og ulemper, der kan kompromittere beskrevet assays og forventede resultater. Denne artikel indeholder desuden protokoller til lentiviral og retroviral produktion, titrering og transduktion af 32 d/G-CSF-R celler. Vi demonstrere, at genmanipulation af disse celler kan være ansat til held udføre funktionelle og molekylære undersøgelser, som kan supplere resultaterne med primære hæmatopoietisk stilk og stamfader celler eller i vivo modeller.

Spredning og differentiering af celler, 32 d/G-CSF-R
For at vurdere udbredelsen af 32 d/G-CSF-R celler under pro-proliferativ og Pro differentiering, var 32 d/G-CSF-R celler dyrkes i medier indeholdende IL-3 og G-CSF, henholdsvis. Det blev observeret, at celler dyrkes i IL-3 indeholdende medium (10 ng/mL) deler ca hver 24 timer (figur 2A). Ved udskiftning af IL-3 med G-CSF (100 ng/mL) spredning gradvis...

Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Her præsenteres detaljerede protokoller for dyrkning murine myeloide prækursorer 32 d/G-CSF-R cellelinie, udfører virusinfektioner og udføre spredning og differentiering assays. Denne cellelinje er egnet til at studere myeloide celle udvikling og rollen af gener af interesse i myeloide cellevækst og neutrophilic differentiering.

Spredning og differentiering af Murine myeloide prækursorer 32 d/G-CSF-R celler

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produktion og anvendelse af Lentivirus til selektivt at transducere Primary oligodendrocyt precursorceller for<em&gt; In vitro</em&gt; myelinering Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D organotypisk co-kultur Model Støtte medullær thymusepitelmonolag celleproliferation, differentiering og Promiskuøs Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Forberedelse og Kultur Myogenic precursorceller / Primær Myoblaster af skeletmuskulatur af Voksen og Aged Mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiering af humane mesenkymale stamceller i funktionel Cardiomyocyte-lignende celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Hurtig påvisning af udviklingsforstyrrelser fænotyper i menneskelige neurale forløber celler (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, kultur og differentiering af knoglemarven stromale celler og osteoklast ophav fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Afledning og differentiering af Canine æggestokkene mesenkymale stamceller

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering af humane pluripotente stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...