Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

המחברים תודה פרופסור ruud ב Delwel פרופסור איבו Touw שסיפקו שורת התאים 32D/G-CSF-R, ואת פרופסור דניאל ג Tenen סיפק לנו שורת התאים Bosc23. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הסוכנות מענק של הרפובליקה הצ'כית (GACR 15-03796S ו- GACR 17-02177S) כדי MA-J, תמיכה מן המכון לגנטיקה מולקולרית האקדמיה למדעים של הצ'כית (RVO 68378050) MA-J, מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 341015) מ אוניברסיטת קארל בפראג ח"כ ולאחר מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 1278217) מ אוניברסיטת קארל בפראג לתחנת משטרה.

הערה: השלבים המתאר התרחבות, בידול, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R מוצגים להלן.
1. הכנה
<ol><li>הכנה מדיה
	<ol>
<li>להכין 250 מ של תרבות בינוני: בינוני 1640 RPMI (רוזוול, מכון ממוריאל פארק) בתוספת 10% חום להשבית FBS (סרום שור עוברית) ואיל מאתר-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>לחלופין, השתמש IL-3 מתוצרת בית. כדי ליי...

הבחירה של מדגם ניסיוני הוא אחד הנושאים המרכזיים במחקר. למרות ראשי תאים בעלי חיים ועל האדם הם האמינו כדי לייצר את הנתונים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית, מודלים אלה עשויה להיות כרוכה חששות אתיים, הקשורים לעתים קרובות עם יקרים ו/או מתוחכם בידוד/culturing הליכים. ראשי תאים מוגבלים במספרים, קשה ?...

האוכלוסייה גזע ו קדמון hematopoietic מספקת האורגניזם עם מגוון גדול של תאים בוגרים, כולל תאים מן השושלת מיאלואידית (נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים, ו ומונוציטים). תהליך שמניע את הייצור של התאים מיאלואידית מתאי גזע hematopoietic ידוע בשם myelopoiesis, ייצור מספיק של התאים מיאלואידית בוגרים בתגובה לדרישות השוק המשתנות הוא תנאי הכרחי להתמודדות נכונה של האורגניזם עם הלחץ תנאים, כגון זיהומים ואובדן דם. ההפקה מספקת של התאים מיאלואידית בוגרים עלול להוביל לחוסר יכולת לחסל פתוגנים, קרישת דם מופחתת, ו אחרים סכנת חיים בתנאים1,2. בנוסף, שינויים בהתפתחות השושלת מיאלואידית עשוי גם להיות מזוהה עם hematological ממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)3. שינויים myelopoiesis עלולה להתרחש מסיבות שונות, כגון פגמים משטח קולטני התא4, ביטויים מסולף של גורמי שעתוק5, ליקויי איתות המסלולים6, מוטציות וכתוצאה מכך היווצרות / הפעלה של oncogenes7או איון של הגידול משתיק קול גנים8.
פותחו שיטות שונות ללמוד פיתוח מיאלואידית, ואף להעריך את ההשפעה של שינויים גנטיים מסוימים בתהליך זה. גישות נפוצות המשמשות ללימוד myelopoiesis לערב ראשי התאים ואת העכברים הטרנסגניים. על פי מודלים אלה לאפשר רכישת נתונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, יש להם מגבלות מסוימות. השימוש העיקרי תאים מפגשים מספר מצומצם של תאים, תקופה מוגבלת של תרבות, צמצום האפשרויות לשינוי גנים וניתוח ביולוגי או ביוכימי עוקבות. העכברים הטרנסגניים יקרות ודורשים מידה סבירה של הצדקה ביולוגית. בנוסף, עבודה עם מודלים ויוו מוסיף דרגת המורכבות לתוך להבין את התפקיד של הגן עניין בתהליך נתונה. לכן, גישות אלטרנטיביות כדי לעקוף את מגבלות אלה נדרשים. שורות תאים יש יתרונות עוררין: (1) שהם בעלי יכולת התפשטות ללא הגבלה המאפשרת יצירת מספיק חומר עבור מחקרים ביוכימיים וביולוגיים, (2) הם רגישים מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט, ביטוי), (3) העלות היא נמוכה יחסית, (4) הם לאפשר מידה מסוימת של הפשטה ביולוגי הנדרשים גישות ניסיוניות מסוימים.
הורים IL-3 (אינטרלוקין-3) 32D תלויה שורת התאים הוקמה בשנת 1983 על ידי Greenberger ועמיתיו על-ידי זיהום של תאים במח העצם של עכברים C3H/HeJ עם החבר לוקמיה מאתר וירוס9. מספר שיבוטים 32D תוארו בספרות: cl-239, cl-310ו- cl-1011. התאים cl-3 32D הוצגו כדי להתרבות IL-3 עוברים התמיינות neutrophilic על טיפול עם מושבת גרנולוציט גירוי פקטור (G-CSF)10. להיפך, 32D cl-10 תאים, תוך כדי להיות איל-3 תלוי במקור היו לא המבדילים בתגובה לטיפול G-CSF. בשנת 1995 הקבוצה של ד ר איבו Touw transduced retrovirally 32D cl-10 תאים עם פראי סוג וצורות מוטציה של קולטן G-CSF (G-CSF-R), על מנת לזהות אזורים חשיבות תפקודית של קולטן זה11. מחקר זה הניב בדור של התאים 32D/G-CSF-R, אשר תלויות באופן דומה ב- IL-3, אבל בתוך 6 עד 10 ימים לאחר החלפה של IL-3 עם G-CSF, תאים להפסיק להתרבות, בלתי הפיך להתמיין נויטרופילים בוגרת. מאפיינים אלה להפוך 32D cl-3 תאים 32D/G-CSF-R מודלים מפושטת של התמיינות neutrophilic מאתר זה יכול להיות מווסת על ידי שני גורמים בידול - IL-3 ו- G-CSF וצמיחה מוגדרים היטב. בעשורים האחרונים קבוצות מרובות השתמשו 32D/G-CSF-R תאים ללמוד את התפקיד של גנים מסוימים התפשטות ו התמיינות של התאים מיאלואידית תרבות12,13,14,15 , 16, ללמוד G-CSF איתות17,18. חשוב לציין, התוצאות המתקבלות באמצעות הקו תא בקורלציה עם נתונים שהושגו עם ראשי תאים, העכברים הטרנסגניים16,19,20,21. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי תאים 32D/G-CSF-R, להיות דוגמנית בשימוש נרחב ומבוסס היטב, מייצגים מערכת יקר ללמוד התמיינות תאים מיאלואידים אשר יכול לשמש במקביל עם גישות אחרות מיעון השאלה הזאת.
. הנה, פרוטוקולים מפורט המתאר טיפול של הקו תא 32D/G-CSF-R, איזה כיסוי הרחבה בידול, הערכה של התפשטות, התמיינות של תאים אלה מוצג. מידע מפורט על ההנדסה הגנטית של תאים 32D/G-CSF-R, או על ידי התמרה חושית retroviral או lentiviral, וכן פרוטוקולים עבור טיטור וירוס הינם מסופקים. בנוסף, ניתנים מספר תוצאות נציג המדגימים יישומים אפשריים של תאים 32D/G-CSF-R.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

ההבנה של הביולוגיה תא גזע, קדמון hematopoietic יש השלכות חשובות על רפואה רגנרטיבית והטיפול של פתולוגיות hematological. למרות הנתונים הרלוונטיים ביותר שניתן לרכשה באמצעות מודלים ויוו או תרבויות העיקרי, שפע נמוכה של תאי גזע וקדמון hematopoietic מגבילה במידה ניכרת את הבריכה של טכניקות מתאימים עבור החקירה שלהם. לכן, השימוש של שורות תאים מאפשרת ייצור מספיק של חומר ביולוגי עבור הביצועים של הקרנות או מבחני הדורשות תאים גדולים מספרים. כאן אנו מציגים תיאור מפורט, בדיקה, פרשנות של מבחני התפשטות ובידול אשר משמשים לחקירה של תהליכים מעורבים myelopoiesis ובידול neutrophilic. ניסויים אלה מעסיקים הקו מהתא מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R ציטוקינים, אשר ברשותה את היכולת להתרבות בנוכחות IL-3, להבדיל ב- G-CSF. אנו מספקים מותאם פרוטוקולים לטיפול 32D/G-CSF-R תאים, לדבר על החסרונות העיקריים והחסרונות שיכול לסכן את מבחני שתואר ואת התוצאות הצפויות. בנוסף, מאמר זה מכיל פרוטוקולים עבור ייצור lentiviral, retroviral טיטור, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R. נדגים כי מניפולציה גנטית של תאים אלה יכול להיות מועסק כדי לבצע בהצלחה לימודי פונקציונלי ומולקולרית, אשר יוכלו להשלים את התוצאות המתקבלות עם ראשי hematopoietic תאי גזע וקדמון או מודלים ויוו .

התפשטות ובידול של תאים 32D/G-CSF-R
כדי להעריך את התפשטות של תאים 32D/G-CSF-R בתנאים pro-proliferative ובידול פרו, תאים 32D/G-CSF-R היו תרבותי בתקשורת המכיל IL-3 ו- G-CSF, בהתאמה. זה היה ציין כי חלוקת התאים תרבותי IL-3 המכיל בינוני (10 ng/mL) כ כל 24 שעות (איור 2 א)...

Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

כאן מוצגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים culturing הקו תא 32D/G-CSF-R מאתר קודמן מיאלואידית, ביצוע זיהומים נגיפיים של ביצוע מבחני התפשטות ובידול. הקו תא מתאים ללמוד פיתוח התאים מיאלואידית, ואת התפקיד של גנים של עניין גדילת התאים מיאלואידית ובידול neutrophilic.

התפשטות ובידול של קודמן מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R תאים

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...