Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Forfatterne takker Prof Ruud Delwel og Prof Ivo Touw for å gi oss med 32D/G-CSF-R cellen linje og Prof Daniel G. Tenen for å gi oss med Bosc23 cellen linje. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd av Grant byrået i Tsjekkia (GACR 15-03796S og GACR 17-02177S) til MA-J, støtte fra Institutt for molekylær genetikk av tsjekkiske Academy of Sciences (RVO 68378050) til MA-J, et GA UK fellesskap (prosjekt nr. 341015) fra Charles University i Praha MK, og et GA UK fellesskap (prosjekt nr. 1278217) fra Charles University i Praha til PD.

Merk: Trinn beskriver ekspansjon, differensiering, og signaltransduksjon 32D/G-CSF-R celler presenteres nedenfor.
1. forberedelse
<ol><li>Media forberedelse
	<ol>
<li>Forberede 250 mL kultur medium: RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium med 10% varme inaktivert FBS (fosterets bovin serum) og murine IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>Alternativt bruke hjemmelaget IL-3. Å lage hjemmelaget IL-3, transduce HEK293 celler med IL-3 uttrykke vektor og samle IL-3 inneholder super...

Valg av en eksperimentell modell er en av de viktigste spørsmålene i forskning. Om primære dyr og menneskelige celler antas å produsere biologisk relevante data, disse modellene kan innebære Etiske bekymringene og er ofte forbundet med dyr og/eller sofistikert isolasjon/dyrking prosedyrer. Primær celler er begrenset i antall og det er vanskelig å genetisk manipulere dem. I tillegg representerer primære cellene en heterogen befolkning består av ulike celletyper som kan komplisere data tolkning29...

Blodkreft stilk og stamfar befolkningen leverer organisme med et stort utvalg av modne cellene, inkludert celler fra myelogen linjen (nøytrofile, eosinofile, basofile og monocytter). Prosessen som kjører produksjon av myeloide celler fra blodkreft stamceller er kjent som myelopoiesis, og tilstrekkelig produksjon av modne myeloide celler i svar på endrede krav er en forutsetning for riktig mestring av organismen stress forhold, for eksempel infeksjoner og blodtap. Utilstrekkelig produksjon av modne myeloide celler kan føre til manglende evne til å eliminere patogener, redusert blodpropp og andre livstruende forhold1,2. I tillegg kan endringer i myelogen avstamning utvikling også være knyttet til Hematologisk malignitet, som akutt myelogen leukemi (AML)3. Endringer i myelopoiesis kan skyldes ulike årsaker som mangler i cellen overflate reseptorer4, endret uttrykk for transkripsjon faktorer5, svekket signalnettverk trasé6, mutasjoner som resulterer i dannelsen / aktivering av oncogenes7eller inaktivering av tumor suppressor gener8.
Ulike metoder har blitt utviklet for å studere myelogen utvikling og vurdere effekten av konkrete genetiske endringer i denne prosessen. Felles tilnærminger brukt for å studere myelopoiesis innebære primære celler og transgene mus. Selv om disse modellene at oppkjøpet av biologisk relevante data, har de visse begrensninger. Bruk av primære celler møter et begrenset antall celler og en begrenset periode av kultur, begrense mulighetene for å endre genuttrykk og påfølgende biologiske eller biokjemiske analyse. Transgene mus er kostbare og krever en rimelig grad av biologisk begrunnelse. I tillegg gir arbeider med i vivo modeller en grad av kompleksitet til forståelsen av en genet av interesse i en gitt prosess. Derfor er alternative tilnærminger til å omgå disse begrensningene nødvendig. Linjer har udiskutable fordeler: (1) de har ubegrenset spredning kapasitet som gir genererer nok materiale for biokjemisk og biologiske studier, (2) de er utsatt for genetisk manipulasjon (knockdown, knockout, overuttrykte), (3) er relativt lav, og (4) de tillate en grad av biologiske forenkling kreves i visse eksperimentelle tilnærminger.
Den foreldre IL-3 (Interleukin-3) avhengige 32D celle linje ble etablert i 1983 av Greenberger og kolleger av infeksjon beinmargen celleområde fra C3H/HeJ mus med venn murine leukemi virus9. Flere 32D kloner ble beskrevet i litteraturen: cl-239, cl-310og cl-1011. 32D cl-3 cellene ble vist å spre seg i IL-3 og gjennomgå neutrophilic differensiering på behandling med granulocytt-colony stimulering faktor (G-CSF)10. Tvert imot, var 32D cl-10 celler, samtidig som IL-3 avhengige, opprinnelig ikke skille svar på G-CSF behandling. I 1995 transduced gruppen av Dr. Ivo Touw retrovirally 32D cl-10 celler med wild type og mutant former for G-CSF reseptor (G-CSF-R), for å identifisere funksjonelt viktige regioner i denne reseptoren11. Denne studien resulterte i generasjon av 32D/G-CSF-R celler som er tilsvarende avhengige IL-3, men innen 6 til 10 dager etter utskifting av IL-3 med G-CSF, celler slutte å spre og differensiere irreversibelt til modne nøytrofile. Disse egenskapene gjør 32D cl-3 og 32D/G-CSF-R celler forenklet modeller av murine neutrophilic differensiering som kan være modulert av to veldefinerte vekst og differensiering faktorer - IL-3 og G-CSF. I løpet av de siste tiårene har flere grupper brukt 32D/G-CSF-R celler for å studere rollen til bestemte gener i spredning og differensiering av myeloide celler i kultur12,13,14,15 , 16, og å studere G-CSF signalnettverk17,18. Viktigst, resultatene som oppnås ved å bruke denne cellen: korrelert med data innhentet primære celler og transgene mus16,19,20,21. Derfor tror vi at 32D/G-CSF-R celler, blir mye brukt og veletablerte modell, representerer en verdifull system å studere myelogen differensiering som kan brukes parallelt med andre tilnærminger adressering denne spørsmål.
Her, detaljert protokoller som beskriver håndtering av 32D/G-CSF-R cellen linje, som dekker ekspansjon differensiering og vurdering av spredning og differensiering av disse cellene er presentert. Detaljert informasjon for genetisk modifisering av 32D/G-CSF-R celler, enten ved retroviral eller lentiviral signaltransduksjon, samt protokoller for virus titrering er gitt. I tillegg tilbys flere representant resultater som viser potensielle anvendelser av 32D/G-CSF-R celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

Forståelse av blodkreft stilk og stamfar cellebiologi har viktige implikasjoner for regenerativ medisin og behandling av Hematologisk patologi. Til tross for de mest relevante dataene som kan erverves i vivo modeller eller primære kulturer, begrenser lav overflod av blodkreft stilk og stamfar celler vesentlig utvalget av egnet teknikker for etterforskningen. Bruken av linjer kan derfor tilstrekkelig produksjon av biologisk materiale til visninger eller analyser som krever stor cellen tallene. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse, avlesning og tolkning av spredning og differensiering analyser som brukes for etterforskningen av prosesser i myelopoiesis og neutrophilic differensiering. Disse eksperimentene ansette 32D/G-CSF-R cytokin underordnet murine myelogen celle linjen, som besitter evnen til å spre seg i nærvær av IL-3 og differensiere i G-CSF. Vi tilbyr optimalisert protokoller for håndtering 32D/G-CSF-R celler og diskutere store fallgruver og ulemper som kan kompromittere beskrevet analyser og forventede resultater. I tillegg inneholder denne artikkelen protokoller for lentiviral og retroviral titrering og signaltransduksjon 32D/G-CSF-R celler. Vi viser at genetisk manipulasjon av disse cellene kan brukes til å utføre funksjonelle og molekylære studier som kan utfylle resultatene med primære blodkreft stilk og stamfar celler eller i vivo modeller.

Spredning og differensiering av 32D/G-CSF-R celler
For å vurdere spredning av 32D/G-CSF-R celler under pro-proliferativ og Pro differensiering, ble 32D/G-CSF-R celler kultivert i mediet som inneholder IL-3 og G-CSF, henholdsvis. Det ble observert at cellene kultivert i IL-3 inneholder medium (10 ng/mL) deler ca hver 24 h (figur 2A). Ved utskifting av IL-3 med G-CSF (100 ng/mL) spredning gradvis bremse...

Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Her presenteres detaljert protokoller for dyrking murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celle linjen utfører virusinfeksjoner og gjennomføre spredning og differensiering analyser. Denne cellen linjen er egnet for å studere myelogen celle utvikling og rollen av gener av interesse myelogen cellevekst og neutrophilic differensiering.

Spredning og differensiering av Murine myelogen forløper 32D/G-CSF-R celler

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produksjon og bruk av Lentivirus til Selektivt transduce Primær oligodendrocyte forløper celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; myelination Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D organotypiske Co-kultur Modell Støtte Medullary Thymus- epitelcelleproliferasjon, Differensiering og Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Utarbeidelse og kultur myogenisk forloperceller / Primær myoblasts fra Skeletal Muscle of Adult og Gamle mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differensiering av menneskelige stamceller i funksjonelle Cardiomyocyte-lignende celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Rask påvisning av Neurodevelopmental fenotyper i menneskelig Neural Precursor celler (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolasjon, kultur og differensiering av benmarg Stromal celler og Osteoclast Progenitors fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Avledning og differensiering av hjørnetann Ovarian Mesenchymal stamceller

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...