Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Авторы благодарят профессор Рууд Delwel и профессор Иво Touw за предоставленную нам с линией клеток 32D/G-CSF-R и профессор Даниэль G. Tenen за предоставление нам с линией клеток Bosc23. Эта работа была поддержана грантов грант агентства Чешской Республики (GACR 15-03796S и GACR 17-02177S) для ма-J, поддержки от Института молекулярной генетики Чешской академии наук (РВО 68378050) ма-j, Стипендия Великобритании GA (проект № 341015) от Карлова университета в Праге МК, и Стипендия Великобритании GA (проект № 1278217) от Карлова университета в Праге, PD.

Примечание: Шаги, описывающих расширения, дифференциации и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток представлены ниже.
1. Подготовка
<ol><li>Подготовка средств массовой информации
	<ol>
<li>Подготовка 250 мл питательной среды: среднего 1640 RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт), допол...

Выбор экспериментальной модели является одним из основных вопросов в области научных исследований. Хотя считается, что основной клетки животных и человека производят наиболее биологически соответствующих данных, эти модели может включать этические проблемы и часто связаны с дорогим...

Гемопоэтических стволовых и прогениторных населения поставляет в организм с большим диапазоном зрелых клеток, включая клетки миелоидного lineage (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и моноцитов). Процесс, который управляет производства миелоидных клеток от гемопоэтических стволовых клеток известен как myelopoiesis, и надлежащего производства зрелой миелоидных клеток в ответ на меняющиеся требования является необходимым условием для надлежащего решения проблем организма с стресса условия, такие как инфекции и потери крови. Недостаточное производство зрелых миелоидных клеток может привести к неспособности устранить патогенов, свертываемость крови, снижение и других угрожающих жизни условиях1,2. Кроме того изменения в развитии миелоидного линии также могут быть связаны с гемобластозами, например, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)3. Изменения в myelopoiesis может произойти из-за различных причин, таких, как дефекты в ячейке поверхности рецепторы4изменены выражения факторов транскрипции5, нарушениями сигнальные пути6, мутации, что приводит к формированию / Активация онкогенов7или инактивации генов усмирителя тумора8.
Различные методы были разработаны для изучения миелоидного развития и оценить воздействие конкретных генетических изменений в этот процесс. Общие подходы, используемые для изучения myelopoiesis связаны главные ячейки и трансгенных мышей. Хотя эти модели позволяют приобретение биологически соответствующих данных, они имеют определенные ограничения. Использование начальной клеток встречает ограниченное количество клеток и ограниченного периода культуры, сужение возможностей для изменения экспрессии генов и последующие биологические или биохимический анализ. Трансгенных мышей являются дорогостоящими и требуют разумную степень биологического обоснования. Кроме того работа с моделями в vivo добавляет степень сложности в понимании роли ген интереса в данном процессе. Таким образом необходимы альтернативные подходы, чтобы обойти эти ограничения. Линии клетки имеют неоспоримые преимущества: (1) они обладают потенциалом неограниченное распространение, что позволяет генерировать достаточно материала для биохимических и биологических исследований, (2) они чувствительны к генетической манипуляции (нокдаун, нокаут, Гиперэкспрессия), (3) стоимость сравнительно низка, и (4) они позволяют степень биологического упрощение в некоторых экспериментальных подходов.
Родительский Ил-3 (интерлейкинов-3) зависимых 32D клеточная линия была учреждена в 1983 году Greenberger и его коллеги инфекции клеток костного мозга от мышей C3H/HeJ друг мышиных лейкемии Вирус9. Несколько 19 d клоны были описаны в литературе: cl-239, cl-310и11cl-10. 36 d cl-3 клетки были продемонстрированы размножаться в ил-3 и пройти нейтрофильных дифференциация по обращению с гранулоцитов колонии стимуляции фактор (Г-КСФ)10. Напротив 27 d cl-10 клеток, будучи зависимой Ил-3, первоначально не были дифференциации в ответ на лечение Г-КСФ. В 1995 году группа д-р Иво Touw retrovirally преобразованы 30 d cl-10 клеток с дикого типа и мутантов формы рецептора Г-КСФ (G-CSF-R), с тем чтобы определить функционально важных регионах этот рецептор11. Это исследование привело к генерации клеток 32D/G-CSF-R, которые аналогичным образом зависят Ил-3, но в пределах 6-10 дней после замены Ил-3 с G-CSF, клетки перестают размножаться и необратимо дифференцироваться в Зрелые нейтрофилы. Эти свойства делают 30 d cl-3 и упрощенные модели клетки 32D/G-CSF-R мышиных нейтрофильных дифференциации, которая может быть модулированные два четко определенных роста и дифференциации факторов - Ил-3 и G-CSF. В течение последних десятилетий несколько групп использовали 32D/G-CSF-R клетки для изучения роли конкретных генов в распространение и дифференцировку миелоидных клеток в культуре12,13,14,15 , 16и для изучения Г-КСФ, сигнализируя17,18. Важно отметить, что результаты, полученные с помощью этой линии клетки коррелирует с данных, полученных с первичные элементы и трансгенных мышей16,19,,2021. Следовательно мы считаем, что 32D/G-CSF-R клетки, будучи широко используется и устоявшиеся модели, представляют собой ценный системы для изучения миелоидного дифференциация, которая может использоваться параллельно с другими подходами, рассмотреть этот вопрос.
Здесь является представил подробные протоколы, описывающие обработку 32D/G-CSF-R клеточной линии, которой расширения покрытия, дифференциация и оценки распространения и дифференциации этих клеток. Подробная информация для генетической модификации 32D/G-CSF-R клеток, либо ретровирусных или лентивирусные трансдукции, а также протоколы для титрования вирус предоставляются. Кроме того предоставляются несколько представительных результаты, которые демонстрируют возможности применения клеток 32D/G-CSF-R.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

Понимание гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток биологии имеет важные последствия для регенеративной медицины и лечения гематологических патологий. Несмотря на наиболее актуальные данные, которые могут быть приобретены с использованием модели в естественных условиях или первичных культур низкая обилие гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток значительно ограничивает круг подходящих методов для их расследования. Таким образом использование клеточных линий позволяет достаточно производства биологического материала для выполнения показы или анализов, которые требуют числа крупных клеток. Здесь мы представляем, подробное описание, индикация и интерпретации пролиферации и дифференцировки анализов, которые используются для исследования процессов в myelopoiesis и нейтрофильных дифференциации. Эти эксперименты используют 32D G-CSF-реляционный cytokine зависимых murine миелоидного клеток линии, которая обладает способностью размножаться в присутствии Ил-3 и дифференцировать в G-CSF. Мы предлагаем оптимизированный протоколы для обработки клеток 32D/G-CSF-R и обсудить основные недостатки и недостатки, которые могли бы скомпрометировать описанных анализов и ожидаемые результаты. Кроме того эта статья содержит протоколы для производства лентивирусные и антиретровирусного лечения, титрование и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток. Мы демонстрируем, что генетические манипуляции этих клеток могут быть использованы для успешного выполнения функциональных и молекулярные исследования, которые могут дополнять результаты, полученные с основной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток или модели в естественных условиях .

Пролиферации и дифференцировки клеток 32D/G-CSF-R
Чтобы оценить пролиферацию клеток 32D/G-CSF-R условиях pro пролиферативных и про дифференциации, 32D/G-CSF-R клетки были культивировали в средствах массовой информации, содержащие Ил-3 и G-CSF, соответств?...

Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Здесь представлены подробные протоколы для культивирования 32D/G-CSF-R клеточная линия murine миелоидного прекурсоров, вирусных инфекций и проведение анализов пролиферации и дифференцировки. Эта линия клетки подходит для изучения развития миелоидных клеток и роль генов интерес к росту миелоидных клеток и нейтрофильных дифференциации.

Пролиферации и дифференцировки Murine миелоидного прекурсоров 32D/G-CSF-r клетки

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для<em&gt; In Vitro</em&gt; миелинизации Анализы

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Быстрое обнаружение фенотипов исходам в клетках человека нейронных прекурсоров (НПС)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Дифференцирование и дифференциации собак яичников мезенхимальных стволовых клеток

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...