Name: proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka Prof. Ruud Delwel och Prof. Ivo Touw för att förse oss med 32D/G-CSF-R cell-linjen, och Prof. Daniel G. Tenen för att förse oss med raden Bosc23 cell. Detta arbete stöds av bidrag för Grant byrån i Tjeckien (GACR 15-03796S och GACR 17-02177S) till MA-J, stöd från Institutet för molekylär genetik av den tjeckiska vetenskapsakademin (RVO 68378050) till MA-J, ett GA UK stipendium (projekt nr 341015) från Charles University i Prag till MK och en GA UK fellowship (projekt nr 1278217) från Charles University i Prag till PD.

Obs: Steg som beskriver expansion, differentiering och transduktion 32D/G-CSF-R celler presenteras nedan.
1. beredning
<ol><li>Media förberedelse
	<ol>
<li>Bereda 250 mL odlingsmedium: RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium kompletteras med 10% värme inaktiverat FBS (fetalt bovint serum) och murint IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>Alternativt använda hemgjorda IL-3. Att producera hemgjorda IL-3, transduce HEK293 celler med IL-3 uttrycker vektor och samla IL-3 innehål...

Valet av en experimentell modell är en av de viktigaste frågorna i forskning. Även om primära djurs och människors celler tros producera mest biologiskt relevanta data, dessa modeller kan innebära etiska betänkligheter och förknippas ofta med dyra eller sofistikerade isolering/odling förfaranden. Primära celler är begränsade i antal och det är svårt att genetiskt manipulera dem. Dessutom utgör primära celler en heterogen befolkning består av olika celltyper som kan komplicera data tolkning<sup class="xre...

Hematopoetiska stamceller och stamceller befolkningen levererar organismen med ett stort utbud av mogna celler, inklusive celler från myeloisk härstamning (neutrofiler, eosinofiler, basofiler och monocyter). Processen som driver produktion av myeloida celler från hematopoetiska stamceller kallas myelopoiesis, och tillräcklig produktion av mogen myeloida celler som svar på förändrade krav är en förutsättning för korrekt coping av organismen med stress förhållanden, såsom infektioner och blodförlust. Otillräcklig produktion av mogen myeloida celler kan leda till oförmåga att eliminera patogener, minskad koagulation och andra livshotande tillstånd1,2. Dessutom kan förändringar i myeloisk härstamning utveckling också vara associerade med hematologiska maligniteter, såsom akut myeloisk leukemi (AML)3. Förändringar i myelopoiesis kan uppstå på grund av olika skäl, såsom fel i cell surface receptorer4, förändrat uttryck av transkription faktorer5, nedsatt signalering vägar6, mutationer resulterar i bildandet / aktivering av onkogener7eller inaktivering av tumör suppressor gener8.
Olika metoder har utvecklats för att studera myeloisk utveckling och bedöma effekten av specifika genetiska förändringar i denna process. Gemensamma metoder för att studera myelopoiesis involverar primärceller och transgena möss. Om dessa modeller tillåter förvärv av biologiskt relevanta data, har de vissa begränsningar. Användning av primära celler påträffar ett begränsat antal celler och en begränsad period av kultur, förträngning möjligheterna att påverka genuttryck och efterföljande biologisk eller biokemisk analys. Transgena möss är kostsamma och kräver en rimlig grad av biologiska skäl. Arbeta med i vivo modeller lägger dessutom till en grad av komplexitet till förstå rollen som en gen av intresse för en viss process. Därför behövs alternativa sätt att kringgå dessa begränsningar. Cellinjer har obestridliga fördelar: (1) de har obegränsad spridning kapacitet som gör att generera tillräckligt med material för biokemiska och biologiska studier, (2) de är mottagliga för genetiska manipulationer (knockdown, knockout, överuttryck), (3) kostnaden är relativt låg, och (4) de tillåter en viss grad av biologiska förenkling krävs i vissa experimentella metoder.
Den föräldra IL-3 (Interleukin-3) beroende 32D cellinje grundades 1983 av Greenberger och kollegor av infektion i benmärgsceller från C3H/HeJ möss med vän murina leukemi virus9. Flera 32D kloner har beskrivits i litteraturen: cl-239, cl-310och cl-1011. 32D cl-3 cellerna visades att föröka i IL-3 och genomgå neutrofil differentiering vid behandling med granulocytkolonistimulerande stimulering faktor (G-CSF)10. Tvärtom 32D cl-10 celler, samtidigt vara IL-3 anhörigen, ursprungligen inte skilja i G-CSF behandlingssvaret. 1995 sensorik gruppen av Dr. Ivo Touw retrovirally 32D cl-10 celler med vildtyp och muterade former av G-CSF-receptorn (G-CSF-R), för att identifiera funktionellt viktiga regioner av denna receptor11. Denna studie resulterade i generation av 32D/G-CSF-R cellerna, vilket är på samma sätt beroende av IL-3, men inom 6 till 10 dagar efter byte av IL-3 med G-CSF, stoppa celler för att föröka sig och differentiera irreversibelt till mogna neutrofiler. Dessa egenskaper gör 32D cl-3 och 32D/G-CSF-R celler förenklade modeller av murina neutrofil differentiering som kan moduleras av två väldefinierade tillväxt och differentiering faktorer - IL-3 och G-CSF. Under de senaste decennierna har flera grupper använt 32D/G-CSF-R celler för att studera rollen av vissa gener i proliferation och differentiering av myeloida celler i kultur12,13,14,15 , 16, och att studera G-CSF signalering17,18. Ännu viktigare, de resultat som erhålls med hjälp av denna cellinje korrelerade med data som erhållits med primära celler och transgena möss16,19,20,21. Följaktligen anser vi att 32D/G-CSF-R celler, ett allmänt använt och väletablerad modell, utgör ett värdefullt system att studera myeloisk differentiering som kan användas parallellt med andra metoder att ta itu med denna fråga.
Här, detaljerade protokoll som beskriver hanteringen av de 32D/G-CSF-R cellinje, där locket expansion, differentiering och bedömning av proliferation och differentiering av dessa celler presenteras. Detaljerad information för genetisk modifiering av 32D/G-CSF-R celler, antingen genom retrovirala eller lentiviral transduktion, samt protokoll för virustitrering tillhandahålls. Dessutom finns flera representativa resultat som visar potentiella tillämpningar av 32D/G-CSF-R celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

Förståelse av hematopoetiska stamceller och stamceller cellbiologi har viktiga konsekvenser för regenerativ medicin och behandling av hematologiska sjukdomar. Trots de mest relevanta data som kan förvärvas med i vivo modeller eller primära kulturer, begränsar låga överflödet av hematopoetiska stamceller och stamceller celler avsevärt poolen av lämpliga tekniker för sin utredning. Därför, användningen av cellinjer tillåter tillräcklig produktion av biologiskt material för utförandet av filmvisningar eller analyser som kräver stora cell nummer. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning, avläsning och tolkning av proliferation och differentiering analyser som används för utredning av processer för myelopoiesis och neutrofil differentiering. Dessa experiment anställa 32D/G-CSF-R cytokin beroende murina myeloiska celler linjen, som besitter förmågan att föröka sig i närvaro av IL-3 och differentiera i G-CSF. Vi tillhandahåller optimerade protokoll för hantering av 32D/G-CSF-R celler och diskutera viktiga fallgropar och nackdelar som skulle kunna äventyra den beskrivna analyser och förväntade resultat. Denna artikel innehåller dessutom protokoll för lentiviral och retrovirala produktion, titrering och transduktion 32D/G-CSF-R celler. Vi visar att genmanipulation av dessa celler kan användas för att framgångsrikt utföra funktionella och molekylära studier, som kan komplettera resultaten med primära hematopoetiska stamceller och stamceller celler eller i vivo modeller.

Proliferation och differentiering av 32D/G-CSF-R celler
För att bedöma spridningen av 32D/G-CSF-R celler pro-proliferativ och Pro differentiering villkor, odlades 32D/G-CSF-R celler i media som innehåller IL-3 och G-CSF, respektive. Det observerades att celler odlade i IL-3 innehållande medium (10 ng/mL) delar ungefär varje 24 h (figur 2A). Vid byte av IL-3 med G-CSF (100 ng/mL) spridning gradvis ...

Watch this Scientific Journal Video about Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells at JoVE.com

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Här presenteras detaljerade protokoll för odling av murina myeloiska föregångare 32D/G-CSF-R cellinje, utför virusinfektioner och utför proliferation och differentiering analyser. Denna cellinje är lämplig för att studera myeloida cell utveckling, och rollen av gener av intresse i myeloisk celltillväxt och neutrofil differentiering.

Proliferation och differentiering av murina myeloiska föregångare 32D/G-CSF-R celler

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produktion och användning av Lentivirus att selektivt omvandla Primär Oligodendrocyte prekursorceller för<em&gt; In Vitro</em&gt; myeline Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Organotypic Co-kultur Modell Stöd Medullary Thymic epitelcellproliferation, differentiering och promiskuös Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetisk reglering av hjärt Differentiering av embryonala stamceller och vävnader

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Upprättande och kultur Myogenic prekursorceller / Primära myoblaster från skelettmuskulatur av vuxna och äldre människor

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiering av humana mesenkymala stamceller till funktionella hjärtmuskelcellen-liknande celler

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Snabb upptäckt av neurologiska fenotyper i mänskliga neurala prekursorceller (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolering, kultur och differentiering av benmärgens stromaceller och Osteoclast stamfäder från möss

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Härledning och differentiering av hundarnas cystor mesenkymala stamceller

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...