Name: combinational treatment of trichostatin a and vitamin c improves the efficiency of cloning mice by somatic cell nuclear transfer
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer at JoVE.com

وأيد هذا العمل كاكينهي JSPS منحة أرقام JP15H06753، JP16H01321، JP16H01222، JP17H05045 على منحة من مؤسسة سوميتومو ك. م. "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" (150810 إلى ك. م.). منحة بحثية في جامعة كينداي (15-I-2 ك. م. وشهادة الماجستير). مو تقر بالدعم الأساسية المقدمة من المملكة المتحدة "لأبحاث السرطان" (C6946/A24843) ومؤسسة ويلكوم ترست (203144/Z/16/Z).  ونشكر السيدة أ. باك-كاميمورا، والسيد J. هورفات لدليل على القراءة.

<ol>
	<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+cloned+mice+by+somatic+cell+nuclear+transfer.">Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer.</a> Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).</li><li>Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+mice+after+nuclear+transfer+by+electrofusion+using+tail+tip+cells.">Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells.</a> Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).</li><li>Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+mice+from+fetal+fibroblast+cells+arrested+at+metaphase+by+a+serial+nuclear+transfer.">Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+following+somatic+cell+nuclear+transfer+impeded+by+persisting+histone+methylation.">Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.</a> Cell. 159 (4), 884-895 (2014).</li><li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).</li><li>Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+acetylation+in+reprogramming+of+somatic+nuclei+following+nuclear+transfer.">Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).</li><li>Bui, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+trichostatin+A+on+chromatin+remodeling,+histone+modifications,+DNA+replication,+and+transcriptional+activity+in+cloned+mouse+embryos.">Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos.</a> Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9+methylation+is+a+barrier+during+somatic+cell+reprogramming+into+iPSCs.">H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs.</a> Nat Genet. 45, 34-42 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+enhances+in+vitro+and+in+vivo+development+of+porcine+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos.">Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos.</a> Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).</li><li>Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracytoplasmic+injection+of+deionized+bovine+serum+albumin+immediately+after+somatic+cell+nuclear+transfer+enhances+full-term+development+of+cloned+mouse+embryos.">An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos.</a> J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+towards+totipotency+is+greatly+facilitated+by+synergistic+effects+of+small+molecules.">Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules.</a> Biol Open. 6, 415-424 (2017).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+partial+zona-pellucida+dissection+on+the+in+vitro+fertilizing+capacity+of+cryopreserved+C57BL/6J+transgenic+mouse+spermatozoa+of+low+motility.">Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility.</a> Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).</li><li>Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo. , (1986).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+male+mice+from+adult+tail-tip+cells.">Cloning of male mice from adult tail-tip cells.</a> Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).</li><li>Ogura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+male+cloned+mice+from+fresh,+cultured,+and+cryopreserved+immature+sertoli+cells.">Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells.</a> Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).</li><li>Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+cloned+from+embryonic+stem+cells.">Mice cloned from embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).</li><li>Tachibana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+gene+replacement+in+primate+offspring+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells.</a> Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oocytes+reprogram+adult+somatic+nuclei+of+a+type+1+diabetic+to+diploid+pluripotent+stem+cells.">Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells.</a> Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).</li><li>Mizutani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cloned+mice+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cell+lines+from+urine-derived+cells.">Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells.</a> Sci Rep. 6, 1-8 (2016).</li><li>Kaminuma, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyper-reactive+cloned+mice+generated+by+direct+nuclear+transfer+of+antigen-specific+CD4++T+cells.">Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells.</a> EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).</li><li>Terashita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrunculin+A+can+improve+the+birth+rate+of+cloned+mice+and+simplify+the+nuclear+transfer+protocol+by+gently+inhibiting+actin+polymerization.">Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization.</a> Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+improve+in+vitro+and+in+vivo+developmental+competence+of+somatic+cell+nuclear+transfer+porcine+embryos.">Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).</li><li>Shi, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichostatin+A+(TSA)+improves+the+development+of+rabbit-rabbit+intraspecies+cloned+embryos,+but+not+rabbit-human+interspecies+cloned+embryos.">Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos.</a> Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).</li><li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+enhances+the+generation+of+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وفي الختام، هذه النتائج تشير إلى أن الطريقة التي سكنت قدم يمكن تقليل الصعوبات التقنية، وزيادة كفاءة سكنت دون الحاجة إلى التعديلات الوراثية ومكملات مرناً (الجدول 1و الجدول 2)، وضمان استقرار إنتاج أجنة مستنسخة. هذا الأسلوب يتيح لنا إعادة إعمار الأجنة سكنت أكثر من الأساليب التقليدية نظراً لمعدل البقاء على قيد الحياة أفضل وبروتوكول مبسط. في هذا البروتوكول، وهو خطوة حاسمة واحدة خلية الانصهار. لإنتاج الفئران المستنسخة بنجاح، أنها حيوية لضمان أن يتم الاحتفاظ بكمية مناسبة من هفج الإلكترونية المبينة في البروتوكول أثناء عملية الانصهار الخلية وبويضات بحاجة إلى أن تعاد إلى الحاضنة داخل 10 دقيقة خلال الخطوات 6.2.3-6.2.5. حيث يمكن أن يستنشق الخلايا المانحة 20 إلى 30 جنبا إلى جنب مع هفج ه في وقت واحد في ماصة التلاعب، أكبر من الأسلوب الحالي عدد بويضات تم الحصول عليها خلال عملية واحدة. وفي النهاية، نحن يمكن أن تنتج بويضات أعيد بناؤها حوالي 20 إلى 30 في 10 دقيقة. حتى عندما تعمل مع مجموعة كبيرة من بويضات (100 أو أكثر)، خلية الانصهار الإجراء ينبغي أن تأخذ ساعة أو أقل بتكرار الخطوات 6.2.3-6.2.5. بالأسلوب والتقنيات المعروضة هنا يمكن اعتبارها البروتوكولات الكفء مع المتطلبات التقنية المبسطة.
وفي الوقت الحاضر، أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير الأجنة سكنت لا تزال غير واضحة. كما يساهم هذا الأسلوب سكنت تحسين دراسة آليات إعادة برمجة هذه، وبهذه الطريقة يمكن أن تنتج العديد من الأجنة المستنسخة في تجربة واحدة فقط. يستخدم هذا الأسلوب خلايا جسدية مع أغشية سالمة من خلية لخلية الانصهار. وهكذا، قد يكون من الممكن لتطبيق هذا النهج إلى خلايا أخرى مثل الخلايا نصيحة ذيل16، خلايا سيرتولي17، والخلايا الجذعية الجنينية (ES)18. عندما تستخدم الأساليب التقليدية سكنت لحقن الخلايا الكبيرة نسبيا، مثل الخلايا نصيحة الذيل، مباشرة في السيتوبلازم البويضات، يصبح حتى من الناحية الفنية أكثر تطلبا للحصول على الأجنة الحية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الثابتة نسبيا، مثل خلايا سيرتولي، يصعب على الخروج من بيبيتينج للحقن. عند النظر في هذه الأنواع المختلفة من الخلية، أسلوب الانصهار الخلية استخدام هفج ه بسيطة وفعالة. على الرغم من أن قيمة وسلامة هفج ه قد تم إثبات مقنع19،20، قد يكون هاما إعادة النظر في جدوى استخدام هفج ه لإنتاج الحيوانات المستنسخة للأغراض الزراعية أو الطبية.
وعلاوة على ذلك، أنتجت مجموعة واحدة مؤخرا بنجاح الفئران المستنسخة المستمدة من الخلايا البول21. لإنقاذ أنواع الثدييات المهددة بالانقراض، من الآن فصاعدا سكنت استخدام الخلايا التي يتم جمعها بطريقة غير الغازية، مثل الخلية البول، سوف تكون مثالية. في الآونة الأخيرة، مجموعة أخرى مباشرة قد ولدت الفئران المستنسخة باستخدام خلايا CD4 محددة مستضد الخلايا+ ر22. سيكون من المثير للاهتمام أن تفحص إذا كان هذا الأسلوب ينطبق أيضا على كفاءة استنساخ الفئران من هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، أبلغ A لاترونكولين كبديل أفضل لتثبيط بلمرة الأكتين أثناء انوكلييشن والتنشيط بارثينوجينيتيك سكنت بويضات23. دراسة في المستقبل قد تكشف عما إذا كانت معاملة A لاترونكولين، بدلاً من سيتوتشالاسين ب، يحسن كذلك جيل نسل المستنسخة. بالإضافة إلى ذلك، معاملة حساب السياحة الفرعي قد استخدمت بنجاح في الفئران والأرانب25 الخنازير24بتغيير وقت العلاج والفترة والتركيز. وعلاوة على ذلك، الرأسمالي يعزز من التنمية الجنينية في الخنزير سكنت10، بل أيضا يحسن إنتاج خلايا iPS في البشر والفئران26. وبالتالي، فمن المعقول التكهن بأن معاملة حساب السياحة الفرعي والرأسمالي يمكن أن تطبق أيضا على سائر أنواع الثدييات، وإننا قد نحتاج إلى تحسين وقت المعالجة للسياحة والاستثمار الرأسمالي لكل نوع من الأنواع.
وفي الختام، هذا الأسلوب سيجعل من الممكن توليد الفئران المستنسخة بمستوى عملي من الكفاءة مع إجراءات بسيطة. ولذلك، نتائج هذه الدراسة يمكن أن تؤدي بنا إلى استخدام التكنولوجيا سكنت للحفاظ على الموارد الوراثية للحيوانات النادرة، وفهم الآليات الجزيئية لإعادة برمجة النووي والتنمية الجنينية المبكرة.

تمكن تقنية سكنت إنتاج الحيوانات المستنسخة باستخدام واحد فقط من الخلية الجسمية أو نواة لنقلها إلى البويضيه enucleated. واحد لأغراض تقنية سكنت هو الاشتقاق خطوط الخلايا الجذعية الجنينية (NT-بتوليدا) النقل النووي من أجنة مستنسخة. وفي عام 1998، واكاياما et al.، والإبلاغ عن إنتاج الفأرة مستنسخة بنجاح المسمى كومولينا ل المرة الأولى1. ومنذ ذلك الحين، استنساخ الفئران قد تم دراستها على نطاق واسع، وتم الحصول على العديد من معلومات هامة بشأن إعادة برمجة النووي لنواة جسدية. من ناحية أخرى، هذا الأسلوب هو مصحوبة بالعديد من الخطوات ميكرومانيبوليشن التي يصعب جداً للأصول الرأسمالية، التي تتطلب تدريبا مكثفا لأكثر من 3 أشهر2.
إنتاج الفئران المستنسخة باستخدام سكنت تطورت من الأصلي هونولولو الأسلوب1، أسلوب الصهر الكهربائي3، إلى أسلوب الانصهار الخلية بالفيروس هيماجلوتيناتينج من اليابان (هفج)4. ومع ذلك، يميل الحقن المباشر لنواة الخلية عن طريق سيتوميمبراني ضاراً تؤثر على بقاء البويضات. الصهر الكهربائي منخفض في الكفاءة، ونظرا لكل غشاء الخلية صلابة مختلفة، مما يجعل من الصعب تحديد شرط أمثل. التعامل مع هفج شاقة لأنها تتطلب معدات خاصة لسلامة الباحثين والحيوانات المختبرية. فتيل السيتوبلازم الخلية والبويضات المانحين، هفج ه في الآونة الأخيرة تستخدم5. هفج ه فقط لديه القدرة على صهر الأغشية دون قدرة الفيروسات التكاثري أو المعدية. الكشف هفج الجينوم معطلة تماما في هفج-هاء. وهكذا يدعم استخدام هفج ه سهولة التعامل من الانصهار الخلية أثناء سكنت.
وقد أظهرت عدة تقارير أن معاملة الأجنة سكنت مع حساب السياحة الفرعي، مثبط deacetylase هيستون، تحسن كبير في كفاءة الإنتاج الجراء حية من أقل من 1% إلى 6.5%6،7. حساب السياحة الفرعي العلاج يسرع إعادة برمجة عن طريق تعديل علامات هستون في الأجنة سكنت8. في الآونة الأخيرة، حقن خاصة مرناس، الفصيلية ديميثيلاسي يسين هيستون 4 (KDM4)، التي تقوم بإزالة هيستون H3 ليزين 9 (H3K9) تريميثيليشن في الأجنة سكنت، لا سيما في مناطق ريبروجرامينج-مقاومة، لقد ثبت لزيادة تطوير المستنسخة ماوس الأجنة9. ومن ناحية أخرى، انخفض الاستثمار الرأسمالي، الذي يعمل أيضا كمعدل هستون، تريميثيليشن H3K910. وعلاوة على ذلك، يعزز الاستثمار الرأسمالي التطور الجنيني في الخنزير سكنت10. وأفيد أن حقن مصرف في الأجنة سكنت يؤدي إلى تحسين التنمية الجنينية11.
لقد وجدنا سابقا أن مجموعة الجزيئات الصغيرة، إلا وهي السياحة والاستثمار الرأسمالي، جنبا إلى جنب مع مصرف، جذريا تعزيز التنمية سكنت الأجنة12. هنا، نحن بالتفصيل طريقة سكنت سبق الإبلاغ عنها للفئران، التي تمثل إجراءات الاستنساخ كفاءة عالية وبسيطة12. ونحن أيضا وصف معالجة هفج-هاء وهذه يمكن أن تساعد العديد من الباحثين في مجال البيولوجيا الإنجابية والتنموي المحافظة على الموارد الوراثية أو إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا من خلال هذا الأسلوب سكنت.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>28-2270-5</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>169-03542</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>165-04242</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &#183; 7H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>137-00402</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>039-00431</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>041-00595</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>199-03062</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>G3126</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>168-17042</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Nacalai tesque, Inc.</td>
			<td>31213-15</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-Lactate</td>
			<td>Nacalai tesque, Inc.</td>
			<td>31605-72</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td>
			<td>4987222637671 (GTIN-13)</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td>
			<td>4987222665643 (GTIN-13)</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, endotoxin free</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>196-15645</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA &#183; 2Na</td>
			<td>Dojindo Lab.</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>H3784</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>P8136</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>A3311</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT AG 501-X8 (D) Resin</td>
			<td>Bio-Rad Lab., Inc.</td>
			<td>143-7425</td>
			<td>For preparation of dBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>H3506</td>
			<td>For collection of oocytes and cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>034-17554</td>
			<td>For enucleation and oocytes activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo micro manipulator</td>
			<td>Prime tech, Co., Ltd.</td>
			<td>PMM-150FU</td>
			<td>For micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF</td>
			<td>Ishihara sangyo kaisha, Ltd.</td>
			<td>CF001</td>
			<td>Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>193-09442</td>
			<td>For oocytes activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>E8145</td>
			<td>For oocytes activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>045-24511</td>
			<td>For solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>T1952</td>
			<td>For incubating with SCNT embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>A5960</td>
			<td>For incubating with SCNT embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>M8410</td>
			<td>For covering medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combinational treatment of trichostatin a and vitamin c improves the efficiency of cloning mice by somatic cell nuclear transfer

نقل نواة الخلية الجسدية (سكنت) يوفر فرصة فريدة من نوعها لإنتاج مباشرة من الحيوانات مستنسخة من خلية مانحة، ويتطلب استخدام تقنيات ماهراً. بالإضافة إلى ذلك، ظلت كفاءات الاستنساخ منخفضة منذ النجاح في إنتاج الحيوانات المستنسخة، ولا سيما الفئران. كانت هناك محاولات عديدة لتحسين كفاءة الاستنساخ، وتريتشوستاتين A (TSA)، مثبط deacetylase هيستون، قد استخدمت على نطاق واسع لتعزيز كفاءة الاستنساخ. هنا، نحن تقرير أسلوب استنساخ تحسنت بشكل كبير في الفئران. ويشمل هذا الأسلوب نقل نواة الخلية الجسدية استخدام فيروس هيماجلوتيناتينج من "اليابان المغلف" (هفج-E)، التي تمكن من السهل التلاعب. وعلاوة على ذلك، العلاج باستخدام اثنين من الجزيئات الصغيرة، حساب السياحة الفرعي وفيتامين ج (VC)، مع ألبومين المصل البقري منزوع (مصرف)، فعالة للغاية للتنمية الجنينية. هذا النهج يتطلب حقن إضافية ولا التلاعب بالجينات، وهكذا يقدم طريقة بسيطة وملائمة للاستخدام العملي. يمكن أن يصبح هذا الأسلوب نهجاً ممكناً من الناحية الفنية للباحثين لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا من الخلايا المستزرعة. وعلاوة على ذلك، قد يكون وسيلة مفيدة لإنقاذ الحيوانات المهددة بالانقراض عن طريق الاستنساخ.

واستخدمت لإنتاج أجنة مستنسخة من الماوس، خلايا الركام والخلايا الجنينية تنتجها الخلايا الليفية. وترد في الجدول 1عدد بويضات أعيد بناؤها والتنمية إلى مرحلة 2-خلية بعد تنشيط البويضات. ولوحظت نسبة عالية جداً من تشكيل برونوكليار (89 إلى 100 ٪) والتنمية إلى مرحلة 2-خلية (77 إلى 89 في المائة) تحت كل الظروف. بعض الأجنة المستنسخة، المستمدة من الخلايا الركام والبلدان المتقدمة النمو إلى مرحلة 2-الخلية، نقلوا إلى أوفيدوكتس إناث الحوامل الزائفة. أنتجت ذرية المستنسخة الستة من أصل 72 نقل الأجنة من الإناث الحوامل الثلاثة بمعالجة المسلسل للسياحة والاستثمار الرأسمالي (الشكل 4). أبلغ حوالي 15% أجنة المستنسخة لتطوير للمصطلح باتباع هذه الإجراءات سكنت12. وبالإضافة إلى ذلك، حققت نقل الأجنة المستنسخة 2-خلية في مؤسسات أخرى ذرية يعيش 9 إلى 15 في المائة، الذي يمثل تطورا أفضل من معاملة حساب السياحة الفرعي واحد على الأجنة المستنسخة. وعلاوة على ذلك، المعاملة مع حساب السياحة الفرعي والرأسمالي تحسن كبير في الكفاءة في المختبر التطور الجنيني لمرحلة الكيسة (الجدول 2، ف < 0.05، اختبار t للطالب). هذه في المختبر التنموية البيانات تبين أن التأثير الإيجابي للسياحة والاستثمار الرأسمالي محدودة بسلالات الماوس ولا بأنواع الخلايا. هذه النتائج تشير إلى أن هذا الأسلوب سكنت يسهل القدرة الإنمائية للأجنة المستنسخة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg"> الشكل 1: إعداد مصرف. وصفت إجراءات خطوة بخطوة لإعداد حل مصرف. يمكن الحكم على مدى التبادل الأيوني بتغير لون الخرز. يظهر الشكل الأيسر العلوي أن ز 1.2 من جيش صرب البوسنة يحل في 10 مل الماء المعقم في درجة حرارة الغرفة. بعد حل جيش صرب البوسنة، تتم إضافة الخرز راتنج التبادل الأيوني (أعلى اليمين). عندما خليط حل جيش صرب البوسنة مع حبات راتنج التبادل الأيوني بتغيير اللون من الأخضر والأزرق للذهب (أسفل اليمين)، واستبدال الخرز مع المنتجات الطازجة. ويوضح الشكل أسفل اليسار أن يبقى لون الخرز الأزرق والأخضر، والانتهاء من التبادل الأيوني. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg"> الشكل 2: الإجراءات انوكلياتيون. (أ) مثال على الدائرة انوكلياتيون. يتم انوكلييشن بويضات في المتوسط هكزب مع بناء القدرات. لنظام القيادة بيزو، يستخدم بقعة من 9% حماية الأصناف النباتية المتوسطة لإعداد ماصة زجاجية انوكلييشن. تغطيها بقع الزيت المعدني. (ب) الرسم التخطيطي وصورة مجهرية إظهار موضع مغزل والكروموسومات قبل انوكلييشن. أسود رؤوس الأسهم: مغزل والكروموسومات. رؤوس الأسهم الحمراء: الجسم القطبي الأول. (ج) رسم تخطيطي وصورة مجهرية لإظهار انوكلييشن ناجحة. أسود رؤوس الأسهم: مغزل والكروموسومات. السهم الأحمر: الجسم القطبي الأول. السهم الأزرق: الثقب في zona pellucida. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg"> الشكل 3: خلية الانصهار الإجراءات والثقافة حالة الأجنة سكنت. (أ) مثال على دائرة الانصهار الخلية. خلية الانصهار يتم في المتوسط هكزب التي تحتوي على مصرف 6%. بقعة متوسط 9% حماية الأصناف النباتية يستخدم لإعداد ماصة زجاجية لخلية الانصهار. تغطيها بقع الزيت المعدني. (ب) الرسم التخطيطي وصورة مجهرية من التكثيف كروموسوم سابق لأوانه شكلت ساعة واحدة بعد خلية الانصهار (السهم الأسود). (ج) رسم تخطيطي وصورة مجهرية لهيكل pronuclear شكلت ست ساعات بعد التنشيط (رؤوس سوداء). (د) خطة لعلاج الأجنة سكنت السياحة، والاستثمار الرأسمالي، ومصرف. ويمثل السهم الأخضر في المعاملة مع حساب السياحة الفرعي، تليها الحضانة مع الرأسمالي (السهم الأصفر) تحت المتوسطة مكسوم المتضمن مع مصرف 0.3% (السهم الأزرق). رؤساء الأسهم تشير إلى التوقيت لتغيير المتوسطة. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg"> الشكل 4: ذرية المستنسخة المستمدة من الخلايا الركام فقط بعد عملية قيصرية بعد أيام 19.5 من الحمل. وهناك مترافق في الصف العلوي. ذرية المستنسخة هو موضح هنا تم إنشاؤها في أحد التجربة النووية نقل من الأمهات الحاضنة الثلاثة. وكان حجم المشيمة 1.5 إلى 2 مرات أكبر من حجم تلك التي تنتجها الإخصاب في الأنابيب . <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>المجموعة</td>
			<td>نوع الخلية المانحة</td>
			<td colspan="2">ضغط الماوس</td>
			<td>لا. من بويضات المستخدمة</td>
			<td>لا. من بويضات تنصهر</td>
			<td>لا. من بويضات عرض التكثيف كروموسوم سابق لأوانه</td>
			<td>لا. من بويضات عرض تشكيل برونوكلي (%)</td>
			<td>لا. من بويضات شكلت pronuclei أن البلدان المتقدمة النمو إلى 2-خلايا الأجنة (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>حساب السياحة الفرعي، VC</td>
			<td>الركام</td>
			<td colspan="2">× C57BL/6 ديسيبل/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>81 (99)</td>
			<td>72 (89)</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير المعالجة</td>
			<td>الركام</td>
			<td colspan="2">× C57BL/6 ديسيبل/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>82 (100)</td>
			<td>68 (83)</td>
		</tr>
<tr>
<td>حساب السياحة الفرعي، VC</td>
			<td>الجنين تنتجها الخلايا الليفية</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>202</td>
			<td>171</td>
			<td>169</td>
			<td>151 (89)</td>
			<td>124 (82)</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير المعالجة</td>
			<td>الجنين تنتجها الخلايا الليفية</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td>147</td>
			<td>142 (97)</td>
			<td>109 (77)</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: آثار المعاملة السياحة والاستثمار الرأسمالي في في المختبر تنمية الأجنة المستنسخة الماوس إلى مرحلة 2-خلية-
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">المجموعة</td>
			<td rowspan="2">نوع الخلية المانحة</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ضغط الماوس</td>
			<td rowspan="2">لا. 2-خلايا الأجنة المستخدمة</td>
			<td colspan="3">لا. 2-خلايا الأجنة المتقدمة لكل المراحل (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-الخلية</td>
			<td>morula</td>
			<td>الكيسة</td>
		</tr>
<tr>
<td>حساب السياحة الفرعي، VC</td>
			<td>الركام</td>
			<td colspan="2">× C57BL/6 ديسيبل/2</td>
			<td>152</td>
			<td>152 (100)</td>
			<td>149 (98)</td>
			<td>135 (89) 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير المعالجة</td>
			<td>الركام</td>
			<td colspan="2">× C57BL/6 ديسيبل/2</td>
			<td>83</td>
			<td>47 (57)</td>
			<td>41 (49)</td>
			<td>32 (39) ب
</td>
		</tr>
<tr>
<td>حساب السياحة الفرعي، VC</td>
			<td>الجنين تنتجها الخلايا الليفية</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>124</td>
			<td>110 (89)</td>
			<td>101 (81)</td>
			<td>88 (71) ج
</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير المعالجة</td>
			<td>الجنين تنتجها الخلايا الليفية</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>109</td>
			<td>54 (50)</td>
			<td>45 (41)</td>
			<td>29 (27) د
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
أ-ب، ج-د مرتفع مختلفة داخل نفس الخلايا المانحة تمثل اختلافات كبيرة (ف < 0.05)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: آثار المعاملة السياحة والاستثمار الرأسمالي في في المختبر تنمية الأجنة المستنسخة الماوس إلى مرحلة الكيسة.

Watch this Scientific Journal Video about Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer at JoVE.com

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

يصف لنا طريقة تحسنت بشكل كبير للاستنساخ الماوس باستخدام تريتشوستاتين أ، وفيتامين ج، والبومين المصل البقري منزوع. علينا إظهار بروتوكول مبسط وقابل لإعادة الإنتاج الذي يدعم تطوير كفاءة الأجنة المستنسخة. ومن ثم، يمكن أن يصبح هذا الأسلوب إجراء موحد لاستنساخ الماوس.

العلاج التوافيقيه Trichostatin A وفيتامين ج يحسن كفاءة استنساخ الفئران بنقل نواة الخلية الجسدية

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

عزل وتحليل خلايا البنكرياس اللحمة المتوسطة عن طريق التدفق الخلوي

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...