Name: combinational treatment of trichostatin a and vitamin c improves the efficiency of cloning mice by somatic cell nuclear transfer
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer at JoVE.com

Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 Sumitomo к.м. Грант фонда для основных науки научно-исследовательских проектов (150810 к.м.). Kindai университет исследовательский грант (15-I-2 к.м. и м.а.). М.о. признать основной поддержки, предоставляемой исследований рака Великобритании (C6946/A24843) и Уэллком траст (203144/Z/16/Z).  Мы благодарим г-жа N. Backes-Камимура и г-н J. Horvat за доказательство чтения.

<ol>
	<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+cloned+mice+by+somatic+cell+nuclear+transfer.">Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer.</a> Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).</li><li>Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+mice+after+nuclear+transfer+by+electrofusion+using+tail+tip+cells.">Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells.</a> Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).</li><li>Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+mice+from+fetal+fibroblast+cells+arrested+at+metaphase+by+a+serial+nuclear+transfer.">Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).</li><li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+development+following+somatic+cell+nuclear+transfer+impeded+by+persisting+histone+methylation.">Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation.</a> Cell. 159 (4), 884-895 (2014).</li><li>Kishigami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).</li><li>Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+acetylation+in+reprogramming+of+somatic+nuclei+following+nuclear+transfer.">Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer.</a> Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).</li><li>Bui, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+trichostatin+A+on+chromatin+remodeling,+histone+modifications,+DNA+replication,+and+transcriptional+activity+in+cloned+mouse+embryos.">Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos.</a> Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9+methylation+is+a+barrier+during+somatic+cell+reprogramming+into+iPSCs.">H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs.</a> Nat Genet. 45, 34-42 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+enhances+in+vitro+and+in+vivo+development+of+porcine+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos.">Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos.</a> Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).</li><li>Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracytoplasmic+injection+of+deionized+bovine+serum+albumin+immediately+after+somatic+cell+nuclear+transfer+enhances+full-term+development+of+cloned+mouse+embryos.">An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos.</a> J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+towards+totipotency+is+greatly+facilitated+by+synergistic+effects+of+small+molecules.">Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules.</a> Biol Open. 6, 415-424 (2017).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+effect+of+partial+zona-pellucida+dissection+on+the+in+vitro+fertilizing+capacity+of+cryopreserved+C57BL/6J+transgenic+mouse+spermatozoa+of+low+motility.">Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility.</a> Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).</li><li>Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo. , (1986).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+male+mice+from+adult+tail-tip+cells.">Cloning of male mice from adult tail-tip cells.</a> Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).</li><li>Ogura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+male+cloned+mice+from+fresh,+cultured,+and+cryopreserved+immature+sertoli+cells.">Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells.</a> Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).</li><li>Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+cloned+from+embryonic+stem+cells.">Mice cloned from embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).</li><li>Tachibana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+gene+replacement+in+primate+offspring+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells.</a> Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oocytes+reprogram+adult+somatic+nuclei+of+a+type+1+diabetic+to+diploid+pluripotent+stem+cells.">Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells.</a> Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).</li><li>Mizutani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cloned+mice+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cell+lines+from+urine-derived+cells.">Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells.</a> Sci Rep. 6, 1-8 (2016).</li><li>Kaminuma, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyper-reactive+cloned+mice+generated+by+direct+nuclear+transfer+of+antigen-specific+CD4++T+cells.">Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells.</a> EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).</li><li>Terashita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrunculin+A+can+improve+the+birth+rate+of+cloned+mice+and+simplify+the+nuclear+transfer+protocol+by+gently+inhibiting+actin+polymerization.">Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization.</a> Biol Reprod. 86 (6), 180 (2012).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+improve+in+vitro+and+in+vivo+developmental+competence+of+somatic+cell+nuclear+transfer+porcine+embryos.">Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).</li><li>Shi, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichostatin+A+(TSA)+improves+the+development+of+rabbit-rabbit+intraspecies+cloned+embryos,+but+not+rabbit-human+interspecies+cloned+embryos.">Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos.</a> Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).</li><li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+enhances+the+generation+of+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

В заключение эти результаты показывают, что метод представленных SCNT может снизить технические трудности и повысить эффективность SCNT без генетических модификаций и мРНК добавок (Таблица 1, Таблица 2) и обеспечить стабильное производство клонированных эмбрионов. Этот метод позволяет реконструировать более SCNT эмбрионов, чем традиционные методы связи с лучшей выживаемости и упрощенный протокол. В этом протоколе один критический шаг является слияние клеток. Чтобы успешно производить клонированных мышей, жизненно важно обеспечить надлежащее количество HVJ-E, указанных в протоколе поддерживается во время процесса слияния клеток и яйцеклеток должны быть возвращены в инкубатор в течение 10 мин на этапах 6.2.3 - 6.2.5. Так как клеток донора 20-30 может быть придыхательным вместе с HVJ-E одновременно в пипетку манипуляции, количество яйцеклеток, полученные от одной операции больше, чем у существующего метода. В конце концов мы можем производить около 20 до 30 вновь построенных яйцеклеток в течение 10 мин. Даже когда работает с большой партии ооцитов (100 или более), процедура по сплавливания ячейки должна занять около часа или менее, повторив шаги 6.2.3 - 6.2.5. Метод и представленные здесь методики может служить в качестве эффективных протоколов с упрощенной техническим требованиям.
В настоящее время молекулярные механизмы, лежащие в основе развитие зародышей SCNT до сих пор неясны. Этот усовершенствованный метод SCNT также способствует изучению таких перепрограммирования механизмов, поскольку этот метод может производить много клонированных эмбрионов в только одном эксперименте. Этот метод использует соматические клетки с нетронутыми клеточных мембран для синтеза клеток. Таким образом это может быть возможным применить этот подход к другие клетки, такие, как кончик хвоста клетки16, клетки Сертоли17и эмбриональных стволовых (ES) клетки18. Когда обычные SCNT методы используются для инъекций относительно крупных клеток, таких как клетки кончик хвоста, непосредственно в цитоплазму ооцита, она становится даже более технически сложных для получения живых эмбрионов. Кроме того относительно жестких клеток, таких как клетки Сертоли, трудно разорвать, закупорить для инъекций. При рассмотрении этих различных типов клеток, метод синтеза клеток, используя HVJ-E является простым и эффективным. Хотя значение и безопасности HVJ-e были убедительно продемонстрировали19,20, было бы важно вновь рассмотреть вопрос о целесообразности использования HVJ-E для производства клонированных животных для целей сельского хозяйства или биомедицинских.
Кроме того недавно одна группа успешно производит клонированных мышей, производные от мочи клетки21. Чтобы спасти исчезающих видов млекопитающих, отныне SCNT с использованием клеток, собранных в неинвазивные манере, например мочи ячейки, будет идеальным. Совсем недавно, другая группа непосредственно создается клонированный мышей с использованием антиген специфические CD4 клеток+ T22. Было бы интересно изучить, если этот метод применяется также эффективно клонировать мышей из таких клеток. Кроме того было сообщено Латрункулин A как лучшей альтернативой для ингибирования актина полимеризации в ходе Энуклеация и партеногенетических активации SCNT ооциты23. Будущие исследования может показывают ли A Латрункулин лечения, вместо cytochalasin B, далее улучшает поколения клонированных потомства. Кроме того АСП лечение успешно используется в мышей и свиней24, кролики25 , изменяя время лечения, период и концентрации. Кроме того VC не только повышает эмбриональное развитие в свинину SCNT10, но также улучшает iPS производства клеток в организме человека и мышей26. Таким образом это правдоподобно предположить, что TSA и VC лечение может также применяться для других видов млекопитающих, и нам может потребоваться оптимизировать время лечения TSA и VC для каждого вида.
В заключение этот метод позволит создавать клонированные мышей с практическим уровнем эффективности с простых процедур. Следовательно результаты этого исследования может привести нас, чтобы использовать технологию SCNT для сохранения генетических ресурсов редких животных и для понимания молекулярных механизмов ядерных перепрограммирования и раннего эмбрионального развития.

SCNT технология позволяет производство клонированных животных, используя только один соматических клеток или ядра могут быть переданы enucleated ооцитов. Одна из целей SCNT техники является производным линии эмбриональных стволовых клеток (NT-ЭСК) ядерной передачи от клонированных эмбрионов. В 1998 году Вакаяма и др., о которых сообщалось, производство успешно клонированных мыши, с именем Cumulina для первого времени1. С тех пор клонирование мышей широко изучен, и были получены многие важные идеи в ядерной перепрограммирования соматические ядра. С другой стороны, эта техника сопровождается многочисленными микроманипуляции шаги, которые являются довольно трудно мастер, требующих интенсивного обучения более чем на 3 месяца2.
Производство клонированных мышей с использованием SCNT превратилась из оригинального Гонолулу метод1, метод электрофузионных3, метод синтеза клеток Hemagglutinating вирусом Японии (HVJ)4. Однако прямым впрыском клеточного ядра через cytomembrane стремится нарушить ооцитов выживания. Электрофузионные низкой эффективности, так как каждый клеточной мембраны имеет различной твердости, что делает его трудно определить оптимальное состояние. Обработка HVJ является трудоемким, потому что он требует специального оборудования для обеспечения безопасности исследователей и лабораторных животных. Недавно чтобы предохранитель цитоплазме клеток и яйцеклетки доноров, HVJ-E был используется5. HVJ-E имеет только способность предохранитель мембраны без пролиферативных или инфекционные способность вирусов. Геномной РНК HVJ полностью инактивированных в HVJ-E. Таким образом, использование HVJ-E поддерживает управляемость синтеза клеток во время SCNT.
Несколько отчетов показали, что лечение SCNT эмбрионов с ВСТ, ингибиторов деацетилаз гистонов, значительно улучшает эффективность производства живых детенышей от менее чем 1% до 6,5%6,7. АСП лечение ускоряет перепрограммирования через изменения меток гистона SCNT эмбрионов8. Недавно, введения конкретных мРНК, гистонов лизин деметилазы подсемейство 4 (KDM4), который удалить гистонов H3 лизина 9 (H3K9) было показано, что trimethylation в SCNT эмбрионов, особенно на перепрограммирования устойчивые регионы, увеличить развитие клонированных эмбрионов мыши9. Тем временем VC, который также служит в качестве модификатора гистонов, уменьшилось trimethylation H3K910. Кроме того VC повышает эмбриональное развитие в свинину SCNT10. Сообщается, что инъекции Брюа в SCNT эмбрионов приводит к улучшению эмбрионального развития11.
Ранее мы обнаружили, что сочетание малых молекул, а именно: TSA и VC, вместе с Брюа, резко повысить развитие эмбрионов SCNT12. Здесь мы подробно сообщалось ранее SCNT метод для мышей, который представляет собой весьма эффективный и простой процедуры клонирования12. Мы также описывают обработку HVJ-E. Это может помочь много исследователей в области развития и репродуктивной биологии для сохранения генетических ресурсов или производить генетически модифицированных животных через этот метод SCNT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>28-2270-5</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>169-03542</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>165-04242</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &#183; 7H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>137-00402</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>039-00431</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>041-00595</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>199-03062</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>G3126</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>168-17042</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Nacalai tesque, Inc.</td>
			<td>31213-15</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium DL-Lactate</td>
			<td>Nacalai tesque, Inc.</td>
			<td>31605-72</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td>
			<td>4987222637671 (GTIN-13)</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td>
			<td>4987222665643 (GTIN-13)</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water, endotoxin free</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>196-15645</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA &#183; 2Na</td>
			<td>Dojindo Lab.</td>
			<td>345-01865</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>P0290</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>H3784</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>P8136</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>A3311</td>
			<td>For medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT AG 501-X8 (D) Resin</td>
			<td>Bio-Rad Lab., Inc.</td>
			<td>143-7425</td>
			<td>For preparation of dBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>H3506</td>
			<td>For collection of oocytes and cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>034-17554</td>
			<td>For enucleation and oocytes activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo micro manipulator</td>
			<td>Prime tech, Co., Ltd.</td>
			<td>PMM-150FU</td>
			<td>For micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF</td>
			<td>Ishihara sangyo kaisha, Ltd.</td>
			<td>CF001</td>
			<td>Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SrCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>193-09442</td>
			<td>For oocytes activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>E8145</td>
			<td>For oocytes activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>045-24511</td>
			<td>For solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>T1952</td>
			<td>For incubating with SCNT embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>A5960</td>
			<td>For incubating with SCNT embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td>
			<td>M8410</td>
			<td>For covering medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combinational treatment of trichostatin a and vitamin c improves the efficiency of cloning mice by somatic cell nuclear transfer

Переноса ядер соматических клеток (SCNT) предоставляет уникальную возможность производить непосредственно клонированных животных от доноров клеток, и это требует использования искусных методов. Кроме того эффективность клонирования оставались низкими со времени успешного производства клонированных животных, особенно мышей. Там было много попыток, чтобы улучшить эффективность клонирования, и трихостатин (TSA), ингибиторов деацетилаз гистонов, широко используется для повышения эффективности клонирования. Здесь мы приводим метод значительно улучшена клонирования в мышей. Этот метод переноса ядер соматических клеток предполагает использование вируса Hemagglutinating Японии конверта (HVJ-E), который позволяет легко манипулировать. Кроме того лечение, с использованием двух маленьких молекул, TSA и витамином С (VC), с дейонизированной бычьим сывороточным альбумином (Брюа), является весьма эффективной для эмбрионального развития. Этот подход требует дополнительных инъекций ни генетические манипуляции и таким образом представляет метод простой, пригодных для практического использования. Этот метод может стать технически осуществимым подход для исследователей для создания генетически модифицированных животных от культивируемых клеток. Кроме того это может быть полезным способом для спасения редких животных через клонирование.

Для производства мыши клонированных эмбрионов, были использованы кучевые клетки и клетки плода фибробластов. Количество восстановленных ооцитов и разработки до этапа 2-клеток после активации ооцитов приведены в таблице 1. Очень высокий уровень pronuclear формирования (89-100%) и разработка на этап 2-клеток (77 до 89%) были замечены при любых условиях. Некоторые из клонированных эмбрионов, которые были полученные из клеток кучевые и разработаны для этапа 2-клеток, были переданы яйцеводов псевдо-беременных самок. Шесть клонированных потомство из 72 перенесенных эмбрионов были произведены от трех беременных женщин путем последовательного лечения TSA и VC (рис. 4). Приблизительно 15% из клонированных эмбрионов, как сообщается, развивать в срок, следуя этой процедуры SCNT12. Кроме того передача клонированных эмбрионов 2-клеток в других учебных заведениях достигла 9 до 15% живой потомство, которое представляет лучшего развития, чем одного лечения TSA на клонированных эмбрионов. Кроме того, лечение с ВСТ и VC значительно повысила эффективность в vitro эмбрионального развития к стадии бластоцисты (Таблица 2, P < 0,05, t критерия Стьюдента). Эти в vitro развития данные показывают, что положительный эффект TSA и VC ограничено ни мыши штаммов ни типы клеток. Эти результаты показывают, что этот метод SCNT облегчает развития способности клонированных эмбрионов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg"> Рисунок 1: Подготовка Брюа. Пошаговые процедуры для подготовки решения Брюа изображены. Степень ионного обмена можно судить путем изменения цвета бисера. Верхний левый рисунок показывает что 1.2 g BSA растворяют в 10 мл стерильной воды при комнатной температуре. После роспуска BSA, ионообменные смолы бусины добавляются (справа вверху). Когда смесь раствора БСА с бусами ионообменные смолы изменение цвета от сине зеленого золота (снизу справа), заменить бисер пресной. Нижний левый рисунок показывает, что цвет бисера остается сине зеленый, и закончил ионного обмена. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg"> Рисунок 2: Энуклеация процедуры. (A) Иллюстрация Энуклеация камеры. Энуклеация ооцитов осуществляется в HCZB среде с CB. Для системы вождения piezo место 9% PVP среды используется для подготовки Пипетки стеклянные для Энуклеация. Пятна покрыты минеральное масло. (B) схемы и Микрофотография показывают положение шпинделей и хромосомы до Энуклеация. Черные стрелки: шпиндели и хромосом. Красные стрелки: первого полярного тельца. (C) A схема и Микрофотография Показать успешные Энуклеация. Черные стрелки: шпиндели и хромосом. Красные стрелки: первого полярного тельца. Голубые стрелки: отверстие в zona pellucida. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg"> Рисунок 3: Мобильный fusion процедуры и культура состояние SCNT эмбрионов. (A) Иллюстрация палаты слияние клеток. Слияние ячеек производится в HCZB среде, содержащей Брюа 6%. Место 9% PVP среды используется для подготовки Пипетки стеклянные для синтеза клеток. Пятна покрыты минеральное масло. (B) схемы и Микрофотография преждевременной хромосома конденсации сформировали один час после слияния клеток (черная стрелка). (C) A схема и Микрофотография pronuclear структуры сформированы шесть часов после активации (черные стрелки). (D) схема TSA, VC и Брюа лечения SCNT эмбрионов. Зеленая стрелка представляет собой лечение с ВСТ, следуют инкубации с VC (желтая стрелка) в mKSOM среде, содержащей с 0,3% Брюа (синяя стрелка). Стрел указывают время для изменения среды. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg"> Рисунок 4: Клонированные потомство производными ячеек кучевые сразу после кесарева сечения после 19,5 дней беременности. В верхней строке есть роль162. Клонированные потомство, показанный здесь были созданы в одном ядерной передачи эксперимент от трех приемных матерей. Размер плаценты был 1,5 – 2 раза больше, чем размер тех, кто получают путем оплодотворения в пробирке . <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Группа</td>
			<td>Тип ячейки доноров</td>
			<td colspan="2">Штамм мыши</td>
			<td>LOL яйцеклеток используется</td>
			<td>LOL яйцеклеток наплавочные</td>
			<td>LOL показаны конденсации преждевременной хромосомы яйцеклеток</td>
			<td>LOL яйцеклеток, показаны pronuclei образованием (%)</td>
			<td>LOL pronuclei сформированные яйцеклеток, разработанные к 2-клеток эмбрионов (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>Отель Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>81 (99)</td>
			<td>72 (89)</td>
		</tr>
<tr>
<td>лечить</td>
			<td>Отель Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>82 (100)</td>
			<td>68 (83)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>плода фибробластов</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>202</td>
			<td>171</td>
			<td>169</td>
			<td>151 (89)</td>
			<td>124 (82)</td>
		</tr>
<tr>
<td>лечить</td>
			<td>плода фибробластов</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td>147</td>
			<td>142 (97)</td>
			<td>109 (77)</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: эффекты TSA и VC лечения на в пробирке развитие зародышей клонированных мыши к стадии 2-элементный.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Группа</td>
			<td rowspan="2">Тип ячейки доноров</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Штамм мыши</td>
			<td rowspan="2">LOL 2-клеток эмбрионов используются</td>
			<td colspan="3">LOL 2-клеток эмбрионов разработаны для каждой стадии (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-элементная</td>
			<td>морулы</td>
			<td>бластоцисты</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>Отель Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>152</td>
			<td>152 (100)</td>
			<td>149 (98)</td>
			<td>135 (89) 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>лечить</td>
			<td>Отель Cumulus</td>
			<td colspan="2">C57BL/6 × DBA/2</td>
			<td>83</td>
			<td>47 (57)</td>
			<td>41 (49)</td>
			<td>32 (39) b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSA, VC</td>
			<td>плода фибробластов</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>124</td>
			<td>110 (89)</td>
			<td>101 (81)</td>
			<td>88 (71) c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>лечить</td>
			<td>плода фибробластов</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>109</td>
			<td>54 (50)</td>
			<td>45 (41)</td>
			<td>29 (27) d
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">
a-b, c-d Различные верхние в тех же ячейках доноров представляют собой значительные различия (P < 0,05)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: эффекты TSA и VC лечения на в пробирке развитие зародышей клонированных мыши к стадии бластоцисты.

Watch this Scientific Journal Video about Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer at JoVE.com

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Мы описываем метод значительно улучшена для мыши клонирования с помощью трихостатин A, витамин C и деионизированную бычьим сывороточным альбумином. Мы показываем упрощенный, воспроизводимые протокол, который поддерживает эффективное развитие клонированных эмбрионов. Следовательно этот метод может стать стандартизированной процедуры клонирования мыши.

Комбинационный лечения трихостатин А и витамин С улучшает эффективность клонирования мышей путем переноса ядер соматических клеток

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Культура эмбриональных мыши Cochlear эксплантов и Перенос генов путем электропорации

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Дифференциация клеточной линии SH-SY5Y нейробластомы человека

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Перенос генов в Куриный органа по Слуховые<em&gt; В Ово</em&gt; Micro-электропорации

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Разделительный и анализ клеток поджелудочной железы мезенхимы с помощью проточной цитометрии

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Простой метод для идентификации киназ, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток посредством высокопроизводительного скрининга ингибиторов

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

C. elegans кишечника как модель для межклеточных люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза на уровне одной ячейки: маркировка Пятнать антитела, RNAi потери функции анализа и обработки изображений

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...