Name: an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski per il loro prezioso aiuto e le modifiche apportate a questo manoscritto.  Sostenuta da sovvenzioni ricevute dal cuore nazionale, polmone e Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 e HL095439 RO3) e il dipartimento degli affari dei veterani (recensione di merito).

Tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali (topi) sono state seguite negli esperimenti descritti in questo manoscritto.
Questo metodo utilizza topi adulti FVBN, età compresa tra 16-20 settimane, trovato per essere ottimale per gli scopi di questo studio. Giorno 1 include i passaggi 1-5 e 2 giorni include i passaggi 6-7 (Figura 1).
1. preparazione del materiale
<ol><li>G...

<ol>
	<li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P.">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li><li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin.">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li><li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals.">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability.">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062 (2013).</li><li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury.">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li><li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas.">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).</li><li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney.">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li><li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase.">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li><li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats.">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li><li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue.">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li><li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+blue+fluorescence:+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues.">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li><li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson's+disease.">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li><li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo:+implications+for+drug+delivery.">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li><li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin.">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li><li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase+dysbalance+in+pathology:+the+neprilysin+(NEP)+and+angiotensin-converting+enzyme+(ACE)+families.">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li><li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock.">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).</li><li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia.">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li><li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism.">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li><li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma.">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li><li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas:+a+pilot+study.">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li><li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer.">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li><li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern.">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li><li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats.">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).</li><li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis.">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li></ol>

Come discusso in precedenza, lo studio di stravaso di plasma può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. Il riuscito uso del protocollo di stravaso di plasma (sopra), usando il colorante blu di Evans, è stato dimostrato nel manoscritto attuale. Anche se i dati riportati indietro l'ipotesi che la NEP può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma, questo è un obiettivo secondario attualmente, con l'obiettivo primario è di pre...

Perdita vascolare negli organi si riferisce allo stravaso, o perdita del plasma sanguigno attraverso le lacune prodotta nell'endotelio di post capillare venule negli organi. Questo stravaso di plasma o aumento della permeabilità vascolare, che può derivare da qualche tipo di risposta infiammatoria, può avere gravi conseguenze. Quindi, è importante che questo fenomeno, le cause, modulatori e conseguenze, sono studiate e capite, e allo stesso modo, che gli investigatori hanno una buona strumenti e protocolli con cui per studiarli. Le lacune endoteliale possono essere prodotto tramite una serie di stimoli, ma solitamente sono prodotte dall'azione di neurotrasmettitori peptidici e/o neurochinine sugli endoteli. Uno dei principali mediatori naturali di questo processo, che si traduce nello stravaso aumentati del plasma, è il neuropeptide tachykinin undecapeptide, la sostanza P1.
Metodi per indagare e misurare la permeabilità vascolare o stravaso di plasma, che utilizzano la proprietà di albumina-associazione di colorante blu di Evans, sono stati sviluppati e di solito sono noti per la loro precisione, semplicità, economia, sicurezza e capacità di consentire la determinazione di stravaso di plasma dai tessuti diversi in una sola volta, se così desidera il2,3,4,5,6,7,8,9 . Questo protocollo di blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN utilizza tutti questi, ma aggiunge alcune importanti modifiche che lo rendono generalmente utile e adattabile per gli studi futuri, che coinvolge il laboratorio di medio che conduce o sarà condurre studi importanti dei fattori connessi con stravaso di plasma o permeabilità vascolare. In questo protocollo, la sostanza P è stato introdotto per i topi a 1 nmol/kg, che aumenta lo stravaso di plasma di 1,5 volte. Questo aumenta la sensibilità del protocollo, con conseguente risultati più facilmente osservabili e ottenibile. Altri fattori che influenzano la permeabilità, come vari altri peptidi, sostanze chimiche o alcune forme di lesione tossica, possono essere utilizzati o studiati da altri laboratori, come desiderato. Vena giugulare iniezioni sono utilizzate nel presente protocollo per introdurre il blu di Evans e sostanza P sistemica, che richiede un intervento chirurgico terminale. Tuttavia, vena giugulare iniezioni5,7,10, anche dopo un esame delle tecniche chirurgiche terminale necessarie, sono più facili da padroneggiare e portano alla produzione di risultati più coerenti rispetto altri iniezioni di venose, compresa la coda della vena iniezioni4,9. Anche se potrebbe essere possibile per il blu di Evans da consegnare tramite le iniezioni retro-orbitale del seno venoso, riferimenti nella letteratura non sono stati trovati che utilizzano questo metodo di consegna di blu di Evans. Tuttavia, per quanto riguarda le iniezioni di vena della coda, l'elevato grado di competenza e pratica riproducibile padroneggiare questa tecnica notevolmente limita l'impiego per successo iniezioni di blu di Evans. Al contrario, il metodo di iniezione della vena giugulare alternativo come descritto nel nostro protocollo, offre una soluzione tecnicamente ottenibile. Una procedura fondamentale per la perfusione delle vene del mouse, eseguita solo dopo il sacrificio del mouse irrorato di blu di Evans, rimuove l'eccesso di blu di Evans ed è stato standardizzato nel presente protocollo. Metodi precedentemente descritti di aspersione sono stati attentamente esaminati e modificati per ottenere la presente procedura. Altre modifiche descritte qui sono tutti ottimizzati, semplice e poco costoso.
Ci sono alcune importanti limitazioni del metodo del colorante blu di Evans. Ad esempio, bassa sensibilità a volte connessa con questo metodo potrebbe impedire alcuni ulteriore esame lordo di patologico ed istologico dei tessuti da animali iniettati blu di Evans. Tuttavia, queste e altre limitazioni hanno portato allo sviluppo di metodi alternativi e modelli che, comunque, ancora utilizzano il blu di Evans. La misurazione di blu di Evans di fluorescenza (piuttosto che di visual-gamma) spettroscopia può aumentare la sensibilità del metodo. Inoltre, microscopia di fluorescenza dei tessuti tinto di blu di Evans è stata sviluppata per consentire l'osservazione di perdita vascolare in più distinte posizioni11. Inoltre, corpo intero di imaging e la scansione di un animale vivo precedentemente iniettato con Evans blue12 consente di indagine delle concentrazioni di blu di Evans in modo continuo, piuttosto che ad uno specifico scelto tempo punto dell'esperimento. Tuttavia, questo metodo richiede la disponibilità di adeguate strutture di imaging e può essere molto costoso. Modifiche che coinvolgono Evans blu e si è esibito in un tipo in vitro di modello, come in una cella cultura o pulcino chorioallantoic modello13 (CAM) inoltre sono stati descritti. Questi modelli sono monitorati da fluorescenza e microscopia intravital14 e consentono la quantificazione dei cambiamenti di permeabilità vascolare nel corso del tempo, ma possono sollevare questioni per quanto riguarda la modellazione accurata delle condizioni in vivo e possono anche essere costoso.
Ci sono stati altri metodi sviluppati per determinare e quantificare la perdita vascolare o permeabilità, che non comportano la somministrazione di blu di Evans. Questi metodi possono impiegare una molecola fluorescente appropriata (ad esempio l'albumina o fluoresceina), o una molecola con tag isotopicamente etichettata o altrimenti, agli animali vivi (o alla cella cultura o chorioallantoic (CAM) modelli13, seguita da non-invasivo Imaging (scansione PET, MRI, microscopia intravital, scansione di tutto il corpo) o di imaging invasivo (microscopia fluorescente)3,12,15. Anche se queste tecniche possono offrire un numero di vantaggi sopra altri Evans metodi blu, hanno anche gli svantaggi, che possono includere il loro notevole complessità, necessaria esperienza, risorse e costi monetari alti.
Neprilisina16 (peptidasi enzima NEP, noto anche come CD10, MME o Enkephalinase) è stata suggerita per essere coinvolti nell'inibizione dello stravaso di plasma, almeno in parte, attraverso il metabolismo enzimatico e inattivazione di endogeno sostanza p. Così, nei tessuti in cui si verifica la peptidasi di superficie delle cellule NEP, ci può essere un'attenuazione dell'effetto della sostanza P, presumibilmente dall'attività della peptidasi di NEP.
Inizialmente, abbiamo testato per lo stravaso di plasma indotta da sostanza P che utilizzano questo protocollo modificato di blu di Evans, con FVBN wild type (WT) e topi knockout (KO) NEP. Coinvolgimento di NEP nello stravaso di plasma sostanza P-aumentata è stata ritenuta sospetto da questi studi iniziali, e Descriviamo questi ed ulteriori esperimenti ruolo di NEP coinvolgendo nello stravaso di plasma. Tuttavia, il focus di questo manoscritto non è NEP o il suo ruolo nello stravaso di plasma, ma piuttosto lo stravaso di plasma esperimenti stessi. I risultati di NEP sono rappresentativi del tipo di risultati che possono essere ottenuti attraverso l'uso di questo protocollo modificato. Il metodo di blu di Evans per misurare lo stravaso di plasma è stato ottimizzato e modificato, come descritto in dettaglio qui di seguito per i topi FVBN.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:687px;" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane</td>
			<td style="width:167px;">Vet One</td>
			<td style="width:119px;">200-070</td>
			<td style="width:185px;">inhaled anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ketamine</td>
			<td style="width:167px;">Vet One</td>
			<td style="width:119px;">200-055</td>
			<td>injectable anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xylazine</td>
			<td style="width:167px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">139-236</td>
			<td>injectable anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">syringes (10,3 &#38; 1 cc)</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309604, 309657, 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">needles (20G1,23G1 &#38; 26G1/2)</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305178, 305193, 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isoflurane induction chamber</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">941443</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nosecone breathing circuits&#160;</td>
			<td style="width:167px;">VetEquip</td>
			<td style="width:119px;">RC2</td>
			<td>Rodent Circuit Controller 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oxygen tank</td>
			<td style="width:167px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">UN 1072</td>
			<td>100% medical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating pad</td>
			<td style="width:167px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TC-1000</td>
			<td>temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">rectal temperature probe</td>
			<td style="width:167px;">CWE Inc.</td>
			<td>10-09012</td>
			<td>mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">balance (for rodents)</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;">CS 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:185px;">Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td style="width:185px;">Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-hemostats</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>13009-12</td>
			<td style="width:185px;">Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools -suture drivers</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>12502-12</td>
			<td style="width:185px;">Olsen-Hegar suture drivers (suturing)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11627-12</td>
			<td style="width:185px;">Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td style="width:185px;">Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>18025-10</td>
			<td style="width:185px;">suture tying forceps (used for Millar cath)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td style="width:185px;">Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td style="width:185px;">Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td style="width:185px;">10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td style="width:185px;">Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-retractors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>17012-11</td>
			<td style="width:185px;">Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11294-00</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11297-00</td>
			<td style="width:185px;">Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td style="width:185px;">tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11009-13</td>
			<td style="width:185px;">serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-hemostats</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td style="width:185px;">Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">surgical tools-forceps</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td style="width:185px;">Adson serrated forceps (tissue grasping)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:167px;">Oster</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tape</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">159015G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">artificial tear ointment</td>
			<td style="width:167px;">Akorn Inc</td>
			<td style="width:119px;">13985-600-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lidocaine</td>
			<td style="width:167px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-4277-01</td>
			<td>2% injectable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl catheters</td>
			<td style="width:167px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">PV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Substance P</td>
			<td style="width:167px;">Bachem&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H-1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heparin</td>
			<td style="width:167px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">25201-400-10</td>
			<td>1000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">saline solution</td>
			<td style="width:167px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">0409-7138-09</td>
			<td>0.9% sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">phenobarbital&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Vortech</td>
			<td style="width:119px;">0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium citrate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417-50TAB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kimwipes for blotting</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microbalance</td>
			<td style="width:167px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:119px;">APX-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microfuge tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polystyrene 96 well plate</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:119px;">351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">absorbance plate reader</td>
			<td style="width:167px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyacrylamide gels</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>3450014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">protein molecular weight standard</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protran supported nitrocellulose</td>
			<td style="width:167px;">Amersham (GE)</td>
			<td style="width:119px;">10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gel box</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">primary NEP polyclonal antibody&#160;</td>
			<td style="width:167px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF1182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">doxycycline chow</td>
			<td style="width:167px;">Teklad (HARLAN)</td>
			<td>TD.130750&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FVB/NJ wild type mice</td>
			<td style="width:167px;">Jackson</td>
			<td style="width:119px;">001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary antibody (goat anti-rabbit)</td>
			<td style="width:167px;">ZyMed</td>
			<td style="width:119px;">81-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ECL solution-Western Lightening Plus</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">film</td>
			<td style="width:167px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">34091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse

Perdita vascolare, o lo stravaso di plasma, ha un certo numero di cause e può essere una conseguenza grave o sintomo di una risposta infiammatoria. Questo studio può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. È importante che i ricercatori hanno gli strumenti adeguati, tra cui i migliori metodi disponibili, per lo studio di stravaso di plasma. In questo articolo, descriviamo un protocollo, utilizzando il metodo di colorante blu di Evans, per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN. Questo protocollo è volutamente semplice, a come grande un grado possibile, ma fornisce dati di alta qualità. Blu di Evans è stato scelto principalmente perché è facile per il laboratorio di medio da utilizzare. Abbiamo utilizzato questo protocollo per fornire prove e supporto per l'ipotesi che l'enzima neprilisina può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato sperimentalmente e facilmente adattato per l'uso in altri ceppi di topi o in altre specie, in molti diversi organi o tessuti, per gli studi che possono coinvolgere altri fattori che sono importanti per comprendere, prevenire o curare stravaso di plasma. Questo protocollo è stato ampiamente ottimizzato e modificato da protocolli esistenti e combina affidabilità, facilità d'uso, economia e disponibilità generale di materiali e attrezzature, rendendo questo protocollo superiore per il laboratorio di medio da utilizzare in quantificare lo stravaso di plasma da organi.

Nella Figura 1, è indicato uno schema della procedura, che è stato trovato per causare i valori di stravaso di plasma indotta da sostanza P più affidabili e coerenti da organi dei topi FVBN. Questa procedura richiede solitamente due giorni di lavoro, separati da almeno 48 ore di tempo di attesa. È possibile diffondere ancora di più, se questa operazione viene eseguita costantemente per tutti gli esperimenti da confrontare. Ad esempio, dopo che gli organi...

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An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

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