Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للصحة (R01DK102943، R03CA182679، R03CA191621)، وصندوق ميريلاند لبحوث الخلايا الجذعية (2015-MSCRFE-1759، 2017-MSCRFD-3934)، وجمعية الرئة الأمريكية، وشبكة أليغيني الصحية - جونز صندوق هوبكنز للبحوث ومركز هوبكنز للبحوث الأساسية للبحوث الهضمية.

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسات الطبية جونز هوبكنز (IACUC). يتم تعديل هذا البروتوكول من أساليب نشرتمسبقا10و11و12و13.
1. إعداد الكواشف
<ol><li>إعداد 293T الطازجة المت...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

الثقافة الأولية للظهارة المعوية الكبار كما organoids يوفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في وظيفة الخلايا الجذعية، التوازن الظهاري المعوي، وعلم الأمراض1،2،3، 4. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 يمكن استخدامها ?...

القدرة على ثقافة الماوس أو خلايا سرداب الإنسان كما ثلاثي الأبعاد (3D) الأعضاء من الأمعاء الدقيقة أو القولون على مدى فترات زمنية طويلة قدمت اختراقا كبيرا لأن هذه الثقافات عرض ملامح تعريف ظهارة الأمعاء في الجسم الحي 1 , 2 , 3. العضوية المستمدة من سرداب الأولية قادرة على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي، وتظهر وظائف الخلوية مماثلة لأنسجة المنشأ الخاصة بهم. في الواقع، فإن الأعضاء تُخزّن ليس فقط التنظيم الهيكلي للأقبية في الجسم الحي، ولكن أيضاً العديد من السمات الجزيئية، وبالتالي توفير أدوات مفيدة لدراسة البيولوجيا الطبيعية وحالات المرض. لتوضيح ذلك، كشفت الدراسات العضوية مسارات جزيئية جديدة تشارك في تجديد الأنسجة1،2،3،4،5، فضلا عن الأدوية التي يمكن أن تعزز وظيفة في الإعدادات المرضية6،7.
دراسة الخلايا الجذعية المعوية ذات أهمية خاصة لأن بطانة الأمعاء هي من بين أنسجة الثدييات الأكثر تجديدا للغاية، وتجديد نفسها كل 3-5 أيام لحماية الكائن الحي من البكتيريا والسموم، وغيرها من مسببات الأمراض داخل اللومن المعوية. الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) هي المسؤولة عن هذه القدرة التجديدية الرائعة وبالتالي توفير نموذج فريد لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية الكبار1،2. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب في الفئران أن الخلايا الجذعية الإيجابية Lgr5 المعزولة يمكن أن يتم زرعها لتوليد أجهزة عضوية ثلاثية الدائية أو "أحشاء صغيرة" في المختبر حيث تعكس عن كثب نظيراتها في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستمد الثقافات العضوية من عزل خلايا سرداب الأمعاء تتألف من الذرية، ISCs، وخلايا بانيث، وهذا الأخير التي تشكل الخلايا المتخصصة الظهارية في الجسم الحي. في الواقع، تطورت الثقافة العضوية من خلايا سرداب الأمعاء الأولية إلى تقنية روتينية نسبيا التي من السهل تنفيذها في معظم المختبرات باستخدام الكواشف المتاحة على نطاق واسع. هذا النموذج هو أيضا قابلة للتحليل الكمي للتعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) والبروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي، والكيمياء المناعية، أو تلطيخ الفلورسنت المناعي2،4،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة علم الوراثة الوظيفية باستخدام كسب الوظيفة (التعبير المفرط للجين أو التعبير عن جين متحول المنشط) أو فقدان الوظيفة (إسكات الجينات أو التعبير عن متحولة فقدان الوظيفة) النهج2.
والأهم من ذلك، أن انخفاض الكفاءة والسمية العالية للحمض النووي البلازمي القياسي أو بروتوكولات الانكل الفيروسي مع البوليبرين لا تزال تشكل عقبة رئيسية في هذا المجال. على الرغم من أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم بدقة، فإن هذا النهج يتطلب اختيارًا يستغرق وقتاً طويلاً متبوعًا بالتحقق من صحة التسلسل9. هنا، نقدم بروتوكول تحويل الفيروسية للأعضاء المعوية الأولية التي يحسن تسليم الجسيمات الفيروسية عن طريق الاقتران إلى الجسيمات النانوية المغناطيسية وتطبيق حقل مغناطيسي. وترد التعديلات الرئيسية على البروتوكولات السابقة4و5و10و11و12 و13 وتوصيات لتعزيز الكفاءة. كما نقوم بوصف نهج لتوليد أقسام مجمدة من الأعضاء السليمة المستزرعة في matrigel 3D (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم مصفوفة غشاء الطابق السفلي أو مصفوفة) لمزيد من التحليل مع الكيمياء المناعية أو تلطيخ الفلورسنت المناعي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

توفر الثقافات العضوية المعوية فرصة فريدة للتحقيق في الخلايا الجذعية المعوية وبيولوجيا السرداب في المختبر، على الرغم من أن النهج الفعالة للتعامل مع التعبير الجيني في الأعضاء قد حققت تقدما محدودا في هذا المجال. في حين أن تكنولوجيا CRISPR/Cas9 تسمح بتحرير الجينوم الدقيق للخلايا لتوليد الأعضاء، فإن هذه الاستراتيجية تتطلب اختيارًا وفرزًا واسعًا من خلال تحليل التسلسل، وهو أمر يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفًا على حد سواء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لنقل الفيروسية كفاءة من الأعضاء المعوية. هذا النهج سريع وعالي الكفاءة، وبالتالي تقليل الوقت والنفقات المتأصلة في تكنولوجيا CRISPR/Cas9. كما نقدم بروتوكولا لتوليد أقسام مجمدة من الثقافات العضوية سليمة لمزيد من التحليل مع تلطيخ المناعية الكيميائية أو الفلورسنت المناعية، والتي يمكن استخدامها لتأكيد التعبير الجيني أو إسكات. بعد أن يتم تحقيق انتقال ناجح من النواقل الفيروسية للتعبير الجيني أو إسكات، يمكن تقييم الخلايا الجذعية المعوية ووظيفة سرداب بسرعة. على الرغم من أن معظم الدراسات العضوية تستخدم في الاختبارات المختبرية، يمكن أيضا أن يتم تسليم الأعضاء إلى الفئران للتحليلات الوظيفية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن نُهجنا مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية للأدوية لأن العلاجات المتاحة حاليا تعمل عموما عن طريق تعديل التعبير الجيني أو وظيفة البروتين بدلا من تغيير الجينوم.

هنا، ونحن نصف تقنية نقل سريعة وعالية الكفاءة التي تسخر الجسيمات النانوية المغناطيسية المعرضة لحقل مغناطيسي لتسليم فيروس لينتي إلى الخلايا ذات الأهمية. مع الأدوات المتاحة بسهولة، قمنا بتطبيق هذا النهج ليس فقط لنقل خلايا سرداب معزولة حديثا (الشكل 1A)،ولكن ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

نحن نصف تعليمات خطوة بخطوة إلى: 1) هندسة بكفاءة الأعضاء المعوية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية للاندوشن لينتي أو الرجعية، و، 2) توليد أقسام المجمدة من الأعضاء المهندسة. ويوفر هذا النهج أداة قوية لتغيير التعبير الجيني بكفاءة في الأعضاء للتحقيق في الآثار النهائية.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

لأن organoids خيّر التنظيم الهيكلي الأصلي ، فضلا عن العديد من الميزات الجزيئية للظهارة المعوية في الجسم الحي ، وهذه التقنية تسمح لنا لدراسة علم الأحياء الطبيعي والدول المرض في المختبر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على هندسة العضيات وراثيا باستخدام نهج تحويل عالي الكفاءة مع انخفاض السمية الخلوية، مما يسمح بإجراء دراسات وظيفية لهذه العضوية التي يتم التلاعب بها وراثيا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج لمرض الأمعاء لأننا يمكن أن نعرض الأعضاء المعوية للأدوية وغيرها من العوامل أو التدخلات.يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة العمليات التنموية وعلم الأمراض في أنظمة أخرى قابلة للثقافات العضوية، مثل أنسجة الثدي أو الخلايا التي تنمو في ظل ظروف 2D القياسية. عموما، سوف ينجح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع تحويل في الأجهزة التي يصعب هندسها أو الخلايا الأخرى. كان لدينا فكرة لأول مرة لهذه الطريقة عندما واجهنا صعوبات في تحويل organoids والخلايا الجذعية.إن العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يمكن أن يحدث فقدان هيكلي للعضيات إذا لم يتم التعامل مع العينات بشكل صحيح أثناء عملية التضمين في مصفوفة الطابق السفلي لتكريبها. لزراعة organoids لtransduction الفيروسية، بذور الثقافات الخلايا العضوية مع 200 ميكرولترات من متوسطة تحويل في بئر في لوحة 48-well، واحتضان في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية. ذوبان قنينات من الفيروس لtransduction، مما يسمح لحوالي 50 ميكرولترات من الفيروس المركزة لtransduction كل بئر في 48-آبار.في أنبوب 1.5 ملليلتر، اخلطي الفيروس مع 12 ميكرولترات من محلول جسيمات نانوية مغناطيسية، وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة، إضافة حل الجسيمات النانوية المغناطيسية وخليط الفيروس إلى الخلايا التي سيتم تحويلها. ضع لوحة 48-well على لوحة مغناطيسية، واحتضان في حاضنة ثقافة الأنسجة القياسية لمدة ساعتين على الأقل.عندما يكتمل نقل العدوى الفيروسية، قم بنقل مجموعات الخلايا العضوية المصابة ووسيلة النقل من كل بئر إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant مع شفط لطيف، وتبريد الأنابيب التي تحتوي على بيليه على الجليد لمدة خمس دقائق.إضافة 120 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى كل أنبوب، وإعادة تعليق بيليه عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا. بذور 30 ميكرولتر قطرات من خليط الخلية المصفوفية في لوحة جديدة 48 جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 15 دقيقة حتى مصفوفة يقوي.إضافة وسيطة النقل إلى كل بئر، واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة القياسية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، تفقد الثقافات تحت مجهر خفيف في التكبير 10x لضمان تنظيم مجموعات الخلايا في هياكل الجهاز. استبدال بلطف وسيطة النقل في كل بئر مع 250 ميكرولترات من الاستزراع العضوي ENR المتوسطة.أعيدوا الصحن إلى الحاضنة. ابدأ هذا الإجراء بإزالة وسيط ENR عن طريق الشفط اللطيف ، مع الحرص على عدم إزعاج مصفوفة الغشاء السفلي. غسل بلطف مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.إصلاح organoids بإضافة ميكرولتر واحد من 4٪ محلول paraformaldehyde في البئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة، إزالة حل paraformaldehyde عن طريق الشفط. إضافة بلطف ميكرولتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر، ومن ثم إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق شفط لطيف.بهذه الطريقة، اغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني من غسل الثانية، وإضافة ميكرولتر واحد من 30٪ sucrose العازلة لكل عينة. احتضان الأعضاء الثابتة في السكروز لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية لتجفيف العينات.إزالة المخزن المؤقت السكروز عن طريق الشفط، وإضافة مجمع تضمين ما يكفي فقط لتغطية طبقة المصفوفة في كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، ضع العينات في ثلاجة مئوية ناقص 80 درجة لمدة 10 دقائق أو حتى يتحول مركب التضمين إلى صلبة وأبيض.ضع اللوحة مع مركب التضمين المجمد في درجة حرارة الغرفة للسماح بالحد الأدنى من ذوبان المجمع على طول الحواف. استخدم مشرط أو ملعقة لفصل الكتلة عن جدران البئر. العمل بسرعة لمنع ذوبان، وذلك باستخدام ملقط لإزالة كتلة مجمع المصفوفة تضمين، ووضعها في كتلة عينة.ملء القالب تماما مع مجمع التضمين. تجميد في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل استخدام كتلة للقطع. تم تحسين هذا البروتوكول عن طريق تحويل أول organoids المعوية مع ناقلات العدسي المرتبطة GFP.تم تصور GFP في كل مرحلة من مراحل التطور العضوي ، بما في ذلك في وقت مبكر عندما تنظم الخلايا سرداب في هياكل تشبه الكيس أو في وقت لاحق عندما تشكل البراعم العضوية. تم بعد ذلك نقل الأعضاء المعوية المستحثة بنجاح بشكل رسمي ثابت ، تم اباكية ، وتحليلها عن طريق تصوير المناعة. في هذه الصورة، النوى ملطخة باللون الأزرق، والأخضر يشير إلى جزيئات التصاق الخلايا الظهارية، التي تحدد حدود الخلية.يشير اللون الأحمر إلى تلطيخ الليسوسوم لتحديد خلايا بانيث. مرة واحدة يتقن، يمكن إجراء organoids transducing في حوالي ثلاث ساعات، ويمكن أن يتم تضمين النخاع العضوي في حوالي 2 1/2 ساعة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للعمل على الجليد عند التعامل مع الكواشف مصفوفة الطابق السفلي.بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل الفلورسنت المناعية وغيرها من الطرق للكشف عن البروتينات أو العضيات لتقييم التوطين أو الوفرة النسبية. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف علم الأحياء الطبيعي والمرض في الدول في المختبر وأيضا في دراسات في الجسم الحي إذا كان organoids أو الخلايا المستحثة يمكن زرعها في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفيروسات التي تحمل علامة مغناطيسية لهندسة organoids وراثيا للتبريد.يرجى عدم نسيان أن العمل مع الفيروسات يمكن أن يكون خطيرا للغاية، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات واقية مناسبة دائما عند تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

باستخدام الثقافات Neurosphere الأولية لدراسة الابتدائية سيليا

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

التتبع الوراثي الكلونال باستخدام الماوس الحلويات لدراسة الانسجه المعدنية

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

خلاصه الرضاعة إلى الفطام الانتقالية في المختبر باستخدام الغدد المعوية الجنينية

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...