Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland stamcelleforskning fond (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American Lung Association, den Allegheny Health Network-Johns Hopkins forskningsfond og Hopkins fordøjelsessygdomme grundlæggende forskning kerne Center.

Denne protokol blev godkendt af Johns Hopkins Medical Institutionsudvalget for dyrepasning og-anvendelse (IACUC). Denne protokol er ændret fra en tidligere offentliggjort metoder10,11,12,13.
1. klargøring af reagenser
<ol><li>Forbered frisk 293T medium flere timer i forvejen og varm til 37 °C i et vandbad i mindst 10 min før brug (tabel 1).</li...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

Primær kultur af voksne tarm epitelet som organoider giver et kraftfuldt værktøj til at studere molekylære mekanismer involveret i stamcelle funktion, intestinal epitelial homøostase, og patologi1,2,3, 4. Selv om CRISPR/Cas9 teknologi kan bruges til genetisk ingeniør organoids9, er det begrænset af behovet for omfattende screening og udvælgelse baseret på Sekve...

Evnen til at kultur mus eller menneskelige Krypter celler som tredimensionale (3D) organoider fra små tarme eller kolon over langvarige perioder forudsat et stort gennembrud, fordi disse kulturer viser definerende funktioner i tarm epitelet in vivo 1 , 2 , 3. organoider afledt af primære Krypter er i stand til selvfornyelse og selvorganisering, udstiller cellulære funktioner svarende til deres væv af oprindelse. Faktisk, organoider rekapitulere ikke kun den strukturelle organisation af Krypter in vivo, men også mange molekylære træk, hvilket giver nyttige værktøjer til at studere normale biologi og sygdomstilstande. For at illustrere, organoid undersøgelser har afsløret nye molekylære veje involveret i vævsregeneration1,2,3,4,5 samt lægemidler, der kan forbedre funktionen i patologiske indstillinger6,7.
Studiet af tarm stamceller er af særlig interesse, fordi tarmslimhinden er blandt de mest regenerativ pattedyrs væv, forny sig hver 3-5 dage for at beskytte organismen mod bakterier, toksiner og andre patogener inden for tarm lumen. Tarm stamceller (ISCs) er ansvarlige for denne bemærkelsesværdige regenerativ kapacitet og dermed give et unikt paradigme for at studere voksen stamcelle funktion1,2. Lineage-Tracing eksperimenter i mus viste, at isolerede Lgr5-positive stamceller kan dyrkes for at generere 3D-organoider eller ' mini-Guts ' in vitro, hvor de nøje afspejler deres in vivo-modparter. Organoide kulturer kan også udledes af intestinal Crypt celle isolater bestående af stamceller, Isc'er og Paneth cellerne, hvoraf sidstnævnte udgør epitelial niche celler in vivo. Faktisk har organoid kultur fra primære intestinale Crypt-celler udviklet sig til en relativt rutinemæssig teknik, der er let at implementere i de fleste laboratorier ved hjælp af alment tilgængelige reagenser. Denne model er også modtagelig for kvantitativ analyse af genekspression ved RNA-sekventering (RNA-SEQ) og proteiner ved massespektrometri, immunhistokemi eller immunfluorescent farvning2,4,8. Desuden kan funktionel genetik undersøgt ved hjælp af Gain-of-funktion (gen overekspression eller udtryk for et aktiverende mutant gen) eller tab af funktion (genhæmning eller udtryk af en tab-of-Function mutant) tilgange2.
Vigtigere, lav effektivitet og høj toksicitet af standard plasmid DNA eller viral transduktionsprotokoller med polybrene forbliver en stor forhindring i marken. Selvom crispr/Cas9-teknologien giver mulighed for præcis genom-redigering, kræver denne fremgangsmåde tidskrævende valg efterfulgt af sekvens validering9. Her præsenterer vi en viral transduktionsprotokol for primære intestinale organoider, der optimerer leveringen af virale partikler ved konjugering til magnetiske nanopartikler og anvendelse af et magnetfelt. Der gives vigtige ændringer af tidligere protokoller4,5,10,11,12,13 og anbefalinger til forbedring af effektiviteten. Vi beskriver også en tilgang til at generere frosne sektioner fra intakte organoider dyrket i 3D matrigel (fremover benævnt kælder membran matrix eller matrix) til yderligere analyse med Immunhistokemi eller immunfluorescent farvning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Tarm organoid kulturer giver en enestående mulighed for at undersøge tarm stamcelle og Crypt biologi in vitro, selv om effektive tilgange til at manipulere genekspression i organoider har gjort begrænsede fremskridt i denne arena. Mens CRISPR/Cas9-teknologien giver mulighed for præcis genomredigering af celler til organoid-generering, kræver denne strategi omfattende udvælgelse og screening ved Sekvensanalyse, hvilket både er tidskrævende og dyrt. Her giver vi en detaljeret protokol til effektiv viral transduktion af intestinale organoider. Denne fremgangsmåde er hurtig og yderst effektiv og mindsker dermed den tid og omkostning, der er forbundet med CRISPR/Cas9-teknologien. Vi præsenterer også en protokol til at generere frosne sektioner fra intakt organoid kulturer til yderligere analyse med immunohistokemiske eller immunfluorescent farvning, som kan bruges til at bekræfte genekspression eller hæmning. Efter vellykket transduktion af virale vektorer for genekspression eller lyddæmpningen opnås, kan tarm stamcelle og Crypt funktion hurtigt vurderes. Selv om de fleste organoid-studier anvender in vitro-assays, kan organoider også leveres til mus til in vivo funktionelle analyser. Desuden er vores tilgange er fordelagtige for at forudsige terapeutiske reaktioner på narkotika, fordi øjeblikket tilgængelige behandlinger generelt fungerer ved at modulerende genekspression eller protein funktion i stedet for at ændre genomet.

Her beskriver vi en hurtig og yderst effektiv transduktionsteknik, som udnytter magnetiske nanopartikler, der er udsat for et magnetfelt, til at levere lentivirus til celler af interesse. Med let tilgængelige værktøjer har vi anvendt denne fremgangsmåde ikke kun til at transduceres frisk isolerede krypt celler (figur 1a), men også til organoider (figur 2) og andre celler, der er refraktære over for mere rutinemæssige trans...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknologi af primære mus intestinale Organoider ved hjælp af magnetisk nanopartikel Transduktionsvirale vektorer for frosne skæring

Vi beskriver trin-for-trin instruktioner til: 1) effektivt ingeniør tarm organoider ved hjælp af magnetiske nanopartikler til Lenti-eller antiretroviral transduktion, og, 2) generere frosne sektioner fra manipuleret organoider. Denne fremgangsmåde giver et effektivt værktøj til effektiv ændring af genekspression i organoider til undersøgelse af downstream-effekter.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Fordi organoider opsummere den indfødte strukturelle organisation, samt mange molekylære træk ved intestinal epitel in vivo, denne teknik giver os mulighed for at studere normal biologi og sygdom stater i laboratoriet. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at gensplejse organoider ved hjælp af en meget højeffektiv transduktionsmetode med lav cytotoksicitet, hvilket giver mulighed for funktionelle undersøgelser af disse genetisk manipulerede organoider. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling for tarmsygdom, fordi vi kan udsætte tarmorganoider til lægemidler og andre agenter eller interventioner.Denne metode kan anvendes til at studere udviklingsmæssige og patologiske processer i andre systemer modtagelige for organoid kulturer, såsom brystvæv eller for celler vokser under standard 2D-betingelser. Generelt, personer nye til denne metode vil lykkes med transduktion i vanskelige at manipulere organoider eller andre celler. Vi fik først ideen til denne metode, da vi stødte på vanskeligheder med at transducere vores organoider og stamceller.Visuel demonstration af denne metode er afgørende, da strukturelle tab af organoider kan forekomme, hvis prøverne ikke behandles korrekt under indlejringsprocessen i kældermatrixen til kryosektion. At dyrke organoider til viral transduktion, frø organoid cellekulturer med 200 mikroliter af transduktionsmedium pr brønd i en 48-brønd plade, og inkubere i en standard væv kultur inkubator. Optø hætteglas med virus til transduktion, hvilket giver mulighed for ca. 50 mikroliter koncentreret virus til transduktion af hver brønd i 48 brøndplader.I et 1,5 milliliterrør blandes virusset med 12 mikroliter af en magnetisk nanopartikelopløsning, og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter 15 minutter tilsættes den magnetiske nanopartikelopløsning og virusblanding til de celler, der skal transducederes. Placer 48-brønd plade på en magnetisk plade, og inkuberes i en standard væv kultur inkubator i mindst to timer.Når den virale transinfektion er færdig, overføres de inficerede organoidcelleklynger og transduktionsmedium fra hvert brøndrør til et 1,5 milliliterrør. Centrifuge ved 500 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten med skånsom suge, og afkøl de rør, der indeholder pellet på is i fem minutter.Tilføj 120 mikroliter af kælderen membran matrix til hvert rør, og resuspend pellet ved langsomt pipettering op og ned. Seed 30-mikroliter dråber af matrix-celle blandingen i en ny 48-brønd plade. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem til 15 minutter, indtil matrixen størkner.Tilføj transduktionsmedium til hver brønd, og inkuberes i en standard væv kultur inkubator i tre til fire dage. Efter tre til fire dage inspiceres kulturerne under et let mikroskop ved 10x forstørrelse for at sikre organiseringen af celleklynger i organoidstrukturer. Udskift forsigtigt transduktionsmediet i hver brønd med 250 mikroliter organoidkultur ENR medium.Returner pladen til inkubatoren. Begynd denne procedure ved at fjerne ENR-mediet ved skånsom sugning, og pas på ikke at forstyrre kældermembranmatrixen. Vask forsigtigt med 500 mikroliter PBS.Fix organoiderne ved at tilføje en mikroliter på 4% paraformaldehydopløsning pr. brønd, og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter 30 minutter fjernes paraformaldehydopløsningen ved sugning. Tilsæt forsigtigt en mikroliter PBS pr. brønd, og fjern derefter PBS ved skånsom sugning.På denne måde vaskes to gange med PBS. Fjern PBS fra den anden vask, og tilsæt en mikroliter på 30% saccharose buffer til hver prøve. De faste organoider in saccharose in sucrose in a time at dehydrere prøverne.Fjern saccharose buffer ved sugning, og tilsæt lige nok indlejring sammensatte til at dække matrix lag i hver brønd. Inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Dernæst placere prøverne i en minus 80-graders Celsius fryser i 10 minutter, eller indtil indlejring sammensatte bliver fast og hvid.Placer pladen med frossen indlejring sammensatte ved stuetemperatur for at give mulighed for minimal smeltning af forbindelsen langs kanterne. Brug en skalpel eller spatel til at adskille blokken fra væggene i brønden. Arbejd hurtigt for at forhindre smeltning ved hjælp af kraftpiskere til at fjerne matrixindlejringsblokken, og placer den i en prøveblok.Fyld formen helt med indlejring sammensatte. Frys ved minus 80 grader Celsius i 30 minutter, før du bruger blokken til trækning. Denne protokol blev optimeret ved første transducer intestinale organoider med lentivirale vektorer forbundet med GFP.GFP blev visualiseret på hvert trin i organoid udvikling, herunder tidligt, når kryptceller organisere sig i cyste-lignende strukturer eller på et senere tidspunkt punkter, hvor organoids form knopper. Vellykket transduced intestinale organoider blev derefter formalin-fast, kryosektioneret, og analyseret af immunofluorescens imaging. I dette billede er kerner plettet i blåt, og den grønne angiver epitelcelle adhæsion molekyler, som afgrænser cellegrænser.Den røde angiver lysosome farvning for at identificere paneth celler. Når mestrer, transducerende organoider kan udføres i omkring tre timer, og organoids crysection indlejring kan gøres i omkring 2 1/2 time. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at arbejde på is, når håndtering kælder matrix reagenser.Efter at have afsluttet denne procedure, immunofluorescerende analyse og andre metoder til at opdage proteiner eller organeller kan udføres for at vurdere lokalisering eller relativ overflod. Denne teknik baner vejen for forskere til at udforske normal biologi og sygdom stater in vitro og også for in vivo undersøgelser, hvis de transduced organoider eller celler kan implanteres i mus. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man bruger magnetisk mærket virus til genetisk ingeniør organoids til kryosektionering.Glem ikke, at arbejde med virus kan være yderst farligt, og forholdsregler såsom at bære passende beskyttelsesudstyr bør altid foretages, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generation af induceret pluripotente stamceller fra Frozen Buffy Coats hjælp Ikke integrere episomale plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generering Primær fibroblastkulturer fra museøre og hale Væv

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Vurdering af cardiomyocyte DNA Synthesis og Ploidi: En metode til at hjælpe Kvantificering af cardiomyocyte Regeneration og Omsætning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Brug Primære Neurosfære kulturer til at studere Primær Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation af Organoids fra mus ekstrahepatisk galdeveje

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk sporing ved hjælp af Confetti-musen til at studere mineraliseret væv

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Sammenfatning af Suckling-til-fravænning overgang in vitro ved hjælp af føtale tarm Organoider

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...