Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), het Maryland stamcel Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de American Lung Association, het Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund en de Hopkins spijsverterings ziekten Basic Research core Center.

Dit protocol werd goedgekeurd door de Johns Hopkins Medical instellingen Animal Care en use Committee (IACUC). Dit protocol is gewijzigd van een eerder gepubliceerde methoden10,11,12,13.
1. bereiding van de reagentia
<ol><li>Bereid vers 293T medium enkele uren van tevoren en warm tot 37 °C in een waterbad gedurende ten minste 10 minuten voor gebruik (tabel...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

Primaire cultuur van volwassen intestinale epitheel als organoïden biedt een krachtig hulpmiddel om moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij stamcel functie, intestinale epitheliale homeostase en pathologie1,2,3, 4. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie kan worden gebruikt voor genetisch gemanipuleerde organoïden9, wordt het beperkt door de noodzaak van u...

De mogelijkheid om te cultuur muis of menselijke crypten cellen als driedimensionale (3D) organoïden uit de dunne darmen of dikke darm over langere tijd perioden voorzien van een grote doorbraak, omdat deze culturen weergeven definiëren kenmerken van intestinale epitheel in vivo 1 , 2 , 3. organoïden afgeleid van primaire crypten zijn in staat om zelf vernieuwing en zelforganisatie, exposeren cellulaire functies vergelijkbaar met hun weefsels van oorsprong. Inderdaad, organoïden recapituleren niet alleen de structurele organisatie van crypten in vivo, maar ook veel moleculaire kenmerken, waardoor het verstrekken van nuttige instrumenten om normale biologie en ziektetoestanden te bestuderen. Ter illustratie, organoïde studies hebben aangetoond dat nieuwe moleculaire trajecten die betrokken zijn bij weefselregeneratie1,2,3,4,5 en geneesmiddelen die de functie kunnen verbeteren in pathologische instellingen6,7.
De studie van intestinale stamcellen is van bijzonder belang omdat de intestinale voering behoort tot de meest zeer regeneratieve zoogdier weefsels, die zich elke 3-5 dagen vernieuwt om het organisme te beschermen tegen bacteriën, toxines en andere pathogenen binnen de intestinale lumens. Intestinale stamcellen (iSCS) zijn verantwoordelijk voor dit opmerkelijke regeneratieve vermogen en bieden zo een uniek paradigma voor het bestuderen van de volwassen stamcel functie1,2. Lineage-tracing experimenten bij muizen toonden aan dat geïsoleerde Lgr5-positieve stamcellen gekweekt kunnen worden om 3D-organoïden of ' mini-Guts ' in vitro te genereren, waar ze hun in vivo-tegenhangers nauwkeurig weerspiegelen. Organoïde culturen kunnen ook worden afgeleid van intestinale crypte van cellen die bestaan uit voor ouders, ISCs en Paneth, waarvan de laatste de epitheliale niche cellen in vivo vormen. In feite is de organoïde cultuur uit primaire intestinale crypte cellen geëvolueerd tot een relatief routinematige techniek die gemakkelijk te implementeren is in de meeste laboratoria met behulp van algemeen beschikbare reagentia. Dit model is ook vatbaar voor kwantitatieve analyse van genexpressie door RNA-sequencing (RNA-SEQ) en eiwitten door massaspectrometrie, Immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring2,4,8. Daarnaast kan functionele genetica worden bestudeerd met behulp van gain-of-function (gen-overexpressie of expressie van een activerend Mutant gen) of verlies van functie (gen-uitschakeling of expressie van een verlies-van-functie Mutant) benaderingen2.
Belangrijk, laag rendement en hoge toxiciteit van standaard plasmide DNA of virale transductie protocollen met polybrene blijven een grote hindernis in het veld. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie een precieze genoom bewerking mogelijk maakt, vereist deze aanpak tijdrovende selectie gevolgd door sequentie validatie9. Hier presenteren we een virale transductie protocol voor primaire intestinale organoïden dat de levering van virale deeltjes optimaliseert door conjugatie aan magnetische nanopartikels en de toepassing van een magnetisch veld. Belangrijke wijzigingen in de voorafgaande protocollen4,5,10,11,12,13 en aanbevelingen ter verbetering van de efficiëntie worden verstrekt. We beschrijven ook een aanpak voor het genereren van bevroren secties van intacte organoïden gekweekt in 3D matrigel (hierna te noemen kelder membraan matrix of matrix) voor verdere analyse met immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Intestinale organoïde culturen bieden een unieke kans om te onderzoeken intestinale stamcel en crypt biologie in vitro, hoewel efficiënte benaderingen voor het manipuleren van genexpressie in organoïden beperkte vooruitgang in deze arena hebben gemaakt. Hoewel crispr/Cas9 technologie het mogelijk maakt om cellen te bewerken voor organoïde generatie, vereist deze strategie een uitgebreide selectie en screening door sequentieanalyse, wat zowel tijdrovend als kostbaar is. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor efficiënte virale transductie van intestinale organoïden. Deze aanpak is snel en zeer efficiënt, waardoor de tijd en kosten die inherent zijn aan CRISPR/Cas9 technologie afnemen. We presenteren ook een protocol voor het genereren van bevroren delen van intacte organoïde culturen voor verdere analyse met immunohistochemische of immunofluorescentie kleuring, die kan worden gebruikt om genexpressie of uitschakeling te bevestigen. Na succesvolle transductie van virale vectoren voor genexpressie of geluids dempings wordt bereikt, kunnen de intestinale stamcel en de crypte functie snel worden beoordeeld. Hoewel de meeste organoïde-onderzoeken in vitro testen gebruiken, kunnen organoïden ook bij muizen worden afgeleverd voor in-vivo-functionele analyses. Bovendien zijn onze benaderingen voordelig bij het voorspellen van therapeutische reacties op geneesmiddelen, omdat momenteel beschikbare therapieën doorgaans functioneren door het moduleren van genexpressie of eiwit functie in plaats van het genoom te veranderen.

Hier beschrijven we een snelle en zeer efficiënte transductie techniek die magnetische nanodeeltjes die worden blootgesteld aan een magnetisch veld, maakt om lentivirus aan cellen van belang te leveren. Met gemakkelijk verkrijgbare hulpmiddelen hebben we deze aanpak niet alleen toegepast om vers geïsoleerde crypt cellen (Figuur 1a) te leiden, maar ook voor organoïden (Figuur 2) en andere cellen die ongevoelig zijn voor meer ro...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Omdat organoïden de inheemse structurele organisatie samenvatten, evenals vele moleculaire kenmerken van darmeptheel in vivo, stelt deze techniek ons in staat om normale biologie en ziektetoestanden in het laboratorium te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om organoïden genetisch te manipulatie met behulp van een zeer efficiënte transductiebenadering met lage cytotoxiciteit, waardoor functionele studies van deze genetisch gemanipuleerde organoïden mogelijk zijn. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie voor darmziekten omdat we darmorganoïden kunnen blootstellen aan medicijnen en andere middelen of interventies.Deze methode kan worden toegepast op het bestuderen van ontwikkelings- en pathologische processen in andere systemen die vatbaar zijn voor organoïde culturen, zoals borstweefsels of voor cellen die groeien onder standaard 2D-omstandigheden. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode slagen met transductie in moeilijk te ontwerpen organoïden of andere cellen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het transduceren van onze organoïden en stamcellen.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als structureel verlies van de organoïden kan optreden als monsters niet goed worden behandeld tijdens het inbeddingsproces in de kelder matrix voor cryosectioning. Om organoïden te kweken voor virale transductie, zaad organoïde celculturen met 200 microliters van transductie medium per put in een 48-well plaat, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator. Dooi flacons van virus voor transductie, waardoor ongeveer 50 microliter geconcentreerd virus voor de transductie van elke put in 48-well platen.Meng in een buis van 1,5 milliliter het virus met 12 microliter van een magnetische nanodeeltjesoplossing en ontcubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 15 minuten de magnetische nanodeeltjesoplossing en het virusmengsel toe aan de te transduceren cellen. Plaats de 48-well plaat op een magnetische plaat, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator voor ten minste twee uur.Wanneer de virale transfectie is voltooid, breng de geïnfecteerde organoïde cel clusters en transductie medium van elke put in een 1,5-milliliter buis. Centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant met zachte zuigkracht, en koel de buizen met de pellet op ijs gedurende vijf minuten.Voeg 120 microliters van kelder membraan matrix aan elke buis, en resuspend de pellet door langzaam pipetter op en neer. Zaad 30-microliter druppels van het matrix-celmengsel in een nieuwe 48-put plaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf tot 15 minuten totdat de matrix stolt.Voeg transductie medium aan elke put, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator voor drie tot vier dagen. Na drie tot vier dagen, inspecteer de culturen onder een lichtmicroscoop bij 10x vergroting om de organisatie van celclusters in organoïde structuren te verzekeren. Vervang het transductiemedium in elke put voorzichtig door 250 microliter organoïde cultuur ENR medium.Breng de plaat terug naar de couveuse. Begin deze procedure door het VERWIJDEREN van de ENR medium door zachte zuigkracht, voorzichtig niet te verstoren de kelder membraan matrix. Was voorzichtig met 500 microliter PBS.Bevestig de organoïden door een microliter van 4% paraformaldehydeoplossing per put toe te voegen en 30 minuten bij kamertemperatuur in te broeden. Verwijder na 30 minuten de paraformaldehydeoplossing door afzuiging. Voeg voorzichtig een microliter PBS per put toe en verwijder de PBS door zachte zuigkracht.Op deze manier, was twee keer met PBS. Verwijder de PBS uit de tweede wasbeurt en voeg één microliter van 30% sacharosebuffer toe aan elk monster. Incubeer de vaste organoïden in sacharose gedurende een uur bij vier graden Celsius om de monsters te dehydrateren.Verwijder de sacharose buffer door zuiging, en voeg net genoeg inbedding verbinding om de matrixlaag in elke put te dekken. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Plaats vervolgens de monsters in een min 80-graden Celsius vriezer gedurende 10 minuten of totdat de inbedding verbinding wordt solide en wit.Plaats de plaat met bevroren inbedding verbinding op kamertemperatuur om voor een minimale smelten van de verbinding langs de randen. Gebruik een scalpel of spatel om het blok te scheiden van de muren van de put. Werk snel om smelten te voorkomen, met behulp van tangen om de matrix inbedding compound blok te verwijderen, en plaats het in een monster blok.Vul de mal volledig met inbedding verbinding. Vries 30 minuten in bij min 80 graden Celsius voordat u het blok gebruikt voor het doorsnede. Dit protocol werd geoptimaliseerd door de eerste transducerende darmorganoïden met lentivirale vectoren gekoppeld aan GFP.De GFP werd gevisualiseerd in elke fase in organoïde ontwikkeling, ook al vroeg wanneer cryptische cellen zich organiseren in cyste-achtige structuren of op latere momenten wanneer organoïden knoppen vormen. Met succes getransduceerde darmorganoïden werden vervolgens formeel gefixeerd, cryosectioned, en geanalyseerd door immunofluorescentie beeldvorming. In deze afbeelding worden kernen in blauw gekleurd en het groen geeft epitheliale celhechtingmoleculen aan, die celranden afbakenen.De rode geeft lysosome vlekken aan om Paneth cellen te identificeren. Eenmaal onder de knie, transducerende organoïden kunnen worden uitgevoerd in ongeveer drie uur, en organoïden crysection inbedding kan worden gedaan in ongeveer 2 1/2 uur. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te werken op ijs bij de behandeling van kelder matrix reagentia.Na het voltooien van deze procedure kunnen immunofluorescente analyse en andere methoden om eiwitten of organellen te detecteren worden uitgevoerd om lokalisatie of relatieve overvloed te beoordelen. Deze techniek effent de manieren voor onderzoekers om normale biologie en ziektetoestanden in vitro te verkennen en ook voor in vivo studies als de getransduceerde organoïden of cellen in muizen kunnen worden geïmplanteerd. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe magnetisch gelabelde virussen te gebruiken om genetisch ingenieur organoïden voor cryosectioning.Vergeet niet dat het werken met virussen zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste beschermende kleding moet altijd worden uitgevoerd bij het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapituleren van de overgang van de suckling-to-Spening in vitro met foetale intestinale Organoïden

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...