Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), du Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de l'American Lung Association, de l'Allegheny Health Network - Johns Hopkins Research Fund et le Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.

Ce protocole a été approuvé par le Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Ce protocole est modifié à partir d'une méthode déjà publiée10,11,12,13.
1. Préparation des réactifs
<ol><li>Préparer le milieu frais 293T plusieurs heures à l'avance et réchauffer à 37 oC dans un bain d'eau pendant au moins 10 min avant utili...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

La culture primaire de l'épithélium intestinal adulte comme organoïdes fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de cellules souches, l'homéostasie épithéliale intestinale, et la pathologie1,2,3, 4. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 puisse être utilisée pour modifier génétiquement les organoïdes9, elle...

La capacité de culture de la souris ou des cryptes humaines cellules comme des organoïdes tridimensionnels (3D) de l'intestin grêle ou du côlon sur de longues périodes de temps a fourni une percée majeure parce que ces cultures affichent des caractéristiques déterminantes de l'épithélium intestinal in vivo 1 Fois , 2 (en) , 3. Les organoïdes dérivés des cryptes primaires sont capables d'auto-renouvellement et d'auto-organisation, présentant des fonctions cellulaires semblables à leurs tissus d'origine. En effet, les organoïdes récapitulent non seulement l'organisation structurelle des cryptes in vivo, mais aussi de nombreuses caractéristiques moléculaires, fournissant ainsi des outils utiles pour étudier la biologie normale et les états de la maladie. Pour illustrer, les études organoïdes ont révélé de nouvelles voies moléculaires impliquées dans la régénération des tissus1,2,3,4,5 ainsi que des médicaments qui pourraient améliorer la fonction dans les milieux pathologiques6,7.
L'étude des cellules souches intestinales est d'un intérêt particulier parce que la muqueuse intestinale est parmi les tissus mammifères les plus fortement régénératrices, se renouvelant tous les 3-5 jours pour protéger l'organisme contre les bactéries, les toxines et autres agents pathogènes au sein de la lumens intestinaux. Les cellules souches intestinales (ISC) sont responsables de cette remarquable capacité de régénération et fournissent ainsi un paradigme unique pour l'étude de la fonction des cellules souches adultes1,2. Des expériences de traçage de lignée chez la souris ont démontré que les cellules souches isolées lgr5-positives peuvent être cultivées pour produire des organoïdes 3D ou « mini-guts » in vitro où elles reflètent étroitement leurs homologues in vivo. Les cultures organoïdes peuvent également être dérivées d'isolats cellulaires de crypte intestinale composés d'ancêtres, d'ISC et de cellules Paneth, ces dernières constituant les cellules de niche épithéliales in vivo. En fait, la culture organoïde des cellules primaires de crypte intestinale a évolué en une technique relativement routinière qui est facile à mettre en œuvre dans la plupart des laboratoires utilisant des réactifs largement disponibles. Ce modèle est également favorable à l'analyse quantitative de l'expression génique par le séquençage de l'ARN (ARN-Seq) et les protéines par spectrométrie de masse, immunohistochimie, ou coloration immunofluorescente2,4,8. En outre, la génétique fonctionnelle peut être étudiée à l'aide d'approches de gain de fonction (surexpression ou expression génique d'un gène mutant activant) ou de perte de fonction (silençage génétique ou expression d'un mutant en perte de fonction)approche 2.
Fait important, la faible efficacité et la toxicité élevée de l'ADN plasmide standard ou des protocoles de transduction virale avec du polybrene demeurent un obstacle majeur dans le domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une modification précise du génome, cette approche nécessite une sélection longue suivie d'une validation de séquence9. Ici, nous présentons un protocole de transduction virale pour les organoïdes intestinaux primaires qui optimise la livraison des particules virales par conjugaison aux nanoparticules magnétiques et l'application d'un champ magnétique. Les principales modifications apportées aux protocoles antérieurs4,5,10,11,12,13 et des recommandations pour améliorer l'efficacité sont fournies. Nous décrivons également une approche pour produire des sections congelées des organoïdes intacts cultivés dans le matrigel 3D (maintenant désigné sous le premier sous-sol matrice ou matrice de membrane) pour l'analyse plus approfondie avec l'immunohistochimie ou la coloration immunofluorescente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Les cultures d'organoïdes intestinaux offrent une occasion unique d'étudier la biologie intestinale des cellules souches et des cryptes in vitro, bien que des approches efficaces pour manipuler l'expression des gènes chez les organoïdes aient fait des progrès limités dans ce domaine. Bien que la technologie CRISPR/Cas9 permette une édition génomique précise des cellules pour la génération d'organoïdes, cette stratégie nécessite une sélection et un dépistage approfondis par analyse de séquences, ce qui est à la fois long et coûteux. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la transduction virale efficace des organoïdes intestinaux. Cette approche est rapide et très efficace, réduisant ainsi le temps et les dépenses inhérents à la technologie CRISPR/Cas9. Nous présentons également un protocole pour produire des sections congelées des cultures organoïdes intactes pour une analyse plus approfondie avec la coloration immunohistochimique ou immunofluorescente, qui peut être employée pour confirmer l'expression ou le silence de gène. Après la transduction réussie des vecteurs viraux pour l'expression ou le silence de gène est réalisé, la fonction intestinale de cellules souches et de crypte peut être rapidement évaluée. Bien que la plupart des études organoïdes utilisent des tests in vitro, les organoïdes peuvent également être livrés à des souris pour des analyses fonctionnelles in vivo. En outre, nos approches sont avantageuses pour prédire les réponses thérapeutiques aux médicaments parce que les thérapies actuellement disponibles fonctionnent généralement en modulant l'expression des gènes ou la fonction protéique plutôt que de modifier le génome.

Ici, nous décrivons une technique de transduction rapide et très efficace qui exploite les nanoparticules magnétiques exposées à un champ magnétique pour délivrer le lentivirus aux cellules d'intérêt. Avec des outils facilement disponibles, nous avons appliqué cette approche non seulement pour transduire des cellules cryptiques fraîchement isolées (Figure 1A), mais aussi pour les organoïdes (Figure 2) et d'autres cel...

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Puisque les organoïdes récapitulent l’organisation structurale indigène, aussi bien que beaucoup de dispositifs moléculaires de l’épithélium intestinal in vivo, cette technique nous permet d’étudier la biologie normale et les états de maladie dans le laboratoire. Le principal avantage de cette technique est la capacité de concevoir génétiquement organoïdes en utilisant une approche de transduction très efficace avec une faible cytotoxicité, permettant ainsi des études fonctionnelles de ces organoïdes génétiquement manipulés. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie pour la maladie intestinale parce que nous pouvons exposer des organoïdes intestinaux aux drogues et à d’autres agents ou interventions.Cette méthode peut être appliquée pour étudier les processus développementaux et pathologiques dans d’autres systèmes favorables aux cultures organoïdes, comme les tissus mammaires ou pour les cellules qui poussent dans des conditions 2D standard. En général, les personnes nouvelles à cette méthode réussiront avec la transduction dans les organoïdes difficiles à concevoir ou d’autres cellules. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons rencontré des difficultés à traduire nos organoïdes et nos cellules souches.La démonstration visuelle de cette méthode est critique car la perte structurale des organoïdes peut se produire si les échantillons ne sont pas correctement traités pendant le processus d’intégration dans la matrice du sous-sol pour la cryosection. Pour cultiver des organoïdes pour la transduction virale, les cultures de cellules organoïdes de graine avec 200 microlitres de milieu de transduction par puits dans une plaque de 48 puits, et d’incubation dans un incubateur standard de culture tissulaire. Décongeler les flacons de virus pour la transduction, ce qui permet environ 50 microlitres de virus concentrés pour la transduction de chaque puits dans des plaques de 48 puits.Dans un tube de 1,5 millilitre, mélanger le virus avec 12 microlitres d’une solution de nanoparticules magnétiques et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, ajouter la solution de nanoparticule magnétique et le mélange de virus aux cellules à transduire. Placez la plaque de 48 puits sur une plaque magnétique et incubez dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant au moins deux heures.Lorsque la transfection virale est terminée, transférez les grappes de cellules organoïdes infectées et le milieu de transduction de chaque puits dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à 500 fois g pendant cinq minutes. Jeter le supernatant avec aspiration douce, et refroidir les tubes contenant la pastille sur la glace pendant cinq minutes.Ajouter 120 microlitres de matrice membranaire du sous-sol à chaque tube, et résuspendre la pastille en pipetting lentement de haut en bas. Graines 30-microlitres gouttes du mélange matrice-cellule dans une nouvelle plaque de 48 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minutes jusqu’à ce que la matrice se solidifie.Ajouter le milieu de transduction à chaque puits et incuber dans un incubateur standard de culture tissulaire pendant trois à quatre jours. Après trois à quatre jours, inspecter les cultures au microscope léger à 10 x grossissement pour assurer l’organisation des grappes cellulaires en structures organoïdes. Remplacez doucement le milieu de transduction dans chaque puits par 250 microlitres de culture organoïde ENR medium.Remettre l’assiette à l’incubateur. Commencez cette procédure en enlevant le milieu ENR par aspiration douce, en prenant soin de ne pas perturber la matrice membranaire du sous-sol. Laver délicatement avec 500 microlitres de PBS.Fixez les organoïdes en ajoutant un microlitre de solution de paraformaldéhyde de 4 % par puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirer la solution de paraformaldéhyde par aspiration. Ajouter délicatement un microlitre de PBS par puits, puis retirer le PBS par aspiration douce.De cette façon, laver deux fois avec PBS. Retirez le PBS du deuxième lavage et ajoutez un microlitre de tampon de saccharose de 30 % à chaque échantillon. Incuber les organoïdes fixes dans le saccharose pendant une heure à quatre degrés Celsius pour déshydrater les échantillons.Retirez le tampon saccharose par aspiration, et ajoutez juste assez de composé d’intégration pour couvrir la couche matricielle dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que le composé d’intégration soit solide et blanc.Placez la plaque avec du composé d’intégration congelé à température ambiante pour permettre une fusion minimale du composé le long des bords. Utilisez un scalpel ou une spatule pour séparer le bloc des parois du puits. Travaillez rapidement pour éviter la fonte, en utilisant des forceps pour enlever la matrice intégrant le bloc composé, et placez-le dans un bloc de spécimens.Remplissez complètement le moule avec du composé d’intégration. Congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes avant d’utiliser le bloc pour la section. Ce protocole a été optimisé en transduisant d’abord des organoïdes intestinaux avec des vecteurs lentiviraux liés au GFP.Le GFP a été visualisé à chaque étape du développement organoïde, y compris très tôt lorsque les cellules de crypte s’organisent en structures cystiques ou à des moments ultérieurs où les organoïdes forment des bourgeons. Avec succès les organoïdes intestinaux transduced ont été alors formalin-fixés, cryosectioned, et analysés par la formation image d’immunofluorescence. Dans cette image, les noyaux sont tachés de bleu, et le vert indique des molécules épithéliales d’adhérence cellulaire, qui délimite les bordures cellulaires.Le rouge indique la coloration lysosome pour identifier les cellules de Paneth. Une fois maîtrisés, les organoïdes transducteurs peuvent être exécutés en environ trois heures, et l’intégration de crysection organoïdes peut être faite en environ 2 1/2 heures. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler de travailler sur la glace lors de la manipulation des reagents matricielles du sous-sol.Après avoir terminé cette procédure, une analyse immunofluorescente et d’autres méthodes de détection des protéines ou des organites peuvent être effectuées pour évaluer la localisation ou l’abondance relative. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer la biologie normale et les états de la maladie in vitro et aussi pour les études in vivo si les organoïdes ou les cellules transduced peuvent être implantés dans des souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des virus étiquetés magnétiquement aux organoïdes génétiquement modifiés pour la cryosection.S’il vous plaît n’oubliez pas que le travail avec des virus peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port d’équipement de protection approprié doit toujours être entrepris lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Recherche

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The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Tracing génétique clonale à l'aide de la souris confettis pour étudier les tissus minéralisés

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Récapituler la transition de lassuck au soudement in Vitro à l'aide d'organoïdes intestinaux fœtaux

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...