Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי לבריאות (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), מרילנד תא גזע מחקר קרן (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), האגודה האמריקנית לריאות, רשת הבריאות של אלגני-ג'ונס הופקינס קרן מחקר ומחלות העיכול הופקינס מחקר בסיסי ליבה המחקר מרכז.

פרוטוקול זה אושר על ידי המוסדות הרפואיים של ג'ונס הופקינס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC). פרוטוקול זה משתנה משיטות שפורסמו בעבר10,11,12,13.
1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>הכינו 293T מדיום טרי מספר שעות מראש וחמים 37 ° c באמב...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

התרבות העיקרית של אפיתל המעי הבוגר כמו אורגנואידים מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד מנגנונים מולקולריים מעורב בתפקוד תא גזע, הומאוסטזיס אפיתל המעי, ו פתולוגיה1,2,3, ד. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה יכולה לשמש מהנדס גנטית אורגנואיד?...

היכולת לעכבר התרבות או האדם קריפטים תאים כתלת מימדי (3D) אורגנואידים מן המעיים או המעי הגס על פני תקופות זמן ממושך סיפק פריצת דרך גדולה כי תרבויות אלה להציג תכונות הגדרת אפיתל המעי ב vivo מיכל בן , מיכל השני , 3. אורגנואידים נגזר הקריפטטים הראשוניים מסוגלים לחידוש עצמי וארגון עצמי, המציגות פונקציות סלולריות דומה לרקמות המקור שלהם. אכן, אורגנואידים לאחר מכן לא רק את הארגון המבני של קריפטים בvivo, אלא גם תכונות מולקולריות רבות, ובכך לספק כלים שימושיים כדי ללמוד ביולוגיה נורמלית מדינות המחלה. כדי להמחיש, מחקרים אורגנואיד חשפו מסלולים מולקולריים מעורבים התחדשות רקמות1,2,3,4,5 כמו גם תרופות שיכולות לשפר את הפונקציה בהגדרות הפתולוגיים6,7.
המחקר של תאי גזע מעיים הוא עניין מיוחד, כי רירית המעיים היא בין רקמות המרגליות הגבוהה ביותר, חידוש עצמו כל 3-5 ימים כדי להגן על האורגניזם מפני חיידקים, רעלים, ופתוגנים אחרים בתוך ה מעיים לומן. תאי גזע מעיים (iscs) אחראים ליכולת הרגנרציה המדהימה הזאת ובכך לספק פרדיגמה ייחודית ללימוד הפונקציה של תא גזע מבוגרים1,2. השושלת-מעקב ניסויים בעכברים הפגינו כי מבודדים Lgr5-חיוביים בתאי גזע יכול להיות מתורבת כדי ליצור אורגנואידים 3D או ' מיני מעיים ' בתוך מבחנה אשר הם מקרוב מראה שלהם ב vivo עמיתיהם. תרבויות אורגנואיד יכול גם להיות נגזר של תא מעיים קריפטה מבודד מורכב של ושלתי, ISCs, ו Paneth תאים, האחרון אשר מהווים את התאים נישה אפיתל ב vivo. למעשה, תרבות אורגאידית מתאי המעי הראשי בקריפטה התפתחה לתוך טכניקה שגרתית יחסית קל ליישם ברוב המעבדות באמצעות ריאגנטים זמין נרחב. מודל זה הוא גם מקלה לניתוח כמותי של ביטוי גנים על ידי rna-רצף (rna-Seq) וחלבונים על ידי ספקטרומטר המסה, אימונוהיסטוכימיה, או אימונולואוורסטילהכתמים2,4,8. בנוסף, גנטיקה פונקציונלית ניתן ללמוד באמצעות רווח (ביטוי או הבעה גנים של הפעלת גן מוטציה) או אובדן של פונקציה (גנים השתקה או ביטוי של מוטציה אובדן פונקציה) גישות2.
חשוב מכך, יעילות נמוכה ורעילות גבוהה של דנ א סטנדרטי או פרוטוקולים של התמרה ויראלית עם polybrene להישאר משוכה גדולה בתחום. למרות CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק, גישה זו דורשת בחירה גוזלת זמן ואחריו אימות רצף9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיפי התמרה עבור אורגנואידים המעי הראשי הממוטב מסירה של חלקיקים ויראלי על ידי הקונקטוחלקיקים מגנטיים ויישום של שדה מגנטי. שינויי מפתח לפרוטוקולים קודמים4,5,10, 11,12,13 והמלצות כדי לשפר את היעילות מסופקים. אנו מתארים גם גישה ליצור קטעים קפואים מן האורגנואידים שלמים תרבותי ב-3D מטריצות (המכונה מעתה מטריקס קרום המרתף מטריצה או מטריצה) לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

תרבויות מעיים מספק הזדמנות ייחודית לחקור את תא גזע המעיים וביולוגיה קריפטה בתחום החוץ, למרות שגישות יעילות לתמרן ביטוי גנים באורגנואידים עשו התקדמות מוגבלת בזירה זו. בעוד CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מאפשרת עריכת הגנום מדויק של תאים לדור אורגנואיד, אסטרטגיה זו דורשת בחירה נרחבת והקרנה על ידי ניתוח רצף, אשר הוא גם זמן רב ויקר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך התמרה ויראלית יעילה של אורגנואידים מעיים. גישה זו מהירה ויעילה מאוד, ובכך מפחית את הזמן ואת ההוצאות הטמונות בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. אנו מציגים גם פרוטוקול כדי ליצור קטעים קפואים מן התרבויות אורגנואיד שלמים לניתוח נוסף עם אימונוהיסטוכימיה או אימונוofluorggogtgggg, אשר יכול לשמש כדי לאשר ביטוי גנים או השתקה. לאחר התמרה מוצלחת של וקטורים ויראליות עבור ביטוי גנים או השתקה מושגת, תא גזע המעיים פונקציה קריפטה ניתן להעריך במהירות. למרות מחקרים אורגנואיד ביותר להעסיק בחוץ מבחנה, אורגנואידים יכול גם להיות מועברת עכברים עבור ניתוחים פונקציונליים vivo. יתר על כן, הגישות שלנו הם יתרון לניבוי תגובות טיפוליות לתרופות, כי כיום הטיפולים הזמינים בדרך כלל פונקציה על ידי ביטוי גנים מודולים או פונקציה חלבון ולא שינוי הגנום.

כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה מהירה ויעילה מאוד אשר מרתמות חלקיקים מגנטיים חשופים לשדה מגנטי כדי לספק הנגיף לתאי הריבית. עם כלים זמינים, יש לנו להחיל את הגישה הזאת לא רק כדי לשנות את התאים המבודדים מבודדים בלבד (איור 1A), אלא גם עבור אורגנואידים (א?...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

בגלל אורגנואידים recapitulate הארגון המבני המקומי, כמו גם תכונות מולקולריות רבות של אפיתל מעיים ב vivo, טכניקה זו מאפשרת לנו ללמוד ביולוגיה נורמלית מצבי מחלות במעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להנדס גנטית אורגנואידים באמצעות גישת טרנסדוקציה יעילה מאוד עם ציטוקסיקיות נמוכה, ובכך לאפשר מחקרים פונקציונליים של אורגנואידים אלה מניפולציה גנטית. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיפול למחלות מעיים כי אנחנו יכולים לחשוף אורגנואידים מעיים לתרופות וסוכנים אחרים או התערבויות.שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ופתולוגיים במערכות אחרות נוח לתרבויות אורגנואידיות, כגון רקמות השד או לתאים הגדלים בתנאים דו-מימדיים סטנדרטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יצליחו עם התברות באורגנואידים קשים להנדסה או בתאים אחרים. היה לנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר נתקלנו בקשיים מתמר האורגנואידים שלנו ותאי גזע.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו אובדן מבני של האורגנואידים יכול להתרחש אם דגימות אינם מטופלים כראוי במהלך תהליך ההטבעה לתוך מטריצת המרתף עבור cryosectioning. כדי לגדל אורגנואידים עבור התמרה ויראלית, תרבויות תאים אורגנואידים זרעים עם 200 מיקרוליטרים של מדיום שכפול ל הבאר בצלחת 48 באר, ודגירה באינקובטור תרבות רקמה סטנדרטית. להפשיר בקבוקונים של וירוס עבור התמרה, המאפשר כ 50 microliters של וירוס מרוכז לתרגום של כל באר צלחות 48 באר.בצינור של 1.5 מיליליטר, מערבבים את הנגיף עם 12 מיקרוליטרים של תותב ננו-חלקיקים מגנטי, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, מוסיפים את פתרון הננו-חלקיקים המגנטיים ואת תערובת הווירוסים לתאים כדי להתמר. מניחים את צלחת 48 באר על צלחת מגנטית, ודגירה באינקובטור תרבות רקמות סטנדרטי לפחות שעתיים.כאשר ההטרנספיה הנגיפית הושלמה, מעבירים את אשכולות התאים האורגנואידיים הנגועים ואת מדיום ההעתקה מכל באר לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי עם יניקה עדינה, וקררו את הצינורות המכילים את גלולת הקרח למשך חמש דקות.הוסף 120 microliters של מטריצת קרום מרתף לכל צינור, ו resuspend את גלולה על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה. זרעים 30 מיקרוליטר טיפות של תערובת תא מטריצה לתוך צלחת חדשה 48 היטב. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 15 דקות עד המטריצה מתגבשת.מוסיפים מדיום טרנסדוקציה לכל באר, וקטורת ב חממה סטנדרטית לתרבות רקמות למשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, לבדוק את התרבויות תחת מיקרוסקופ אור ב 10x הגדלה כדי להבטיח ארגון של אשכולות תאים לתוך מבנים אורגנואידים. החלף בעדינות את מדיום ההעתקה בכל באר ב-250 מיקרוליטרים של מדיום ENR של תרבות האורגנואידית.תחזיר את הצלחת לאנקובטור. התחל הליך זה על ידי הסרת מדיום ENR על ידי יניקה עדינה, נזהר לא לטרטר את מטריצת קרום המרתף. יש לשטוף בעדינות עם 500 מיקרוליטרים של PBS.תקן את האורגנואידים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 4% פתרון paraformaldehyde לגם, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, להסיר את פתרון paraformaldehyde על ידי יניקה. מוסיפים בעדינות מיקרוליטר אחד של PBS ל באר, ולאחר מכן להסיר את PBS על ידי יניקה עדינה.בדרך זו, לשטוף פעמיים עם PBS. הסר את ה- PBS מהכביסה השנייה והוסף מיקרוליטר אחד של מאגר סוכרוז של 30% לכל דגימה. דגירה אורגנואידים קבועים סוכרוז במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לייבש את הדגימות.הסר את מאגר סוכרוז על ידי יניקה, ולהוסיף רק מספיק תרכובת הטבעה כדי לכסות את שכבת מטריצה בכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או עד שתרכובת ההטבעה הופכת מוצקה ולבנים.מניחים את הצלחת עם תרכובת הטבעה קפואה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר התכה מינימלית של המתחם לאורך הקצוות. השתמש אזמל או מרית כדי להפריד את הבלוק מקירות הבאר. עבוד במהירות כדי למנוע התכה, באמצעות ממטרות כדי להסיר את המטריצה הטבעה בלוק מורכב, ולמקום אותו בבלוק דגימה.ממלאים את התבנית לחלוטין עם תרכובת הטבעה. להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש בבלוק לחיתוך. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה על ידי אורגנואידים מעיים מתמר הראשון עם וקטורים lentiviral מקושר GFP.ה- GFP הודמיין בכל שלב בהתפתחות האורגנואידית, כולל בשלב מוקדם כאשר תאי קריפטה מתארגנים במבנים דמויי ציסטה או בנקודות זמן מאוחרות יותר כאשר אורגנואידים יוצרים ניצנים. אורגנואידים מעיים שהתמר בהצלחה היו אז פורמלין קבוע, cryosectioned, ונותחו על ידי הדמיה immunofluorescence. בתמונה זו, הגרעינים מוכתמים בכחול, והירוק מציין מולקולות הידבקות בתא האפיתל, אשר מתמתן גבולות התא.האדום מציין כתמי ליסום לזיהוי תאי Paneth. לאחר השליטה, אורגנואידים מתמר יכול להתבצע בערך שלוש שעות, אורגנואידים crysection הטבעה יכול להיעשות בערך 2 1/2 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד על קרח בעת טיפול רייגנטים מטריצת מרתף.לאחר השלמת הליך זה, ניתוח immunofluorescent ושיטות אחרות כדי לזהות חלבונים או organelles יכול להתבצע כדי להעריך לוקליזציה או שפע יחסי. טכניקה זו סוללת את הדרכים עבור חוקרים לחקור ביולוגיה נורמלית מצבי מחלות במבחנה וגם עבור מחקרים vivo אם אורגנואידים מתומרים או תאים ניתן להשתיל לתוך עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש וירוסים המסומנים מגנטית כדי להנדס גנטית אורגנואידים עבור cryosectioning.אנא אל תשכח כי עבודה עם וירוסים יכול להיות מסוכן מאוד, ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן מתאים תמיד צריך להתבצע בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

באמצעות אורגנואידים של המעי העוברי

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...