Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), मैरीलैंड स्टेम सेल रिसर्च फंड (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), अमेरिकन लुंग एसोसिएशन, Allegheny स्वास्थ्य नेटवर्क से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था हॉपकिंस रिसर्च फंड और हॉपकिंस पाचन रोग बुनियादी अनुसंधान कोर केंद्र.

इस प्रोटोकॉल जॉन्स हॉपकिंस चिकित्सा संस्थानों पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था. इस प्रोटोकॉल को पहले प्रकाशित विधियों10,11,12,13से ?...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

वयस्क आंतों उपकला की प्राथमिक संस्कृति organoids के रूप में स्टेम सेल समारोह में शामिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है , आंतों उपकला homeostasis , और विकृति1,2...

लंबे समय तक समय अवधि में छोटी आंतों या बृहदान्त्र से तीन आयामी (3 डी) organoids के रूप में माउस या मानव crypts कोशिकाओं संस्कृति की क्षमता एक बड़ी सफलता प्रदान की है क्योंकि इन संस्कृतियों विवो में आंतों उपकला की सुविधाओं को परिभाषित प्रदर्शन 1 , २ , 3. प्राथमिक crypts से व्युत्पन्न organoids स्वयं नवीकरण और आत्म संगठन के लिए सक्षम हैं, मूल के अपने ऊतकों के समान सेलुलर कार्यों का प्रदर्शन. वास्तव में, organoids न केवल विवो में crypts के संरचनात्मक संगठन recapitulate, लेकिन यह भी कई आणविक सुविधाओं, इस प्रकार सामान्य जीव विज्ञान और रोग राज्यों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान. उदाहरण के लिए, ऑर्गनॉइड अध्ययनों से पता चला है कि ऊतक पुनर्जनन1,2,3,4,5 के साथ-साथ ऐसी दवाएं जो कार्य को बढ़ा सकती हैं, में शामिल उपन्यास आण्विक मार्ग पैथोलॉजिकल सेटिंग्समें 6,7.
आंतों स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन विशेष रुचि का है क्योंकि आंतों की परत सबसे अधिक पुनर्योजी स्तनधारी ऊतकों में से एक है, खुद को हर 3-5 दिनों के नवीकरण बैक्टीरिया से जीव की रक्षा के लिए, विषाक्त पदार्थों, और अन्य रोगजनकों के भीतर आंत्र लुमेन्स. आंत्र स्टेम सेल (ISCs) इस उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता के लिए जिम्मेदार हैं और इस प्रकार वयस्क स्टेम सेल समारोह1,2के अध्ययन के लिए एक अद्वितीय प्रतिमान प्रदान करते हैं. चूहों में वंश-ट्रैकिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि अलग Lgr5 सकारात्मक स्टेम कोशिकाओं को 3 डी organoids या 'मिनी गट' इन विट्रो में उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, जहां वे बारीकी से अपने vivo समकक्षों में दर्पण. Organoid संस्कृतियों भी आंतों crypt सेल अलग से प्राप्त किया जा सकता है संतति के शामिल, ISCs, और Paneth कोशिकाओं, जिनमें से बाद विवो में उपकला आला कोशिकाओं का गठन. वास्तव में, प्राथमिक आंतों crypt कोशिकाओं से organoid संस्कृति एक अपेक्षाकृत नियमित तकनीक है कि व्यापक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग कर सबसे प्रयोगशालाओं में लागू करने के लिए आसान है में विकसित किया गया है. यह मॉडल आरएनए-सेक्सिंग (आरएनए-सेक) और प्रोटीन द्वारा द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या इम्यूनोफ्लोरेसेंटधुंधला 2,4,8द्वारा जीन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए भी अनुकूल है। इसके अलावा, कार्यात्मक आनुवंशिकी लाभ के समारोह का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (जीन overexpression या एक सक्रिय उत्परिवर्ती जीन की अभिव्यक्ति) या हानि के समारोह (जीन silencing या एक हानि के समारोह उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति) दृष्टिकोण2.
महत्वपूर्ण बात, कम दक्षता और मानक प्लाज्मिड डीएनए या polybrene के साथ वायरल transduction प्रोटोकॉल के उच्च विषाक्तता क्षेत्र में एक बड़ी बाधा बनी हुई है. हालांकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देता है, इस दृष्टिकोण समय लेने वाली चयन अनुक्रम सत्यापन9के बाद की आवश्यकता है. यहाँ, हम प्राथमिक आंतों organoids कि चुंबकीय नैनोकणों और एक चुंबकीय क्षेत्र के आवेदन करने के लिए संयोजन द्वारा वायरल कणों के वितरण का अनुकूलन के लिए एक वायरल transduction प्रोटोकॉल पेश करते हैं। पूर्व प्रोटोकॉल4,5,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण संशोधन और दक्षता बढ़ाने के लिए सिफारिशें प्रदान की जाती हैं . हम भी 3 डी matricgel में सुसंस्कृत बरकरार organoids से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन (इसलिए आगे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के साथ आगे विश्लेषण के लिए.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

आंत्र organoid संस्कृतियों आंतों स्टेम सेल और इन विट्रो में crypt जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं, हालांकि organoids में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए कुशल दृष्टिकोण इस क्षेत्र में सीमित प्रगति की है. जबकि CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी organoid पीढ़ी के लिए कोशिकाओं के सटीक जीनोम संपादन के लिए अनुमति देता है, इस रणनीति अनुक्रम विश्लेषण है, जो दोनों समय लेने वाली और महंगा है द्वारा व्यापक चयन और स्क्रीनिंग की आवश्यकता है. यहाँ, हम आंतों organoids के कुशल वायरल transduction के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण तीव्र और अत्यधिक कुशल है, इस प्रकार CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी में निहित समय और व्यय को कम करना। हम भी इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला, जो जीन अभिव्यक्ति या silencing की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ आगे विश्लेषण के लिए बरकरार organoid संस्कृतियों से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। जीन अभिव्यक्ति या silencing के लिए वायरल वैक्टर के सफल transduction के बाद हासिल की है, आंतों स्टेम सेल और crypt समारोह तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है. हालांकि अधिकांश organoid अध्ययन विट्रो परख में रोजगार, organoids भी विवो कार्यात्मक विश्लेषण में के लिए चूहों को दिया जा सकता है. इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण दवाओं के लिए चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए फायदेमंद हैं क्योंकि वर्तमान में उपलब्ध उपचार आम तौर पर जीनोम बदलने के बजाय जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन समारोह नियमन द्वारा कार्य करते हैं.

यहाँ, हम एक तेजी से और अत्यधिक कुशल transduction तकनीक है जो एक चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में चुंबकीय नैनोकणों ब्याज की कोशिकाओं को lentivirus देने के लिए harnesses का वर्णन. आसानी से उपलब्ध उपकरणों के साथ, हमने ?...

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

जमे हुए अनुभाग के लिए चुंबकीय नैनोकण ट्रांसडक्शन वायरल वेक्टर्स का उपयोग प्राथमिक माउस आंत्र organoids की जेनेटिक इंजीनियरिंग

हम करने के लिए कदम दर कदम निर्देश का वर्णन: 1) कुशलता से lenti- या retroviral transduction के लिए चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कर आंतों organoids इंजीनियर, और, 2) इंजीनियर organoids से जमे हुए वर्गों उत्पन्न करते हैं. यह दृष्टिकोण बहाव प्रभाव की जांच के लिए organoids में जीन अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक बदलने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

क्योंकि ऑर्गेनॉइड देशी संरचनात्मक संगठन के साथ-साथ वीवो में आंतों के एपिथेलियम की कई आणविक विशेषताओं को फिर से दोहराते हैं, यह तकनीक हमें प्रयोगशाला में सामान्य जीव विज्ञान और रोग राज्यों का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ कम साइटोटॉक्सीसिटी के साथ एक बहुत ही अत्यधिक कुशल ट्रांसडक्शन दृष्टिकोण का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ऑर्गेनॉइड की क्षमता है, इस प्रकार इन आनुवंशिक रूप से हेरफेर वाले ऑर्गेनॉइड के कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति मिलती है। इस तकनीक के निहितार्थ आंतों की बीमारी के लिए चिकित्सा की ओर विस्तार करते हैं क्योंकि हम आंतों के ऑर्गेनॉइड को दवाओं और अन्य एजेंटों या हस्तक्षेपों के लिए बेनकाब कर सकते हैं।इस विधि को ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए उत्तरदायी अन्य प्रणालियों में विकासात्मक और रोगजनक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे स्तन ऊतक या मानक 2डी स्थितियों के तहत बढ़ने वाली कोशिकाओं के लिए। आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति मुश्किल से इंजीनियर ऑर्गेनॉइड या अन्य कोशिकाओं में लेनदेन के साथ सफल होंगे। हम पहली बार इस विधि के लिए विचार किया था जब हम कठिनाइयों का सामना करना पड़ा हमारे ऑर्गेनॉइड और स्टेम सेल ट्रांसड्यूस ।इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑर्गेनॉइड का संरचनात्मक नुकसान हो सकता है यदि नमूनों को क्रायोसेक्शनिंग के लिए बेसमेंट मैट्रिक्स में एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान ठीक से इलाज नहीं किया जाता है। वायरल ट्रांसडक्शन के लिए ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए, बीज ऑर्गेनॉइड सेल संस्कृतियों के साथ 48-अच्छी प्लेट में प्रति अच्छी तरह से ट्रांसडक्शन माध्यम के 200 माइक्रोलीटर के साथ, और एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट। ट्रांसडक्शन के लिए वायरस की गल शीशियां, 48-अच्छी प्लेटों में प्रत्येक कुएं के लेनदेन के लिए केंद्रित वायरस के लगभग 50 माइक्रोलीटर की अनुमति देती हैं।एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, वायरस को चुंबकीय नैनोपार्टिकल समाधान के 12 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 15 मिनट के बाद, कोशिकाओं को पार करने के लिए चुंबकीय नैनोपार्टिकल समाधान और वायरस मिश्रण जोड़ें। एक चुंबकीय प्लेट पर 48-अच्छी प्लेट रखें, और कम से कम दो घंटे के लिए एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।जब वायरल ट्रांसफेक्शन पूरा हो जाता है, तो संक्रमित ऑर्गेनॉइड सेल क्लस्टर और ट्रांसडक्शन माध्यम को प्रत्येक कुएं से 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए 500 बार जी पर सेंट्रलाइज। कोमल सक्शन के साथ सुपरनेट को त्यागें, और पांच मिनट के लिए बर्फ पर गोली युक्त ट्यूबों को ठंडा करें।प्रत्येक ट्यूब में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 120 माइक्रोलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके गोली को फिर से खर्च करें। बीज 30-मैट्रिक्स सेल मिश्रण के माइक्रोलीटर एक नई ४८-अच्छी तरह से थाली में बूंदें । थाली को पांच से 15 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि मैट्रिक्स जम न जा सके।प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रांसडक्शन माध्यम जोड़ें, और तीन से चार दिनों के लिए एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। तीन से चार दिनों के बाद, ऑर्गेनॉइड संरचनाओं में सेल समूहों के संगठन को सुनिश्चित करने के लिए 10x आवर्धन पर एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें। धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में ट्रांसडक्शन माध्यम को ऑर्गेनॉइड संस्कृति एनआर माध्यम के 250 माइक्रोलीटर के साथ बदलें।थाली को इनक्यूबेटर में लौटाएं। कोमल सक्शन द्वारा एनआर माध्यम को हटाकर इस प्रक्रिया को शुरू करें, सावधान रहें कि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को परेशान न करें। पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर से धीरे-धीरे धोएं।ऑर्गेनॉइड को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के एक माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से जोड़कर ठीक करें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 30 मिनट के बाद, सक्शन द्वारा पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान निकालें। धीरे-धीरे प्रति अच्छी तरह पीबीएस का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और फिर कोमल सक्शन द्वारा पीबीएस को हटा दें।इस तरीके से, पीबीएस के साथ दो बार धोएं। दूसरे वॉश से पीबीएस निकालें, और प्रत्येक नमूने में 30% सुक्रोज बफर का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। नमूनों को निर्जलित करने के लिए एक घंटे के लिए सुक्रोज में फिक्स्ड ऑर्गेनॉइड को चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।सक्शन द्वारा सुक्रोज बफर को हटा दें, और प्रत्येक अच्छी तरह से मैट्रिक्स परत को कवर करने के लिए बस पर्याप्त एम्बेडिंग यौगिक जोड़ें। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। इसके बाद, नमूनों को 10 मिनट के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें या जब तक एम्बेडिंग यौगिक ठोस और सफेद नहीं हो जाता।किनारों के साथ यौगिक के न्यूनतम पिघलने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर जमे हुए एम्बेडिंग यौगिक के साथ प्लेट रखें। कुएं की दीवारों से ब्लॉक को अलग करने के लिए स्केलपेल या स्पैटुला का उपयोग करें। पिघलने को रोकने के लिए जल्दी से काम करें, मैट्रिक्स एम्बेडिंग कंपाउंड ब्लॉक को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और इसे एक नमूना ब्लॉक में रखें।मोल्ड को पूरी तरह से एम्बेडिंग कंपाउंड से भरें। खंड के लिए ब्लॉक का उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें । इस प्रोटोकॉल को जीएफपी से जुड़े लेंटीवायरल वैक्टर के साथ पहले ट्रांसड्यूसिंग आंतों के ऑर्गेनॉइड द्वारा अनुकूलित किया गया था।ऑर्गेनॉइड विकास में प्रत्येक चरण में जीएफपी की कल्पना की गई थी, जिसमें क्रिप्टो कोशिकाएं पुटी जैसी संरचनाओं में या बाद के समय के बिंदुओं पर व्यवस्थित होती हैं जब ऑर्गेनॉइड कलियों का निर्माण करते हैं। सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूडेड आंतों के ऑर्गेनॉइड को औपचारिक रूप से तय किया गया, क्रायोसेक्शन किया गया, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया गया। इस छवि में, नाभिक नीले रंग में दाग रहे हैं, और हरे रंग एपिथेलियल सेल आसंजन अणुओं, जो सेल सीमाओं सीमांकन इंगित करता है ।लाल पैनेथ कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लाइसोसोम धुंधला इंगित करता है। एक बार महारत हासिल होने के बाद, ट्रांसड्यूसिंग ऑर्गेनॉइड लगभग तीन घंटे में किया जा सकता है, और ऑर्गेनॉइड क्राइसेक्शन एम्बेडेड लगभग 2 1/2 घंटे में किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, बेसमेंट मैट्रिक्स रिएजेंट्स को संभालते समय बर्फ पर काम करना याद रखना महत्वपूर्ण है।इस प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, स्थानीयकरण या सापेक्ष बहुतायत का आकलन करने के लिए प्रोटीन या ऑर्गेनेल्स का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट विश्लेषण और अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है। यह तकनीक शोधकर्ताओं के लिए सामान्य जीव विज्ञान और रोग राज्यों को विट्रो में तलाशने के तरीके प्रशस्त करती है और वीवो अध्ययनों में भी अगर ट्रांसड्यूडेड ऑर्गेनॉइड या कोशिकाओं को चूहों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है । इस वीडियो को देखने के बाद, आपको इस बात की अच्छी समझ होनी चाहिए कि क्रायोसेक्शनिंग के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ऑर्गेनॉइड के लिए चुंबकीय रूप से लेबल वाले वायरस का उपयोग कैसे किया जाए।कृपया यह न भूलें कि वायरस के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय उचित सुरक्षात्मक गियर पहनने जैसी सावधानियां हमेशा शुरू की जानी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

गैर समेकित करने Episomal प्लास्मिड का उपयोग करते हुए जमे हुए बफी कोट से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

माउस कान और पूंछ के ऊतकों से उत्पन्न प्राथमिक तंतुकोशिका संस्कृति

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Cardiomyocyte डीएनए संश्लेषण और Ploidy का एक साथ आकलन: एक तरीका है cardiomyocyte उत्थान और कारोबार की मात्रा असिस्ट करने के लिए

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

अध्ययन के लिए प्राथमिक सिलिया प्राथमिक neurosphere संस्कृति का उपयोग करना

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

bliss-फ्लोरोसेंट लेबलिंग के Microtubules और Centrosomal प्रोटीन में पूर्व Vivo आंत्र ऊतक और 3 डी इन विट्रो आंत्र Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

मानव आंत्र Organoids में उपकला बाधा पारगम्यता के वास्तविक समय माप

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

माउस बहिर्यकृत पित्त नलिकाओं से ऑर्गेनॉइड का उत्पादन

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

बहुकोशिकीय मानव प्राथमिक एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड्स का उत्पादन

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

खनिजीकृत ऊतकों का अध्ययन करने के लिए Confetti माउस का उपयोग कर क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

भ्रूण आंतों ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो में दूध पिलाने-से-प्रातः संक्रमण को संक्षिप्त करना

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...