Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所(R01DK102943、R03CA182679、R03CA191621)、メリーランド幹細胞研究基金(2015-MSCRFE-1759、2017-MSCRFD-3934)、米国肺協会、アレニー・ネットワーク・ジョンからの助成金によって支援されました。ホプキンス研究基金とホプキンス消化器病基礎研究センター

このプロトコルは、ジョンズ・ホプキンス医療機関動物ケア・使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルは、以前に公開された方法10、11、12、13から変更されます。
1. 試薬の調製
<ol><li>新鮮な293T培地を数時間前に準備し、水浴中37°Cまで少なくとも10分間温?...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

オルガノイドとしての成人腸上皮の一次培養は、幹細胞機能、腸上皮恒常性、病理1、2、3、病理学に関与する分子機構を研究するための強力なツールを提供する。 4.CRISPR/Cas9技術は、遺伝子操作可能なオルガノイド9に使用できますが、所望の遺伝的変化に対する配列解析に基づ?...

マウスまたはヒトの暗号を小腸または結腸から長期間にわたって3次元(3D)オルガノイドとして培養する能力は、これらの培養物が生体内の腸上皮の特徴を定義するので、大きなブレークスルーを提供した1,2,3.原発性暗号に由来するオルガノイドは、自己更新および自己組織化が可能であり、起源の組織と同様の細胞機能を示す。実際、オルガノイドは、生体内のクリプトの構造組織だけでなく、多くの分子特徴を要約し、正常な生物学や疾患状態を研究するのに有用なツールを提供します。例示するために、オルガノイド研究は、組織再生1、2、3、4、5だけでなく、機能を増強することができる薬物に関与する新しい分子経路を明らかにした病理学的設定6、7で。
腸幹細胞の研究は、腸内層が最も再生性の高い哺乳類組織の一つであるため、特に興味深いものであり、細菌、毒素、およびその他の病原体から生物を保護するために3〜5日ごとに更新する腸の内気。腸幹細胞(ISC)は、この顕著な再生能力を担い、成人幹細胞機能1、2を研究するためのユニークなパラダイムを提供します。マウスの系統トレース実験は、単離されたLgr5陽性幹細胞を培養して、3Dオルガノイドまたは「ミニ腸」をインビトロで生成し、インビボに近い形でそれらが密接にミラーリングできることを実証した。オルガノイド培養はまた、前駆体、ISC、およびパネス細胞からなる腸暗号細胞単離物から導き出され、後者は生体内の上皮ニッチ細胞を構成する。実際、原発性腸暗号細胞からのオルガノイド培養は、広く利用可能な試薬を使用してほとんどの実験室で実装しやすい比較的日常的な技術に進化しています。このモデルはまた、質量分析、免疫組織化学、または免疫蛍光染色2、4、8によるRNAシーケンシング(RNA-Seq)およびタンパク質による遺伝子発現の定量分析にも適している。さらに、機能遺伝学は、機能ゲイン(活性化変異遺伝子の遺伝子過剰発現または発現)または機能喪失(遺伝子サイレンシングまたは機能喪失変異体の発現)アプローチ2を用いて研究することができる。
重要なことに、ポリブレンを用いた標準的なプラスミドDNAまたはウイルス伝達プロトコルの低効率および高毒性は、この分野における大きなハードルのままである。CRISPR/Cas9技術は正確なゲノム編集を可能にしますが、このアプローチでは、シーケンス検証9に続いて時間のかかる選択が必要です。ここでは、磁気ナノ粒子への結合と磁場の応用によりウイルス粒子の送達を最適化する一次腸内オルガノイドのウイルス伝達プロトコルを提示する。以前のプロトコル4、5、10、11、12、13および効率を高めるための推奨事項に対する主要な変更が提供される。また、免疫組織化学または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、3Dマトリゲル(以下、地下膜マトリックスまたはマトリックスと呼ばれる)で培養された無傷のオルガノイドから凍結切片を生成するアプローチについても説明する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

腸内オルガノイド培養は、インビトロで腸幹細胞と暗号生物学を調べるユニークな機会を提供しますが、オルガノイドの遺伝子発現を操作する効率的なアプローチは、この分野で限られた進歩を遂げています。CRISPR/Cas9技術は、オルガノイド生成のための細胞の正確なゲノム編集を可能にしますが、この戦略は、時間とコストの両方である配列分析による広範な選択とスクリーニングを必要とします。ここでは、腸内オルガノイドの効率的なウイルス伝達のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは迅速かつ高効率であるため、CRISPR/Cas9テクノロジーに固有の時間と費用を削減できます。また、遺伝子発現やサイレンシングを確認するために使用できる免疫組織化学的または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、無傷のオルガノイド培養物から凍結切片を生成するプロトコルを提示する。遺伝子発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターの正常な伝達が達成された後、腸幹細胞および暗号機能を迅速に評価することができる。ほとんどのオルガノイド研究はインビトロアッセイを採用していますが、オルガノイドは生体内機能解析のためにマウスに送達することもできます。また、現在利用可能な治療法は、ゲノムを変えるのではなく遺伝子発現やタンパク質機能を調節することによって一般的に機能するため、薬剤に対する治療応答を予測する上で有利です。

ここでは、磁場にさらされた磁性ナノ粒子を利用して、目的の細胞にレンチウイルスを届ける、迅速かつ効率的なトランスダクション技術について述べる。容易に入手可能なツールを用いて、新たに単離されたクリプト細胞(図1A)をトランスデュースするだけでなく、オルガノイド(図2)やより日常的なトランスダクションア...

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

我々は、1)レンチまたはレトロウイルス伝達のための磁気ナノ粒子を使用して腸内オルガノイドを効率的に設計し、2)工学的オルガノイドから凍結切片を生成するステップバイステップの指示を説明する。このアプローチは、下流の効果を調査するためにオルガノイドの遺伝子発現を効率的に変更するための強力なツールを提供します。

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

オルガノイドは、生体内の腸上皮の多くの分子的特徴だけでなく、ネイティブの構造組織を再現するので、この技術は、実験室での正常な生物学や病気の状態を研究することができます。この技術の主な利点は、細胞毒性の低い非常に高効率な伝達アプローチを使用してオルガノイドを遺伝子操作する能力であり、したがって、これらの遺伝子操作されたオルガノイドの機能研究を可能にする。この技術の意味は、腸のオルガノイドを薬物やその他の薬剤や介入にさらす可能性があるため、腸疾患の治療にまで及んでいます。この方法は、乳房組織などのオルガノイド培養や標準的な2D条件下で増殖する細胞に適した他のシステムにおける発達および病理学的プロセスの研究に適用することができる。一般的に、この方法に新しい個人は、操作が困難なオルガノイドまたは他の細胞での伝達で成功します。オルガノイドや幹細胞を形容する困難に遭遇したとき、私たちは最初にこの方法のアイデアを持っていました。この方法の視覚的なデモンストレーションは、サンプルが凍結切断のために地下マトリックスに埋め込むプロセス中に適切に処理されない場合に発生する可能性があり、オルガノイドの構造的損失が起こり得るので重要である。ウイルス伝達のためのオルガノイドを成長させるために、48ウェルプレートで1ウェルあたり200マイクロリットルのトランスダクション培地を含む種子オルガノイド細胞培養物を、標準組織培養インキュベーターでインキュベートする。ウイルスのバイアルをトランスダクション用に解凍し、48ウェルプレート内の各ウェルの導入に約50マイクロリットルの濃縮ウイルスを可能にする。1.5ミリリットルのチューブで、磁気ナノ粒子溶液の12マイクロリットルとウイルスを混合し、室温で15分間インキュベートします。15分後、磁性ナノ粒子溶液とウイルス混合物を細胞に加えて、細胞を導入する。48ウェルプレートを磁気プレートの上に置き、少なくとも2時間は標準的な組織培養インキュベーターでインキュベートする。ウイルストランスフェクションが完了したら、感染したオルガノイド細胞クラスターとトランスダクション培地を各ウェルから1.5ミリリットルチューブに移します。5分間500回gで遠心分離機。優しい吸引で上清を捨て、氷の上にペレットを含むチューブを5分間冷却します。各チューブに120マイクロリットルの基底膜マトリックスを加え、ゆっくりと上下にピペット処理してペレットを再懸濁します。マトリックス-セル混合物の30-マイクロリットルのシード滴を新しい48ウェルプレートに入れます。マトリックスが固まるまで、プレートを摂氏37度で5~15分間インキュベートします。各ウェルに伝達媒体を加え、標準組織培養インキュベーターで3〜4日間インキュベートする。3~4日後、10倍の倍率で光顕微鏡で培養を検査し、細胞クラスターをオルガノイド構造に組織化します。各ウェルのトランスダクション媒体を250マイクロリットルのオルガノイド培養ENR培地にそっと交換してください。プレートをインキュベーターに戻します。この手順は、ENR培地を穏やかな吸引により除去し、基体膜マトリックスを摂動しないように注意して行います。PBSを500マイクロリットルで軽く洗います。オルガノイドを1ウェルあたり4%パラホルムアルデヒド溶液の1マイクロリットルを加えて固定し、室温で30分間インキュベートします。30分後、パラホルムアルデヒド溶液を吸引して取り除きます。PBSを井戸あたり1マイクロリットル軽く加え、穏やかな吸引でPBSを取り除きます。このようにして、PBSで2回洗浄する。2回目の洗浄からPBSを取り出し、各サンプルに30%スクロースバッファーの1マイクロリットルを加えます。サンプルを脱水するために摂氏4度で1時間、スクロース中の固定オルガノイドをインキュベートします。スクロースバッファーを吸引して取り外し、各ウェル内のマトリックス層を覆うのに十分な埋め込み化合物を追加します。室温で5分間インキュベートします。次に、サンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に10分間、または埋め込み化合物が固体と白になるまで置きます。室温で凍結埋め込み化合物とプレートを置き、エッジに沿って化合物を最小限に溶かすことができます。メスやへらを使用して、井戸の壁からブロックを分離します。溶融を防ぐために迅速に作業し、鉗子を使用してマトリックス埋め込み化合物ブロックを除去し、それを標本ブロックに入れます。埋め込み化合物で完全に金型を充填します。断面にブロックを使用する前に、マイナス80°Cで30分間凍結します。このプロトコルは、GFPにリンクされたレンチウイルスベクターを用いた腸オルガノイドを最初に導入することによって最適化された。GFPは、嚢胞様構造に組織化する初期の段階や、オルガノイドが芽を形成する後の時点を含め、オルガノイド発症の各段階で視覚化された。正常に整流した腸器官は、ホルマリン固定、凍結切除、免疫蛍光イメージングによって分析された。この画像では、核は青色で染色され、緑色は上皮細胞接着分子を示し、細胞の境界を区切ります。赤は、パネス細胞を識別するためのリソソーム染色を示しています。いったんマスター化すると、オルガノイドのトランスデューシングは約3時間で行い、オルガノイドのクリセクション埋め込みは約2時間半で行うことができます。この手順を試みる際には、地下マトリックス試薬を扱う際に氷上で作業することを忘れないでください。この手順を完了した後、免疫蛍光分析およびタンパク質またはオルガネラを検出する他の方法を行い、局在または相対的な存在量を評価することができる。この技術は、研究者が正常な生物学や病気の状態を調べる方法を開き、トランスデューセドされたオルガノイドまたは細胞をマウスに移植できる場合はインビボ研究にも利用できます。このビデオを見た後、あなたは、凍結切断のためのオルガノイドを遺伝子操作するために磁気標識ウイルスを使用する方法をよく理解している必要があります。ウイルスの操作は非常に危険であり、適切な保護具を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

マウスの耳としっぽの組織から生成初代線維芽細胞培養

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...