Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), 미국 폐 협회, 알레게니 건강 네트워크의 보조금에 의해 지원되었다 홉킨스 연구 기금과 홉킨스 소화기 질환 기초 연구 핵심 센터.

이 프로토콜은 존스 홉킨스 의료 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 방법10,11,12,13에서수정됩니다.
1. 시약의 준비
<ol><li>신선한 293T 배지를 몇 시간 전에 준비하고 사용 하기 전에 적어도 10 분동안 수조에서 37 °C로...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

오르가노이드로서 성인 장 상피의 1차 배양은 줄기세포 기능, 장상피 항상성 및 병리학 1,2,3에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 4. CRISPR/Cas9 기술은 오가노이드9를유전자 조작하는 데 사용될 수 있지만 원하는 유전 적 변화에 대한 서열 분석에 기초한 ?...

장기간에 걸쳐 소장이나 결장에서 3차원 (3D) 오르가노이드로 마우스 또는 인간 토굴 세포를 배양하는 능력은 이러한 문화가 생체 내에서 장 상피의 특징을 정의하기 때문에 중요한 돌파구를 제공했습니다. 1개 , 2개 , 3. 기본 토굴에서 파생 된 오르가노이드는 자기 갱신 및 자기 조직능력이 뛰어나며, 기원조직과 유사한 세포 기능을 나타낸다. 실제로, 오르가노이드는 생체 내 토굴의 구조적 조직뿐만 아니라 많은 분자 특징을 재구성하여 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 설명하기 위하여, organoid 연구 결과는 조직 재생에관련시킨 새로운 분자 통로를 밝혔습니다 1, 2,3,4,5 뿐만 아니라 기능을 강화할 수 있는 약 병리학 설정6,7.
장 내 벽 줄기 세포의 연구는 장 내 의 박테리아, 독소 및 기타 병원체로부터 유기체를 보호하기 위해 3-5 일마다 자신을 갱신하는 가장 높은 재생 포유류 조직 중 하나이기 때문에 특히 관심이 있습니다. 장 루멘. 장 줄기 세포 (ISCs)는이 놀라운 재생 능력에 대한 책임이 있으며, 따라서 성인 줄기 세포기능을 공부하기위한 독특한 패러다임을 제공 1,2. 마우스의 계보 추적 실험은 분리된 Lgr5 양성 줄기 세포가 생체 내 대조물과 밀접하게 미러링되는 체외에서 3D 오르가노이드 또는 '미니 장'을 생성하기 위해 배양될 수 있음을 입증했습니다. 오르가노이드 배양은 또한 전구, ISCs 및 판세포로 구성된 장내 토굴 세포 분리체로부터 유래될 수 있으며, 그 중 후자는 생체 내 상피 틈새 세포를 구성한다. 사실, 1 차 적인 창 자 crypt 세포에서 organoid 문화는 널리 이용 가능한 시약을 사용 하 여 대부분의 실험실에서 구현 하기 쉬운 상대적으로 일상적인 기술로 진화 했다. 이 모델은 또한 질량 분석, 면역성 화학, 또는 면역 형광 염색 2,4,8에의한 RNA-Seq(RNA-Seq) 및 단백질에 의한 유전자 발현의 정량적 분석을 수행할 수 있다. 또한, 기능성 유전학은 기능의 이득(유전자 과발현 또는 활성화 돌연변이 유전자의 발현) 또는 기능 상실(유전자 침묵 또는 기능 상실 돌연변이의 발현)을사용하여 연구될 수 있다 2.
중요한 것은, 폴리브레인을 가진 표준 플라스미드 DNA 또는 바이러스성 감전 프로토콜의 낮은 효율 및 높은 독성은 필드에 있는 중요한 장애물 남아 있습니다. CRISPR/Cas9 기술은 정확한 게놈 편집을 허용하지만, 이 접근법은 시퀀스 유효성 검사9뒤에 시간이 많이 걸리는 선택이 필요합니다. 여기에서, 우리는 자기 나노 입자에 공고하고 자기장의 응용에 의해 바이러스 입자의 전달을 최적화하는 1 차장 오르가노이드를 위한 바이러스성 전달 프로토콜을 제시합니다. 이전 프로토콜 4,5,10,11,12,13 및 효율성을 향상시키기 위한 권장 사항에 대한 주요 수정사항이 제공됩니다. 우리는 또한 면역 조직 화학 또는 면역 형광 염색을 가진 추가 분석을 위해 3D matrigel (이제부터 지하 막 매트릭스 또는 매트릭스로 지칭)에서 배양된 손상되지 않은 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성하는 접근 법을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

장 내 오르가노이드 배양은 시험관내에서 장 줄기 세포를 조사하고 생물학을 토굴할 수 있는 독특한 기회를 제공하지만, 오르가노이드의 유전자 발현을 조작하는 효율적인 접근법은 이 분야에서 제한된 진전을 이루었습니다. CRISPR/Cas9 기술은 오르가노이드 생성을 위한 세포의 정확한 게놈 편집을 허용하는 동안, 이 전략은 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 서열 분석에 의하여 광범위한 선택 및 검열을 요구합니다. 여기에서, 우리는 장 오르가노이드의 능률적인 바이러스성 전송을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 접근 방식은 빠르고 매우 효율적이므로 CRISPR/Cas9 기술에 내재된 시간과 비용을 줄입니다. 우리는 또한 유전자 발현 또는 침묵을 확인하기 위하여 이용될 수 있는 면역 조직화학또는 면역형광 염색을 가진 추가 분석을 위한 본래 오르가노이드 문화에서 동결된 단면도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자 발현 또는 침묵에 대한 바이러스 벡터의 성공적인 환전이 달성된 후, 장 줄기 세포 및 토굴 기능을 빠르게 평가할 수 있다. 대부분의 오르가노이드 연구는 시험관 내 분석을 사용하지만, 오르가노이드는 생체 내 기능 분석을 위해 마우스에 전달될 수 있습니다. 더욱이, 우리의 접근은 현재 유효한 치료가 일반적으로 게놈을 바꾸기 보다는 오히려 유전자 발현 또는 단백질 기능을 변조해서 작동하기 때문에 약에 치료 반응을 예측하기 위한 유리합니다.

여기에서는 자기장에 노출된 자기 나노 입자를 활용하여 관심 있는 세포에 렌티바이러스를 전달하는 신속하고 고효율의 트랜스덕션 기술을 설명합니다. 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 갓 단리 된 토굴 세포 (그림1A)를변환할뿐만 아니라, 오르가노이드 (그림2)및 더 일상적인 형질전환 접근법에 불응성 다른 세포?...

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

오르가노이드는 기본 구조 조직뿐만 아니라 생체 내 장 상피의 많은 분자 특징을 재구성하기 때문에이 기술은 실험실에서 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구 할 수 있게합니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 세포 독성을 가진 매우 효율적인 트랜스듀션 접근법을 사용하여 유기체를 유전적으로 설계하여 이러한 유전자 조작 된 오르가노이드의 기능적 연구를 가능하게하는 능력입니다. 이 기술의 의미는 우리가 마약 및 그밖 에이전트 또는 내정간섭에 장 기관가노이드를 드러날 수 있기 때문에 장 질병을 위한 치료로 확장합니다.이 방법은 유방 조직과 같은 오르가노이드 배양또는 표준 2D 조건하에서 성장하는 세포에 대한 다른 시스템에서 발달 및 병리학 적 과정을 연구하기 위해 적용 될 수있다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 엔지니어가 어려운 오르가노이드 또는 다른 세포에서 트랜스듀션으로 성공할 것입니다. 우리는 먼저 우리가 우리의 유기체와 줄기 세포를 변환하는 어려움을 만났을 때이 방법에 대한 아이디어를 했다.이 방법의 시각적 데모는 극저온 절개를 위해 지하 매트릭스에 포함 공정 중에 샘플이 제대로 처리되지 않으면 오르가노이드의 구조적 손실이 발생할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 바이러스 성 트랜스듀션을 위한 오르가노이드를 성장시키기 위해, 48웰 플레이트에서 잘 당 200 마이크로리터의 트랜스듀션 배지를 가진 종자 오르가노이드 세포 배양, 표준 조직 배양 배양인에서 배양한다. 48웰 플레이트에서 각각의 우물의 전도를 위해 농축 바이러스의 약 50 마이크로리터를 허용하는 트랜스듀션을 위한 바이러스의 해동 유리병.1.5 밀리리터 튜브에서 바이러스를 자기 나노 입자 용액의 12 마이크로 리터와 혼합하고 실온에서 15 분 동안 배양합니다. 15분 후, 자기 나노입자 용액및 바이러스 혼합물을 세포에 추가하여 유도한다. 48웰 플레이트를 마그네틱 플레이트에 놓고 표준 조직 배양 배양인인 배큐베이터에서 최소 2시간 동안 배양합니다.바이러스 성 형질 전환이 완료되면 감염된 오르가노이드 세포 클러스터 및 트랜스듀션 배지를 각각 웰에서 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 5분간 500배 g의 원심분리기. 상체를 부드러운 흡입으로 버리고 얼음에 펠릿이 들어있는 튜브를 5 분 동안 식힙니다.각 튜브에 120 마이크로리터의 지하 멤브레인 매트릭스를 추가하고 천천히 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 분리합니다. 새로운 48웰 플레이트에 매트릭스 세포 혼합물의 30 마이크로리터 방울을 종자. 매트릭스가 고화될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 5~15분간 배양합니다.각 우물에 트랜스듀션 배지를 추가하고 표준 조직 배양 인큐베이터에서 3~4일 동안 배양합니다. 3~4일 후에는 세포 클러스터를 오르간성 구조로 조직할 수 있도록 10배 배율로 광 현미경으로 배양을 검사합니다. 유기 배양 ENR 배지의 250 마이크로 리터로 각 우물의 트랜스듀션 배지를 부드럽게 교체하십시오.접시를 인큐베이터에 반환합니다. 부드러운 흡입에 의해 ENR 매체를 제거하고 지하 막 매트릭스를 교란하지 않도록주의함으로써이 절차를 시작합니다. PBS 500 마이크로리터로 부드럽게 씻으십시오.잘 당 4%의 파라포름알데히드 용액의 마이크로리터 1개를 추가하여 오르가노이드를 수정하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후 흡입에 의해 파라포름알데히드 용액을 제거합니다. 부드럽게 잘 당 PBS의 마이크로 리터 를 추가 한 다음 부드러운 흡입에 의해 PBS를 제거합니다.이런 식으로 PBS로 두 번 씻으시면 됩니다. 두 번째 세척에서 PBS를 제거하고 각 샘플에 30% 자당 버퍼1개를 추가합니다. 샘플을 탈수하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 자당에 고정 된 오르가노이드를 배양하십시오.흡입에 의해 자당 버퍼를 제거하고 각 우물의 매트릭스 층을 덮을 만큼 충분한 포함 화합물을 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 다음으로, 샘플을 영하 80도 의 냉동고에 10분 동안 또는 포함 화합물이 고체와 흰색으로 변할 때까지 놓습니다.가장자리를 따라 화합물의 최소 용융을 허용하기 위해 실온에 냉동 포함 화합물플레이트를 배치합니다. 메스 나 주걱을 사용하여 우물의 벽에서 블록을 분리하십시오. 용융을 방지하기 위해 신속하게 작동하여 집게를 사용하여 매트릭스 포함 화합물 블록을 제거하고 시편 블록에 배치하십시오.내장 화합물로 금형을 완전히 채웁니다. 단면에 블록을 사용하기 전에 30 분 동안 영하 80도에서 동결하십시오. 이 프로토콜은 먼저 GFP에 연결된 렌즈바이러스 벡터로 장 오르가노이드를 유도하여 최적화되었습니다.GFP는 오구체 발달의 각 단계에서 시각화되었으며, 토굴 세포가 낭종과 같은 구조로 구성될 때 또는 오르가노이드가 싹을 형성할 때 나중에 지점을 구성하는 경우를 포함하여 초기단계로 시각화되었습니다. 성공적으로 유도된 장 기관지들은 그 때 포르말린 고정, 저온절면, 면역형광 영상에 의해 분석되었다. 이 이미지에서 핵은 파란색으로 염색되고 녹색은 세포 경계를 구분하는 상피 세포 접착 분자를 나타냅니다.빨간색은 창세포를 식별하기 위해 리소솜 염색을 나타냅니다. 일단 마스터되면, 트랜스듀싱 오르가노이드는 약 3시간 안에 수행될 수 있고, 오르가노이드 크라지섹션 포함은 약 2 1/2시간 안에 행해질 수 있다. 이 절차를 시도할 때는 지하 매트릭스 시약을 처리할 때 얼음 작업을 하는 것이 중요합니다.이 절차를 완료한 후, 단백질 또는 세포기관을 검출하는 면역형광 분석 및 기타 방법을 수행하여 국소화 또는 상대적 풍부를 평가할 수 있다. 이 기술은 연구원이 생체 외에서 정상 생물학 과 질병 상태를 탐구하는 방법을 포장하고 또한 생체 내 연구 결과에 대한 트랜스 포이드 오르가노이드 또는 세포가 마우스로 이식 될 수 있는지. 이 비디오를 시청한 후에는 자기 라벨이 부착된 바이러스를 사용하여 저온 절전을 위해 유기체를 유전적으로 설계하는 방법을 잘 이해해야 합니다.바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행할 때 적절한 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 수행해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

연구

발생학

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

마우스 귀와 꼬리 조직에서 생성 차 섬유 아세포 배양

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

태아 장 오르가노이드를 사용하여 시험관내 빨기-위닝 전환 반복

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...