Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional de saúde (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), a associação americana de pulmão, a rede de saúde Allegheny-Johns Fundo de pesquisa Hopkins e as doenças digestivas Hopkins Centro núcleo de pesquisa básica.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais das instituições médicas Johns Hopkins (IACUC). Este protocolo é modificado a partir de um métodos publicados anteriormente10,11,12,13.
1. preparação de reagentes
<ol><li>Prepare um meio fresco de 293T com várias horas de antecedência e aqueça a 37 ° c em um banho de água por pelo men...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

A cultura preliminar do epitélio intestinal adulto como organóides fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos moleculars envolvidos na função da pilha de haste, na homeostase epithelial intestinal, e na patologia1,2,3, a 4. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 possa ser usada para projetar geneticamente organóides9, ela é limitada pela necessidade de tri...

A capacidade de cultura de rato ou células de criptas humanas como tridimensional (3D) organóides do intestino delgado ou cólon durante períodos prolongados de tempo proporcionou um grande avanço, porque estas culturas exibem características definidoras do epitélio intestinal in vivo 1. º , 2. º , 3. organóides derivados de criptas primárias são capazes de autorenovação e autoorganização, exibindo funções celulares semelhantes aos seus tecidos de origem. Na verdade, os organóides recapitulam não só a organização estrutural das criptas in vivo, mas também muitas características moleculares, proporcionando assim ferramentas úteis para estudar a biologia normal e os Estados da doença. Para ilustrar, os estudos organoid revelaram as vias moleculars novas envolvidas na regeneração do tecido1,2,3,4,5 assim como as drogas que poderiam realçar a função em configurações patológicas6,7.
O estudo das células estaminais intestinais é de particular interesse porque o revestimento intestinal está entre os tecidos de mamíferos mais altamente regenerativos, renovando-se a cada 3-5 dias para proteger o organismo de bactérias, toxinas e outros patógenos dentro do lúmens intestinais. As pilhas de haste intestinais (ISCS) são responsáveis para esta capacidade regenerativa notável e fornecem assim um paradigma original para estudar a função adulta da pilha de haste1,2. Experimentos de linhagem-rastreamento em camundongos demonstraram que células-tronco isoladas Lgr5-positivas podem ser cultivadas para gerar organóides 3D ou ' mini-Guts ' in vitro, onde eles espelham de perto suas contrapartes in vivo. Culturas organoides também podem ser derivadas de isolados de células de cripta intestinal, constituídos por progenitores, ISCs e células Paneth, sendo que estes últimos constituem as células de nicho epitelial in vivo. Na verdade, a cultura organóide de células de cripta intestinal primária evoluiu para uma técnica relativamente rotineira que é fácil de implementar na maioria dos laboratórios usando reagentes amplamente disponíveis. Este modelo também é capaz de análise quantitativa da expressão gênica por sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e proteínas por espectrometria de massas, imuno-histoquímica, ou coloração imunofluorescente2,4,8. Além, a genética funcional pode ser estudada usando o ganho--função (superexpressão do gene ou expressão de um gene de activação do mutante) ou perda--função (silenciamento do gene ou expressão de um mutante da perda--função) aproximações2.
Importante, a baixa eficiência e a toxicidade elevada do ADN padrão do plasmídeo ou dos protocolos virais da transdução com Polybrene permanecem um obstáculo principal no campo. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 permita a edição precisa do genoma, essa abordagem requer uma seleção demorada seguida pela validação da sequência9. Aqui, apresentamos um protocolo de transdução viral para organóides intestinais primários que otimiza a entrega de partículas virais por conjugação com nanopartículas magnéticas e aplicação de um campo magnético. Principais modificações aos protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 e recomendações para aumentar a eficiência são fornecidos. Nós igualmente descrevemos uma aproximação para gerar as seções congeladas dos organóides intactos cultivados no matrigel 3D (doravante referido como a matriz ou a matriz da membrana do porão) para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemistry ou Immunofluorescent.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

As culturas organoides intestinais proporcionam uma oportunidade única para investigar a biologia intestinal da célula-tronco e da cripta in vitro, embora abordagens eficientes para manipular a expressão gênica em organóides tenham feito progressos limitados nesta arena. Enquanto a tecnologia CRISPR/Cas9 permite a edição precisa do genoma das células para a geração de organoides, essa estratégia requer extensa seleção e triagem por análise de sequência, que é demorada e dispendiosa. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a transdução viral eficiente de organoids intestinais. Essa abordagem é rápida e altamente eficiente, diminuindo assim o tempo e a despesa inerentes à tecnologia CRISPR/Cas9. Nós igualmente apresentamos um protocolo para gerar seções congeladas das culturas organoid intactas para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemical ou Immunofluorescent, que pode ser usada para confirmar a expressão ou o silenciamento do gene. Após a transdução bem-sucedida de vetores virais para expressão gênica ou silenciamento é alcançada, a função de célula-tronco intestinal e cripta pode ser rapidamente avaliada. Embora a maioria dos estudos organoides empreguem ensaios in vitro, os organóides também podem ser entregues em camundongos para análises funcionais in vivo. Além disso, nossas abordagens são vantajosas para prever respostas terapêuticas às drogas porque as terapias atualmente disponíveis geralmente funcionam modulando a expressão gênica ou a função protéica em vez de alterar o genoma.

Aqui, nós descrevemos uma técnica rápida e altamente eficiente da transdução que chicotes nanopartículas magnéticas expor a um campo magnético para entregar o Lentivirus às pilhas do interesse. Com ferramentas prontamente disponíveis, aplicamos esta abordagem não só para transduce células criptárias recém-isoladas (Figura 1a), mas também para organóides (Figura 2) e outras células refratárias a abordagens de tr...

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Como os organoides recapitulam a organização estrutural nativa, bem como muitas características moleculares do epitélio intestinal in vivo, essa técnica nos permite estudar a biologia normal e os estados da doença em laboratório. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de projetar geneticamente organoides usando uma abordagem de transdução muito eficiente com baixa citotoxicidade, permitindo assim estudos funcionais desses organoides geneticamente manipulados. As implicações dessa técnica se estendem à terapia para doença intestinal porque podemos expor organoides intestinais a drogas e outros agentes ou intervenções.Esse método pode ser aplicado para estudar processos de desenvolvimento e patológicos em outros sistemas favoráveis a culturas organoides, como tecidos mamários ou para células que crescem sob condições padrão 2D. Geralmente, indivíduos novos neste método terão sucesso com a transdução em organoides difíceis de projetar ou outras células. Primeiro tivemos a ideia desse método quando encontramos dificuldades para transdutorar nossos organoides e células-tronco.A demonstração visual deste método é fundamental, pois a perda estrutural dos organoides pode ocorrer se as amostras não forem tratadas adequadamente durante o processo de incorporação na matriz do porão para criosectioning. Para cultivar organoides para transdução viral, culturas organoides de sementes com 200 microliters de meio de transdução por poço em uma placa de 48 poços, e incubar em uma incubadora de cultura de tecido padrão. Descongelar frascos de vírus para transdução, permitindo cerca de 50 microlitres de vírus concentrados para a transdução de cada poço em placas de 48 poços.Em um tubo de 1,5 mililitro, misture o vírus com 12 microlitadores de uma solução de nanopartículas magnéticas e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Após 15 minutos, adicione a solução de nanopartículas magnéticas e a mistura de vírus às células a serem transduzidas. Coloque a placa de 48 poços em uma placa magnética e incuba em uma incubadora padrão de cultura tecidual por pelo menos duas horas.Quando a transfecção viral estiver completa, transfira os aglomerados de células organoides infectados e o meio de transdução de cada poço para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 500 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante com sucção suave e esfrie os tubos que contêm a pelota no gelo por cinco minutos.Adicione 120 microliters de matriz de membrana de porão a cada tubo, e resuspense a pelota, tubos lentamente para cima e para baixo. Sementes 30-microliter gotas da mistura matriz-célula em uma nova placa de 48 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos até que a matriz se solidifique.Adicione o meio de transdução a cada poço e incuba em uma incubadora padrão de cultura tecidual por três a quatro dias. Após três a quatro dias, inspecione as culturas sob um microscópio leve a 10x de ampliação para garantir a organização de aglomerados celulares em estruturas organoides. Substitua suavemente o meio de transdução em cada poço por 250 microliters de cultura organoide enr médio.Devolva a placa para a incubadora. Inicie este procedimento removendo o meio ENR por sucção suave, tomando cuidado para não perturbar a matriz de membrana do porão. Lave suavemente com 500 microliters de PBS.Corrija os organoides adicionando um microliter de solução de 4% de paraformaldeído por poço, e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Após 30 minutos, remova a solução de paraformaldeído por sucção. Adicione suavemente um microliter de PBS por poço e, em seguida, remova o PBS por sucção suave.Desta forma, lave duas vezes com PBS. Remova o PBS da segunda lavagem e adicione um microliter de 30% de tampão de sacarose a cada amostra. Incubar os organoides fixos em sacarose por uma hora a quatro graus Celsius para desidratar as amostras.Remova o tampão de sacarose por sucção e adicione o suficiente para cobrir a camada de matriz em cada poço. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras em um congelador Celsius de menos 80 graus por 10 minutos ou até que o composto de incorporação fique sólido e branco.Coloque a placa com composto de incorporação congelado à temperatura ambiente para permitir o derretimento mínimo do composto ao longo das bordas. Use um bisturi ou espátula para separar o bloco das paredes do poço. Trabalhe rapidamente para evitar o derretimento, usando fórceps para remover o bloco composto de incorporação da matriz e colocá-lo em um bloco de espécimes.Encha o molde completamente com o composto de incorporação. Congele a menos 80 graus Celsius por 30 minutos antes de usar o bloco para secção. Este protocolo foi otimizado pela primeira transdução de organoides intestinais com vetores lentivirais ligados à GFP.O GFP foi visualizado em cada estágio no desenvolvimento organoide, inclusive no início, quando as células criptas se organizam em estruturas semelhantes a cistos ou em momentos posteriores quando organoides formam botões. Os organoides intestinais transduzidos com sucesso foram então corrigidos, criosectionados e analisados por imagens de imunofluorescência. Nesta imagem, os núcleos estão manchados em azul, e o verde indica moléculas de adesão de células epiteliais, que demarcam fronteiras celulares.O vermelho indica coloração lísmófera para identificar células paneth. Uma vez dominados, organoides transdutores podem ser realizados em cerca de três horas, e a incorporação de criseção organoides pode ser feita em cerca de 2 horas e meia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar no gelo ao manusear reagentes de matriz de porão.Após a conclusão desse procedimento, a análise imunofluorescente e outros métodos para detectar proteínas ou organelas podem ser realizados para avaliar a localização ou abundância relativa. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem estados normais de biologia e doenças in vitro e também para estudos in vivo se os organoides ou células transduzidas podem ser implantados em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar vírus magneticamente rotulados para criar organoides geneticamente para criosectioning.Por favor, não se esqueça que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar equipamentos de proteção apropriados devem ser sempre realizadas ao realizar este procedimento.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Biologia do Desenvolvimento

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Avaliação simultânea de Cardiomyocyte DNA Síntese e Ploidia: Um Método de Assistência Quantificação dos cardiomiócitos Regeneração e volume de negócios

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados

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