Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами От Национального института здравоохранения (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Мэриленд Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Американской ассоциации легких, Allegheny Health Network - Johns Научно-исследовательский фонд Хопкинса и Центр основных исследований в области заболеваний пищеварения Хопкинса.

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и использованию медицинских учреждений Джонса Хопкинса (IACUC). Этот протокол изменяется из ранее опубликованных методов10,11,12,13.
1. Подготовка реаг...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

Первичная культура эпителия кишечника у взрослых в качестве органоидов обеспечивает мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов, участвующих в функции стволовых клеток, эпителиального гомеостаза кишечника и патологии1,2,<...

Способность к культуре мыши или человека склепы клеток, как трехмерные (3D) органоидов из тонкого кишечника или толстой кишки в течение длительных периодов времени при условии крупного прорыва, потому что эти культуры отображают определяющие особенности кишечного эпителия in vivo 1 , 2 , 3. Органоиды, полученные из первичных склепов, способны к самообновлению и самоорганизации, демонстрируя клеточные функции, аналогичные их тканям происхождения. Действительно, органоиды резюмируют не только структурную организацию склепов in vivo, но и многие молекулярные особенности, обеспечивая тем самым полезные инструменты для изучения нормальной биологии и состояния болезней. Чтобы проиллюстрировать, органоидные исследования выявилиновые молекулярные пути, участвующие в регенерации тканей 1,2,3,4,5, а также препараты, которые могли бы улучшить функцию в патологическихусловиях 6,7.
Изучение кишечных стволовых клеток представляет особый интерес, поскольку кишечная подкладка является одной из наиболее регенеративных тканей млекопитающих, обновляя себя каждые 3-5 дней, чтобы защитить организм от бактерий, токсинов и других патогенов в кишечные люмены. Кишечные стволовые клетки (ISCs) несут ответственность за эту замечательную регенеративную способность и, таким образом, обеспечивают уникальную парадигму для изучения функции стволовых клеток взрослых1,2. Линейные исследования экспериментов на мышах показали, что изолированные Lgr5-положительные стволовые клетки могут быть культивированы для генерации 3D-органоидов или «мини-кишки» в пробирке, где они тесно отражают свои аналоги in vivo. Органоидные культуры также могут быть получены из изолятов клеток кишечных склепов, состоящих из прародителей, МЦКов и клеток Панета, последние из которых составляют эпителиальные нишевые клетки in vivo. На самом деле, органоидная культура из первичных клеток кишечного склепа превратилась в относительно рутинную технику, которую легко реализовать в большинстве лабораторий с использованием широко доступных реагентов. Эта модель также поддается количественному анализу экспрессии генов с помощью РНК-секвенирования (РНК-Сек) и белков масс-спектрометрией, иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием2,4,8. Кроме того, функциональная генетика может быть изучена с помощью усиления функции (переэкспрессия гена или экспрессии активирующего мутантного гена) или потери функции (заглушение гена или экспрессия мутанта потери функции) приближаетсяк2.
Важно отметить, что низкая эффективность и высокая токсичность стандартной плазмидной ДНК или вирусных протоколов трансдукции с полибреном остаются основным препятствием в этой области. Хотя технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном, этот подход требует многовремени выбора с последующим проверкой последовательности9. Здесь мы представляем протокол вирусной трансдукции для первичных кишечных органоидов, который оптимизирует доставку вирусных частиц путем спряжения к магнитным наночастицам и применения магнитного поля. Приводятся ключевые измененияв предыдущие протоколы 4,5,10,11,12,13 и рекомендации по повышению эффективности. Мы также описываем подход к созданию замороженных секций из нетронутых органоидов, культивированных в 3D матригель (отсюда называют подвал мембранной матрицы или матрицы) для дальнейшего анализа с иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного окрашивания.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Кишечные органоидные культуры предоставляют уникальную возможность исследовать кишечные стволовые клетки и биологии склепа in vitro, хотя эффективные подходы к манипулированию экспрессией генов в органоидах добились ограниченного прогресса в этой области. В то время как технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном клетки для генерации органоидов, эта стратегия требует тщательного отбора и скрининга путем анализа последовательности, что является одновременно трудоемким и дорогостоящим. Здесь мы предоставляем подробный протокол для эффективного вирусного трансдукции кишечных органоидов. Такой подход является быстрым и высокоэффективным, что сокращает время и расходы, присущие технологии CRISPR/Cas9. Мы также представляем протокол для генерации замороженных участков из нетронутых органоидных культур для дальнейшего анализа с иммуногистохимическим или иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое может быть использовано для подтверждения экспрессии генов или замалчивания. После успешного трансдукции вирусных векторов экспрессии генов или замалчивания, кишечные стволовые клетки и функции крипты могут быть быстро оценены. Хотя большинство органоидных исследований использовать в пробирке анализы, органоиды также могут быть доставлены мышам для in vivo функциональный анализ. Кроме того, наши подходы являются выгодными для прогнозирования терапевтических реакций на наркотики, потому что в настоящее время доступны терапии обычно функции модуляции экспрессии генов или белковой функции, а не изменения генома.

Здесь мы описываем быструю и высокоэффективную технику трансдукции, которая использует магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию магнитного поля, чтобы доставить лентивирус к клеткам, представляющим интерес. С легкодоступными инструментами, мы применили э?...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Мы описываем пошаговые инструкции: 1) эффективно инженер кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц для ленти- или ретровирусной трансдукции, и, 2) генерировать замороженные секции из инженерных органоидов. Этот подход является мощным инструментом для эффективного изменения экспрессии генов в органоидах для исследования эффектов ниже по течению.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Поскольку органоиды подысовывают родную структурную организацию, а также многие молекулярные особенности кишечного эпителия in vivo, этот метод позволяет изучать нормальную биологию и состояния заболеваний в лаборатории. Основным преимуществом этого метода является способность генетически инженер органоидов с использованием очень высокоэффективного подхода к трансдукции с низкой цитотоксичности, что позволяет для функциональных исследований этих генетически манипулируемых органоидов. Последствия этого метода распространяются на терапию кишечных заболеваний, потому что мы можем подвергать кишечных органоидов наркотиков и других агентов или мероприятий.Этот метод может быть применен для изучения развития и патологических процессов в других системах, подложных органоидным культурам, таким как ткани молочной железы или для клеток, растущих в стандартных 2D условиях. Как правило, лица, новые для этого метода будет успешным с трансдукции в трудно-инженер органоидов или других клеток. Впервые у нас возникла идея этого метода, когда мы столкнулись с трудностями при трансдуцировании наших органоидов и стволовых клеток.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как структурная потеря органоидов может произойти, если образцы не должным образом обработаны во время встраивания процесса в подвале матрицы для криозирования. Выращивать органоиды для вирусной трансдукции, культуры семенных органоидных клеток с 200 микролитров трансдукционной среды на колодец в 48-колодец пластины, и инкубировать в стандартной культуре тканей инкубатора. Оттепель флаконы вируса для трансдукции, что позволяет около 50 микролитров концентрированного вируса для трансдукции каждой из них в 48-хорошо пластин.В 1,5-миллилитровой трубке смешайте вирус с 12 микролитровами раствора магнитных наночастиц и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Через 15 минут добавьте магнитный раствор наночастиц и вирусную смесь в клетки для индуцированных. Поместите 48-хорошо пластины на магнитной пластине, и инкубировать в стандартной культуры ткани инкубатор, по крайней мере два часа.Когда вирусная трансфекция будет завершена, перенесите инфицированные органоидные клеточные кластеры и трансдукционную среду из каждого колодец в 1,5-миллилитровую трубку. Центрифуга по 500 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта с нежным всасыванием и охладьте трубки, содержащие гранулы на льду в течение пяти минут.Добавьте 120 микролитров мембранной матрицы подвала к каждой трубке и повторно посовелите гранулы, медленно трубя вверх и вниз. Семенные 30-микролитровые капли матрично-клеточной смеси в новую пластину из 48 колодец. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение пяти-пяти минут, пока матрица не затвердеет.Добавьте трансдукционную среду к каждой хорошо, и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение трех-четырех дней. Через три-четыре дня проинспектировать культуры под световым микроскопом при 10-м увеличении, чтобы обеспечить организацию клеточных кластеров в органоидные структуры. Аккуратно замените трансдукционную среду в каждой хорошо с 250 микролитров органоидной культуры ENR среды.Верните тарелку в инкубатор. Начните эту процедуру, удалив enR среды нежным всасывания, будьте осторожны, чтобы не возмущать матрицы мембраны подвала. Аккуратно промыть 500 микролитров PBS.Исправить органоиды, добавив один микролитер 4%параформальдегид раствор на колодец, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Через 30 минут удалите раствор параформальдегида путем всасывания. Аккуратно добавьте один микролитер PBS на колодец, а затем удалите PBS нежным всасыванием.Таким образом, мыть дважды с PBS. Удалите PBS из второй стирки, и добавить один микролитер 30% сахарозы буфера для каждого образца. Инкубировать фиксированные органоиды в сахарозе в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, чтобы обезвоживать образцы.Удалите буфер сахарозы путем всасывания, и добавить достаточно встраивания соединения для покрытия матричного слоя в каждой хорошо. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите образцы в морозильную камеру по температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут или до тех пор, пока встраивающий соединение не станет твердым и белым.Поместите пластину с замороженным встраиваемым соединением при комнатной температуре, чтобы обеспечить минимальное таяние соединения по краям. Используйте скальпель или шпатель, чтобы отделить блок от стенок колодеца. Работайте быстро, чтобы предотвратить таяние, используя типсы, чтобы удалить матрицу встраивания соединения блока, и поместить его в блок образца.Заполните форму полностью с встраиванием соединения. Заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, прежде чем использовать блок для секций. Этот протокол был оптимизирован путем первой трансдуцирования кишечных органоидов с лентивирусными векторами, связанными с GFP.GFP был визуализированы на каждом этапе развития органоидов, в том числе на раннем этапе, когда крипто-клетки организовать в кисты, как структуры или на более поздних точках времени, когда органоиды образуют почки. Успешно транс индуцированные кишечные органоиды были затем формалин-фиксированной, криозекции, и проанализированы с помощью иммунофлуоресценции изображений. На этом изображении ядра окрашены в синий цвет, а зеленый цвет указывает на молекулы адгезии эпителиальных клеток, которые демаркирует границы клеток.Красный цвет указывает на лизосом окрашивание для идентификации клеток Панета. После освоения, трансдуцирования органоидов может быть выполнена примерно за три часа, и органоиды крисекции встраивания может быть сделано примерно в 2 1 / 2 часа. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы работать на льду при обработке подвала матричных реагентов.После завершения этой процедуры, иммунофлуоресцентный анализ и другие методы для обнаружения белков или органелл могут быть выполнены для оценки локализации или относительного изобилия. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы исследовать нормальную биологию и болезни государств в пробирке, а также для виво исследований, если транс индуцированных органоидов или клеток могут быть имплантированы в мышей. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать магнитно помечены вирусы генетически инженер органоидов для криозирования.Пожалуйста, не забывайте, что работа с вирусами может быть чрезвычайно опасной, и такие меры предосторожности, как ношение соответствующего защитного снаряжения, всегда должны быть предприняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из замороженных Баффи пальто с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Использование первичных культур нейросферы для изучения первичных ресничек

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Иммуно люминесцентные маркировки микротрубочек и Centrosomal белков в Ex Vivo кишечных тканей и 3D в Vitro кишечных Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Клональная генетическая трассировка с помощью мыши Confetti для изучения минерализованных тканей

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Повторяя сосание к отнятию Переход в пробирке с использованием плода кишечных органоидов

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...