Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), el Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), la Asociación Americana del Pulmón, la Red de Salud Allegheny - Johns Hopkins Research Fund y hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de las Instituciones Médicas Johns Hopkins (IACUC). Este protocolo se modifica a partir de los métodos publicados anteriormente10,11,12,13.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Preparar el medio 293T fresco varias horas de antelación y calentar a 37 oC en un baño de agua durante al menos 10...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

El cultivo primario del epitelio intestinal adulto como organoides proporciona una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos molecularesimplicados en la función de las células madre, la homeostasis epitelial intestinal y la patología 1,2,3, 4. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 se puede utilizarpara diseñar genéticamente organoides 9, está limitada por la n...

La capacidad de cultivar células de ratones o criptas humanas como organoides tridimensionales (3D) desde el intestino delgado o el colon durante períodos de tiempo prolongados proporcionó un gran avance porque estos cultivos muestran características definitorias del epitelio intestinal in vivo 1 , 2 , 3. Los organoides derivados de las criptas primarias son capaces de auto-renovación y auto-organización, exhibiendo funciones celulares similares a sus tejidos de origen. De hecho, los organoides recapitulan no sólo la organización estructural de las criptas in vivo, sino también muchas características moleculares, proporcionando así herramientas útiles para estudiar la biología normal y los estados de enfermedad. Para ilustrar, estudios organoides han revelado nuevas vías moleculares implicadas en la regeneración tisular1,2,3,4,5 así como fármacos que podrían mejorar la función en ajustes patológicos6,7.
El estudio de las células madre intestinales es de particular interés porque el revestimiento intestinal se encuentra entre los tejidos de mamíferos más altamente regenerativos, renovándose cada 3-5 días para proteger el organismo de bacterias, toxinas y otros patógenos dentro de la lúmenes intestinales. Las células madre intestinales (ISC) son responsables de esta notable capacidad regenerativa y por lo tanto proporcionan un paradigma único para el estudio de la función de células madre adultas1,2. Los experimentos de trazado de linaje en ratones demostraron que se pueden cultivar células madre aisladas lgr5 positivas para generar organoides 3D o "mini-guts" in vitro donde reflejan de cerca sus contrapartes in vivo. Los cultivos organoides también pueden derivarse de aislados celulares de cripta intestinal compuestos por progenitores, ISC y células Depanet, los cuales constituyen las células de nicho epitelial in vivo. De hecho, el cultivo organoide a partir de células de cripta intestinal primaria ha evolucionado hasta convertirse en una técnica relativamente rutinaria que es fácil de implementar en la mayoría de los laboratorios utilizando reactivos ampliamente disponibles. Este modelo también es susceptible al análisis cuantitativo de la expresión génica mediante la secuenciación de ARN (RNA-Seq) y proteínas por espectrometría de masas, inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente2,4,8. Además, la genética funcional se puede estudiar utilizando enfoques de ganancia de función (sobreexpresión genética o expresión de un gen mutante activador) o pérdida de función (silenciamiento del gen o expresión de un mutante de pérdida de función)2.
Es importante destacar que la baja eficiencia y la alta toxicidad del ADN plásmido estándar o los protocolos de transducción viral con polibrino siguen siendo un obstáculo importante en el campo. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 permite una edición precisa del genoma, este enfoque requiere una selección que requiere mucho tiempo seguida de la validación de secuencias9. Aquí, presentamos un protocolo de transducción viral para organoides intestinales primarios que optimiza la entrega de partículas virales por conjugación a nanopartículas magnéticas y aplicación de un campo magnético. Se proporcionan modificaciones clave a los protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 y recomendaciones para mejorar la eficiencia. También describimos un enfoque para generar secciones congeladas a partir de organoides intactos cultivados en matrigael 3D (en adelante, matriz o matriz de membrana de sótano) para su posterior análisis con inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Los cultivos organoides intestinales proporcionan una oportunidad única para investigar la biología intestinal de células madre y criptas in vitro, aunque los enfoques eficientes para manipular la expresión génica en organoides han hecho progresos limitados en esta arena. Si bien la tecnología CRISPR/Cas9 permite la edición precisa del genoma de las células para la generación de organoides, esta estrategia requiere una amplia selección y cribado por análisis de secuencia, que requiere mucho tiempo y es costoso. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la transducción viral eficiente de organoides intestinales. Este enfoque es rápido y altamente eficiente, disminuyendo así el tiempo y los gastos inherentes a la tecnología CRISPR/Cas9. También presentamos un protocolo para generar secciones congeladas de cultivos organoides intactos para su posterior análisis con tinción inmunohistoquímica o inmunofluorescente, que se puede utilizar para confirmar la expresión génica o el silenciamiento. Después de lograr una transducción exitosa de vectores virales para la expresión génica o silenciamiento, se puede evaluar rápidamente la función de células madre intestinales y criptas. Aunque la mayoría de los estudios organoides emplean ensayos in vitro, los organoides también pueden ser entregados a ratones para análisis funcionales in vivo. Además, nuestros enfoques son ventajosos para predecir las respuestas terapéuticas a los fármacos porque las terapias disponibles actualmente generalmente funcionan modulando la expresión génica o la función proteica en lugar de alterar el genoma.

Aquí, describimos una técnica de transducción rápida y altamente eficiente que aprovecha las nanopartículas magnéticas expuestas a un campo magnético para entregar lentivirus a las células de interés. Con las herramientas fácilmente disponibles, hemos aplicado este enfoque no sólo para transducir células criptopeticas recién aisladas (Figura1A),sino también para organoides (Figura2)y otras células que son refractar...

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Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

Describimos instrucciones paso a paso para: 1) diseñar de manera eficiente organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción lenti- o retroviral, y, 2) generar secciones congeladas a partir de organoides diseñados. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para alterar eficientemente la expresión génica en organoides para la investigación de los efectos posteriores.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Debido a que los organoides recapitulan la organización estructural nativa, así como muchas características moleculares del epitelio intestinal in vivo, esta técnica nos permite estudiar la biología normal y los estados de la enfermedad en el laboratorio. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de diseñar genéticamente organoides utilizando un enfoque de transducción muy altamente eficiente con baja citotoxicidad, lo que permite estudios funcionales de estos organoides manipulados genéticamente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para la enfermedad intestinal porque podemos exponer organoides intestinales a fármacos y otros agentes o intervenciones.Este método se puede aplicar para estudiar procesos patéticos y de desarrollo en otros sistemas susceptibles de cultivos organoides, como los tejidos mamarios o para las células que crecen bajo condiciones 2D estándar. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrán éxito con la transducción en organoides difíciles de ingenieros u otras células. Primero tuvimos la idea de este método cuando nos encontramos con dificultades para transducir nuestros organoides y células madre.La demostración visual de este método es crítica, ya que la pérdida estructural de los organoides puede ocurrir si las muestras no se tratan adecuadamente durante el proceso de incrustación en la matriz del sótano para la criosectación. Para cultivar organoides para la transducción viral, los cultivos celulares organoides de semillas con 200 microlitros de medios de transducción por pozo en una placa de 48 pozos, e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar. Descongelar viales de virus para la transducción, permitiendo alrededor de 50 microlitros de virus concentrados para la transducción de cada pozo en placas de 48 pozos.En un tubo de 1,5 mililitros, mezcle el virus con 12 microlitros de una solución de nanopartícula magnética e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue la solución de nanopartículas magnéticas y la mezcla de virus a las células a transducir. Coloque la placa de 48 pozos en una placa magnética e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante al menos dos horas.Cuando la transfección viral esté completa, transfiera los racimos de células organoides infectadas y el medio de transducción de cada pozo a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante con succión suave y enfríe los tubos que contienen el pellet sobre hielo durante cinco minutos.Añadir 120 microlitros de matriz de membrana sótano a cada tubo, y resuspender el pellet pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Siembra de 30 microlitros de la mezcla matriz-célula en una nueva placa de 48 pozos. Incubar la placa a 37 grados celsius durante cinco a 15 minutos hasta que la matriz se solidifique.Añadir medio de transducción a cada pozo, e incubar en una incubadora de cultivo de tejido estándar durante tres a cuatro días. Después de tres a cuatro días, inspeccione los cultivos bajo un microscopio de luz con un aumento de 10 veces para asegurar la organización de los racimos celulares en estructuras organoides. Sustituya suavemente el medio de transducción en cada pozo por 250 microlitros de medio de cultivo organoide ENR.Devuelva la placa a la incubadora. Comience este procedimiento retirando el medio ENR por succión suave, teniendo cuidado de no perturbar la matriz de membrana del sótano. Lavar suavemente con 500 microlitros de PBS.Fijar los organoides añadiendo un microlitro de 4%solución de paraformaldehído por pozo, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la solución de paraformaldehído por succión. Agregue suavemente un microlitros de PBS por pozo, y luego retire el PBS por succión suave.De esta manera, lave dos veces con PBS. Retire el PBS del segundo lavado y agregue un microlitros de 30% de tampón de sacarosa a cada muestra. Incubar los organoides fijos en sacarosa durante una hora a cuatro grados centígrados para deshidratar las muestras.Retire el búfer de sacarosa por succión, y agregue suficiente compuesto de incrustación para cubrir la capa de matriz en cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, coloque las muestras en un congelador celsius de menos 80 grados durante 10 minutos o hasta que el compuesto de incrustación se vuelva sólido y blanco.Coloque la placa con compuesto de incrustación congelado a temperatura ambiente para permitir una fusión mínima del compuesto a lo largo de los bordes. Usa un bisturí o una espátula para separar el bloque de las paredes del pozo. Trabaje rápidamente para evitar el derretimiento, utilizando fórceps para eliminar el bloque compuesto de incrustación de matriz, y colóquelo en un bloque de muestras.Llene el molde completamente con compuesto de incrustación. Congele a menos 80 grados Centígrados durante 30 minutos antes de usar el bloque para seccionar. Este protocolo se optimizó transduciendo primero organoides intestinales con vectores lentivirales vinculados a la GFP.La GFP se visualizó en cada etapa del desarrollo organoides, incluso al principio cuando las células de la cripta se organizan en estructuras similares a quistes o en momentos posteriores cuando los organoides forman brotes. Los organoides intestinales transducidos con éxito fueron entonces fijados por formalina, criocoscionados y analizados por imágenes de inmunofluorescencia. En esta imagen, los núcleos se tiñen de azul, y el verde indica moléculas de adhesión de células epiteliales, que demarcan los bordes celulares.El rojo indica manchas de lisosoma para identificar las celdas de Paneth. Una vez dominados, los organoides transductores se pueden realizar en unas tres horas, y la incrustación de la criosectación de organoides se puede hacer en aproximadamente 2 horas y media. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en hielo al manipular reactivos de matriz de sótano.Después de completar este procedimiento, se pueden realizar análisis inmunofluorescentes y otros métodos para detectar proteínas u orgánulos para evaluar la localización o la abundancia relativa. Esta técnica allana las formas para que los investigadores exploren la biología normal y los estados de la enfermedad in vitro y también para estudios in vivo si los organoides o células transducidas se pueden implantar en ratones. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo utilizar virus etiquetados magnéticamente para diseñar genéticamente organoides para la criocciones.Por favor, no olvide que trabajar con virus puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección adecuado al realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

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Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

El uso de cultivos de neuroesferas primarias estudian primaria cilios

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

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Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...