Name: genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland stamcells forskningsfond (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), American lung Association, den Allegheny Health Network-Johns Hopkins forskningsfond och Hopkins matsmältningsorganen grundforskning kärna centrum.

Detta protokoll godkändes av Johns Hopkins Medical institutioners djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Detta protokoll har modifierats från tidigare publicerade metoder10,11,12,13.
1. beredning av reagenser
<ol><li>Förbered färskt 293T-medium flera timmar i förväg och Värm till 37 ° c i ett vattenbad i minst 10 minuter före användning (t...

<ol>
	<li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis.">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li><li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche.">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts.">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Mu&#241;oz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature:+robust+expression+of+proposed+quiescent+'+4'+cellmarkers.">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells.">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis.">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li><li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus.">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li><li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors.">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210 (2013).</li></ol>

Primär kultur av vuxna intestinal epitel som organoider ger ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära mekanismer som är involverade i stamcells funktion, intestinal epitelial homeostas, och patologi1,2,3, 4. Även om CRISPR/Cas9 teknik kan användas för att genetiskt iscensätta organoider9, är det begränsat av behovet av omfattande screening och urval ba...

Förmågan att odla mus eller mänskliga kryptor celler som tredimensionell (3D) organoider från tunntarmen eller tjocktarmen under längre tidsperioder som ett stort genombrott eftersom dessa kulturer Visa definierande egenskaper av intestinal epitel in vivo 1 , 2 , 3. organoider som härrör från primära kryptor kan själv förnyas och självorganisering, uppvisar cellulära funktioner som liknar deras vävnader av ursprung. Faktum organoider recapitulate inte bara strukturell organisation av kryptor in vivo, men också många molekylära funktioner, vilket ger användbara verktyg för att studera normal biologi och sjukdomstillstånd. För att illustrera, Organoid studier har avslöjat nya molekylära vägar involverade i vävnadsregenerering1,2,3,4,5 samt läkemedel som kan förbättra funktionen i patologisk inställningar6,7.
Studiet av tarm stamceller är av särskilt intresse eftersom tarmslemhinnan är bland de mest regenerativa däggdjursvävnader, förnya sig varje 3-5 dagar för att skydda organismen från bakterier, toxiner och andra patogener inom tarm lumen. Intestinala stamceller (iSCS) är ansvariga för denna anmärkningsvärda regenerativ förmåga och därmed ge en unik paradigm för att studera vuxna stamceller funktion1,2. Försök med härstamnings spårning hos möss visade att isolerade Lgr5-positiva stamceller kan odlas för att generera 3D-organoider eller "mini-Guts" in vitro där de nära speglar deras in vivo motsvarigheter. Organoid kulturer kan också härledas från intestinal crypt cell isolat består av progenitorer, ISCs, och Paneth celler, den senare som utgör epiteliala nisch celler in vivo. I själva verket, Organoid kultur från primära tarm kryptan celler har utvecklats till en relativt rutinmässig teknik som är lätt att genomföra i de flesta laboratorier med allmänt tillgängliga reagenser. Denna modell är också mottaglig för kvantitativ analys av genuttryck genom RNA-sekvensering (RNA-SEQ) och proteiner med masspektrometri, immunohistokemi, eller Immunofluorescerande färgning2,4,8. Dessutom kan funktionell genetik studeras med hjälp av Gain-of-funktion (genöveruttryck eller uttryck för en aktiverande mutantgen) eller förlust-av-funktion (gen ljuddämpning eller uttryck för en förlust-av-funktion Mutant) närmar2.
Viktigt, låg verkningsgrad och hög toxicitet av standard plasmid DNA eller viral signaltransduktion protokoll med polybrene förbli ett stort hinder i området. Även om CRISPR/Cas9-tekniken möjliggör exakt genom redigering, kräver denna metod tidskrävande val följt av sekvensvalidering9. Här presenterar vi en viral signaltransduktion protokoll för primära intestinala organoider som optimerar leveransen av virala partiklar genom konjugering till magnetiska nanopartiklar och tillämpning av ett magnetfält. Viktiga ändringar av tidigare protokoll4,5,10,11,12,13 och rekommendationer för att öka effektiviteten tillhandahålls. Vi beskriver också en metod för att generera frysta sektioner från intakta organoider odlade i 3D-matrigel (hädanefter kallad basalmembran Matrix eller Matrix) för vidare analys med immunohistokemi eller Immunofluorescerande färgning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Base medium for 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Virus plasmids transfection medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>Component of virus collection medium and 293T medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>A wash buffer and component of crypt dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mem-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamaxII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38 B</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>7150-RS-025/CF</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I9278-5ml</td>
			<td>Component of organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N3376-100G</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN-010</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td>Component of Transduction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Component of Crypts dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Component of organoid digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matrigel(Growth factor reduced)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Used as a matrix to embed organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Medium for transfection in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViralMag R/L</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>RL40200</td>
			<td>Magnetic particles of viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic plate</td>
			<td>Oz Biosiences</td>
			<td>MF10000</td>
			<td>Magnetic plate to facilitate viral transduction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection agent in viral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Coating for plates before seeding 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Boster</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>Solution to fix organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T embedding compound</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4583S</td>
			<td>For embedding of the the organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>260250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Inverted microscop CK30</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td>for scanning and counting crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Axiovert 200</td>
			<td>for viewing fluorescence in the crypts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td>For concentrating viruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20 &#181;m (Cell Strainer)</td>
			<td>pluriSelect</td>
			<td>SKU 43-50020</td>
			<td>For preparing organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340</td>
			<td>For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M8937-100EA</td>
			<td>ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal strain: C57BL/6J</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>#000664</td>
			<td>For organoid culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic engineering of primary mouse intestinal organoids using magnetic nanoparticle transduction viral vectors for frozen sectioning

Intestinala Organoid kulturer ger en unik möjlighet att undersöka intestinal stamceller och crypt biologi in vitro, även om effektiva metoder för att manipulera genuttryck i organoider har gjort begränsade framsteg på denna Arena. Medan CRISPR/Cas9 teknik möjliggör exakt genom redigering av celler för Organoid generation, kräver denna strategi omfattande urval och screening av sekvens analys, vilket är både tidskrävande och kostsamt. Här ger vi ett detaljerat protokoll för effektiv viral transduktion av intestinala organoider. Denna metod är snabb och mycket effektiv, vilket minskar den tid och kostnader som är förknippade med CRISPR/Cas9 teknik. Vi presenterar också ett protokoll för att generera frysta sektioner från intakt Organoid kulturer för vidare analys med immunohistokemisk eller Immunofluorescerande färgning, som kan användas för att bekräfta genuttryck eller ljuddämpning. Efter lyckad transduktion av virala vektorer för genuttryck eller ljuddämpning uppnås, kan intestinal Stem cell och crypt funktion snabbt bedömas. Även om de flesta Organoid studier använder in vitro-analyser, kan organoider också levereras till möss för in vivo funktionella analyser. Dessutom, våra metoder är fördelaktiga för att förutsäga terapeutiska svar på läkemedel eftersom närvarande tillgängliga terapier i allmänhet fungerar genom att modulera genuttryck eller proteinfunktion snarare än att förändra genomet.

Här beskriver vi en snabb och mycket effektiv transduktionsteknik som utnyttjar magnetiska nanopartiklar som utsätts för ett magnetfält för att leverera lentivirus till celler av intresse. Med lättillgängliga verktyg har vi tillämpat denna metod inte bara för att transduce nyligen isolerade crypt celler (figur 1a), men också för organoider (figur 2) och andra celler som är refraktära till mer rutinmässig transduktio...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning at JoVE.com

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknik för primär mus intestinal Organoider med hjälp av magnetiska nanopartikel Transduction virala vektorer för frysta snittning

Vi beskriver steg-för-steg-instruktioner för att: 1) effektivt iscensätta intestinala organoider med hjälp av magnetiska nanopartiklar för lenti-eller antiretrovirala transduktion, och, 2) generera frysta sektioner från konstruerade organoider. Detta tillvägagångssätt ger ett kraftfullt verktyg för att effektivt förändra genuttryck i organoider för utredning av nedströms effekter.

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Eftersom organoider rekapitulera den inhemska strukturella organisationen, liksom många molekylära funktioner i intestinala epitel in vivo, denna teknik tillåter oss att studera normala biologi och sjukdom stater i laboratoriet. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att genetiskt ingenjör organoider med hjälp av en mycket högeffektiv transduktion tillvägagångssätt med låg cytotoxicitet, vilket möjliggör funktionella studier av dessa genetiskt manipulerade organoider. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi för tarmsjukdom eftersom vi kan utsätta intestinala organoider till droger och andra agenter eller interventioner.Denna metod kan tillämpas för att studera utvecklingsmässiga och patologiska processer i andra system som är mottagliga för organoida kulturer, såsom bröstvävnader eller för celler som växer under standard 2D-förhållanden. Generellt, individer nya till denna metod kommer att lyckas med transduktion i svåra att konstruera organoider eller andra celler. Vi hade först idén för denna metod när vi stötte på svårigheter att omvandla våra organoider och stamceller.Visuell demonstration av denna metod är kritisk då strukturell förlust av organoiderna kan uppstå om prover inte behandlas på rätt sätt under inbäddningsprocessen i källarmatrisen för kryosektionering. Att odla organoider för viral transduktion, utsäde organoid cellkulturer med 200 mikroliter av transduktion medium per brunn i en 48-brunnsplatta, och inkubera i en standard vävnad kultur inkubator. Töalar av virus för transduktion, vilket möjliggör cirka 50 mikroliter av koncentrerat virus för transduktion av varje brunn i 48-brunnsplattor.I ett 1,5-milliliter rör, blanda viruset med 12 mikroliter av en magnetisk nanopartikellösning, och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Efter 15 minuter, tillsätt den magnetiska nanopartikellösningen och virusblandningen till de celler som ska transduced. Placera 48-brunnsplattan på en magnetisk platta, och inkubera i en vanlig vävnadskulturinkubator i minst två timmar.När viral transfektionen är klar, överför de infekterade organoida cellkluster och transduktionsmedium från varje brunn i en 1,5-milliliter tub. Centrifugera vid 500 gånger g i fem minuter. Kassera supernatanten med mild sug, och kyl av de rör som innehåller pelleten på is i fem minuter.Tillsätt 120 mikroliter av källaren membran matris till varje rör, och återanvänd pelleten genom att långsamt pipettering upp och ner. Frö 30-mikroliter droppar av matris-cell blandningen i en ny 48-brunnsplatta. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i fem till 15 minuter tills matrisen stelnar.Tillsätt transduktionsmedium till varje brunn, och inkubera i en vanlig vävnadskulturinkubator i tre till fyra dagar. Efter tre till fyra dagar, inspektera kulturerna under ett ljus mikroskop vid 10x förstoring för att säkerställa organisationen av cellkluster i organoid strukturer. Byt försiktigt ut transduktionsmediet i varje brunn med 250 mikroliter av organoidodlingEN ENR-medium.Sätt tillbaka plattan till inkubatorn. Börja denna procedur genom att ta bort ENR-mediet genom mild sug, var noga med att inte perturb källaren membran matris. Tvätta försiktigt med 500 mikroliter PBS.Fixera organoiderna genom att lägga till en mikroliter av 4%paraformaldehydlösning per brunn, och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. Efter 30 minuter, ta bort paraformaldehydlösningen genom att suga. Tillsätt försiktigt en mikroliter PBS per brunn, och ta sedan bort PBS genom mild sug.På detta sätt, tvätta två gånger med PBS. Ta bort PBS från den andra tvätten, och tillsätt en mikroliter av 30%sackarosbuffert till varje prov. Inkubera de fasta organoiderna i sackaros i en timme vid fyra grader Celsius för att torka ut proverna.Ta bort sackarosbufferten genom att suga, och tillsätt precis tillräckligt med inbäddningsblandning för att täcka matrisskiktet i varje brunn. Inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Placera därefter proverna i en minus 80-graders Celsius frys i 10 minuter eller tills inbäddningsföreningen blir fast och vit.Placera plattan med frusen inbäddning förening vid rumstemperatur för att möjliggöra minimal smältning av föreningen längs kanterna. Använd en skalpell eller spatel för att separera blocket från brunnens väggar. Arbeta snabbt för att förhindra smältning, med hjälp av tlyn för att avlägsna matrisen inbäddning sammansatta blocket, och placera den i ett preparat block.Fyll formen helt med inbäddning förening. Frys vid minus 80 grader Celsius i 30 minuter innan du använder blocket för snittning. Detta protokoll optimerades genom att först omvandla intestinala organoider med lentiviral vektorer kopplade till GFP.GFP visualiserades i varje steg i organoid utveckling, inklusive tidigt när crypt celler organisera i cysta-liknande strukturer eller vid senare tidpunkter när organoider bildar knoppar. Framgångsrikt transduced intestinala organoider var sedan formalin-fast, cryosectioned och analyseras av immunofluorescens imaging. I den här bilden färgas kärnor i blått, och den gröna indikerar epitelcelladhesionsmolekyler, som avgränsar cellgränser.Den röda anger lysosome färgning för att identifiera Paneth celler. När behärskar, givare organoider kan utföras i ungefär tre timmar, och organoider crysection inbäddning kan göras i ca 2 1/2 timmar. När du försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att arbeta på is vid hantering av källare matris reagenser.Efter att ha slutfört detta förfarande kan immunofluorescerande analys och andra metoder för att upptäcka proteiner eller organeller utföras för att bedöma lokalisering eller relativ förekomst. Denna teknik banar väg för forskare att utforska normal biologi och sjukdomsstater in vitro och även för in vivo-studier om de transduced organoiderna eller cellerna kan implanteras i möss. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man använder magnetiskt märkta virus att genetiskt ingenjör organoider för kryosektionering.Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med virus, och försiktighetsåtgärder som att bära lämplig skyddsutrustning bör alltid utföras när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Frozen Buffy Coats använder icke-integrerande Episomalt plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Bedömning av cardiomyocyte DNA-syntes och ploiditet: En metod för att Assist Kvantifiering av cardiomyocyte Regeneration och omsättning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Använda Primära neurosfärkulturer att studera Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i Ex Vivo Tarmvävnaden och 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Realtid mätning av epiteliala barriären permeabilitet i Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation av Organoids från mus extrahepatiska gallgångarna

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generering av Multicellulära humana primära Endometrieorganoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonala genetiska spårning använda Confetti musen för att studera mineraliserade vävnader

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Recapitulating Suckling till avvänjning övergång in vitro med fetala intestinala Organoider

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...