Name: assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices
Uploaded: 2018-05-09T13:00:00
Duration: 12 min 4 s
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我们要感谢兰 Lauenstein 为她的前期工作, 与其他测试策略的风险评估与人类 PCLS。其中一些研究得到欧洲委员会在 6th框架计划中的一笔赠款的支持, 这是对过敏原的体外评估的新的测试策略。

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作者没有什么可透露的。夫琅的项目是一个独立的公共非营利研究机构的应用研究, 执行合同研究代表生物技术, 制药, 化工, 和化妆品行业。该研究所的经费来自国家和国际公共项目。

人类 PCLS 技术在实验室中得到了很好的确立。本文介绍了该技术及其在肺组织中药物毒性检测中的应用前体。一般情况下, 任何使用此技术的实验室都应寻求建立可量化范围、多变性估计以及保证实验有效性的质量控制的检测相关定义。例如, 可能的标准程序可能是重复每个端点,例如, 细胞毒性试验, 至少有三个生物捐助者 (个体运行), 每个样本至少有三个技术复制, 其中包括阳性和否定引用。应培训实验室人员以提高化验的一致性, 并尽量减少化验的变异性。
经常用于评估物质对肺组织免疫调节作用的端点包括使用不同化验方法的细胞毒性测量 (例如、LDH 测定法、WST-1 法、显微染色法)、细胞因子释放测定以及表达式的变化和细胞群变化的特征通过 immunohistopathological 方法6。此外, 还有一些技术描述细胞的可视化, 如肺树突状细胞, 在小鼠 PCLS28 , 也可以转移到人类 PCLS, 从而可以提供更详细的洞察细胞组成之前和经过治疗后, 假定细胞毒性物质。
这一基本协议和技术, 为人类肺组织切片的准备是可比的技术, 已在出版物中很好地描述29。简而言之, 器官材料是从患有生命威胁的慢性疾病如肺癌的患者获得的, 他们必须接受手术切除或移植。这些研究必须得到当地伦理委员会的批准。需要病人的书面同意。在临床和实验室之间建立工作流是一个关键问题, 需要沟通, 并定义两个站点之间的接口和基础结构。人肺材料必须在切除后直接处理, 以保持组织的生存能力。值得一提的是, 这里描述的人类 PCLS 技术可以应用于年轻和年老的肺部和健康和患病的肺部。例如, 在美国, 有可能从健康器官捐献者那里获得肺部, 他们死于事故或器官被拒绝移植。
该协议的第一个关键步骤是气道的膨胀和周围的实质与琼脂糖溶液。这一步是必要的, 以巩固非常柔软的组织为后续切片过程。基于疾病背景的人肺材料的质量在这里是至关重要的。只有有完整胸膜的裂片才能填满。支气管附近的终末期肿瘤有时会阻止充填过程。在膨化人体材料之前, 必须对琼脂糖溶液的温度进行彻底检查。人体肺组织内过多的血液 (或其他液体、分泌物) 会导致琼脂糖的稀释, 并会影响聚合过程。在肺组织膨胀和琼脂糖凝胶凝固后, 肺被切成200到300µm 厚度的部分。组织的一致性是一个非常关键的问题。如果组织太软, 切片相等的部分是困难的。即使为每个捐献者设置相同的切片参数, 由于每个肺的充气过程中的个别条件和变化, 捐赠者之间的切片厚度也可能有所不同。组织的非均匀充填会导致不同的切片厚度。而不是测量和标准化的切片厚度, 测量总蛋白含量可用于间接监测肺部切片厚度。几种终末期病害阻碍切片过程;例如, 肺动脉高压中血管极度加厚, 纤维化组织可能如此僵硬, 几乎不可能切片组织钢瓶, 切片刀片需要经常更换。
在准备人体 PCLS 和密集洗涤步骤, 这是必要的清除细胞碎片和释放酶, 组织切片可用于实验29。人类 PCLS 在正常细胞培养条件下培养, 例如, 暴露于化学药品、药物或脂多糖。PCLS 由于 (未知) 感染而偶尔受到的污染是人肺材料培养中的一个特殊问题。组织培养显示感染必须丢弃, 设备必须彻底消毒。一方面用于准备的实验室场所和培养的空间分离可能有助于避免交叉感染。对于设备, 切片可能泄漏, 松动的六角螺钉可能导致马达损坏和停止叶片运动。切片机的每一部分都不是用不锈钢制成的, 所以如果不干, 就会氧化, 立即改变清洁。为了克服设备问题, 可能需要至少有一个备份设备。
在以前的出版物中, 据报告琼脂糖在准备后的密集洗涤步骤中被洗掉并除去。事实上, 这是不可能的, 琼脂糖不能被删除。为了完全去除琼脂糖, 它需要在高温下重新熔化, 这将破坏组织。肺泡和呼吸道的琼脂糖不会干扰所描述的端点。其他端点可能会受到琼脂糖存在的影响 (也请参见限制)。需要强调的是, 要准备非常新鲜的组织切片, 因为组织的可行性是文化中的一个关键问题。支气管收缩不是有效的生存参数。我们建议至少使用三种独立的细胞毒性检测来检查周围的软组织是否可行;必须在每个实验30中检查此项。细胞毒性检测的质量控制是组织生存能力不足的指标。因此, 建议评估组织的反应性, 例如, 对一种有效的有毒物质, 例如所有细胞毒性化验中的洗涤剂。基于剂量-反应曲线, 需要定义最小和最大吸收值为细胞毒性化验, 并满足随后的实验。对议定书的进一步修改主要取决于应用的化学品和利益端点。不溶性或高活性化学品的适用性有限。甲基亚砜的最高溶剂浓度限制在1%。更高的浓度可以使用, 但可能导致明显释放的促炎性细胞因子, 如 IL-8。另一方面, 使用的刺激措施可能相对较弱。在这种情况下, 组织的数量可以增加四切片每井。这种方法限制了24小时的生存能力。
人类 PCLS 的一个主要限制是, 在德国, 它们只能从患病的人肺材料中制备。接受手术的病人通常是50岁以上, 80% 的患肺癌的病人是或曾经是吸烟者。药物的病人, 如糖皮质激素, 也可以影响实验结果, 使用人体组织。因此, 重要的是: i) 验证每个实验的积极参考验证的可行性, 功能性和敏感性的个别组织, 第二) 交叉验证结果使用健康, 非病, 中年肺组织从实验动物 (非人类灵长类, 如猕猴, 如有可能, 老鼠, 老鼠, 豚鼠)。病变组织病理评分越好, 实验结果越好。严重患病的组织几乎无法使用, 而且往往显示有限的生存能力, 低或极高的细胞因子水平, 细菌或真菌感染, 少支气管收缩。捐助者对捐助者的变化比实验动物获得的结果更高, 反映了人类个体的变异性。然而, 这不是一般的限制;如上所述, 在其他国家 (例如, 美国) 有可能获得健康肺从已故器官捐赠者拒绝为移植。在急性暴露实验中, 组织的反应性已被很好地描述为第一至48小时。组织的生存能力和功能在许多天的文化或贮藏后减少-80 摄氏度。可以将人类肺组织培养长达14天。在这段时间内继续生存下去;然而, 观察到组织中一些细胞数量的变化, 以及一些体细胞群的功能丧失, 导致细胞因子释放的 mitogens。对某些端点的另一个限制是在组织中存在琼脂糖, 妨碍例如, 分离高质量和足够数量的 RNA31或为随后的流式细胞术制备单细胞悬浮液和细胞的分型。因此, 有可能获得对单细胞反应和功能的机械洞察力是有限的。
脊髓组织模型, 如人类 PCLS, 被认为对基础和非临床研究有很大的影响。人肺材料具有生物学成分, 密切反映正常的器官结构。它包含, 例如, 居住的肺泡和支气管上皮细胞, 平滑肌细胞, 成纤维细胞, 内皮, 神经纤维和巨噬细胞。组织是可行的, 细胞对几种刺激反应。神经纤维, 虽然被切开, 可以局部激活, 导致终端反射反应14。因此, 此前体模型提供了研究细胞先天免疫应答、防御应答、细胞因子信号传递和细胞表面标记诱导的可能性。对端点的技术、培养和验证的一些改进使人类的 PCLS 在平移科学中得以应用。未来方法的例子有: i) 确认人体肺组织中的新靶点 (ii.) 对暴露后的免疫应答进行评估, 例如化学品、药物、纳米微粒、等, iii) 补充免疫细胞的肺组织, 如作为 T 淋巴细胞 iv.) 鉴定和修饰分子模式, 例如, 暴露于呼吸道敏、诱发疾病的物质或抑制通路的活性化合物后;此外, v) 气道重塑和 vi) 神经元调节32。科学领域对这些当前和未来的方法感兴趣与 PCLS。此外, 有各种不同的发展, 将有助于改善 PCLS 技术, 如冷冻保存20和组织伸展33 , 以模拟在呼吸或机械组织的自然运动通风。
与其他3D 模型相比, 人类 PCLS 的主要优势是免疫细胞和神经纤维的存在。实验也可以在老鼠, 老鼠, 和非人类灵长类动物, 这是仍然使用最经常在药理学和毒理学。人肺组织的复杂性支持从动物到人的结果的翻译和从体外到体内。在现有的用于鉴定呼吸道敏的替代化验中, 人类 PCLS 非常复杂, 不允许对单细胞反应进行深入的研究。然而, 显微镜和流式细胞术可能提供有关细胞反应的信息, 如果正确的细胞标记结合使用, 例如, 与凋亡, 坏死, 或细胞内标记。已公布的化验结果已证实, 并报告已用于鉴定呼吸道敏。然而, 使用 PCLS 的进展及其所有的优势超过单细胞化验, 是作出了宝贵的贡献, 在这个意义上, 该技术可以用于高通量筛选, 如沃森et 等. 所述。34他们开发了高通量筛选法来预测小鼠冷冻保存 PCLS 的气道毒性。由于其小型化的96井 PCLS 格式, 他们发现了类似的读数在小鼠灌洗液, 使 PCLS 一个可行的高通量检测。

诸如过敏性哮喘、职业性哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、肺气肿和上、下呼吸道感染等呼吸系统疾病正在上升, 并代表着全球卫生负担1,2。除了开发和测试适当的物质外, 还需要适当的测试系统, 以便查明这些疾病所依据的一些基本机制。基础研究和临床前药物开发侧重于在体外或体内化验中获得的结果。然而, 这些化验有其局限性3。首先,体外检测利用被隔离和从相邻组织或器官中移除的人体细胞, 因而不再能够与其他细胞进行交互或受其他单元的保护3。其次, 由于生理学和生物化学上的差异4, 动物模型往往不能翻译为人类。为了最大限度地减少这些限制, 并在 3Rs (替换、细化、缩减) 原则5的上下文中, 新的替代模型将不断演变。
另一种人类3D 组织模型, 如 PCLS, 是基于人的体外和复杂动物体内模型之间的链接。PCLS 反映的功能异质性与所有相关细胞类型存在于呼吸道6。此外, PCLS 技术有优势, 可重复制备几个薄切片精确厚度从一个动物或人类组织捐赠者。这允许内部控制, 以及不同浓度或药物的测试。
自第一次引进琼脂填充的人肺切片在1994年由费舍尔et 等。7肺组织切片和培养技术已大为改善。基督教马丁et 等。改进了此技术, 用于进一步的化学和药理应用8。我们的小组在2007年被基督徒马丁介绍了这项技术。从那时起, PCLS 在研究中的应用从对功能响应的测试中扩展, 如气道9、10和血管收缩11、免疫学、药理12、13、和毒理学7测试在不同的物种在几个实验室。例如, Schlepütz et 。14研究了不同物种差异的气道反应, 并通过电场刺激 (EFS) 或小鼠、大鼠、豚鼠、绵羊、绒猴和人类的辣椒素来比较周围神经元活化。他们发现不同的物种有不同的神经介导的支气管收缩, 并得出结论, 通常使用的实验动物 (老鼠和老鼠) 并不总是反映人类的反应。为肺毒性试验和减少动物的数量在这种情况下, 赫斯et 等。15预验证的鼠 PCLS 作为吸入毒性研究的前体替代品。这一癌多中心预验证研究导致了两个预测模型的发展, 使用 PCLS, 有希望的结果。
此外, 在基础研究中, PCLS 已被用来阐明钙信号16, 早期过敏反应17, 病毒感染反应18,19。目前正在进行技术进展, 正在探讨进一步的进展。例如, 该领域正在通过冷冻组织的储存和再利用来增加人体组织的益处。Rosner et . 描述了一种冷冻和解冻小鼠 PCLS 的技术, 它保留了气道在刺激时的收缩能力: 因此, 该技术延长了有限的时间窗口, 在其中组织仍然可行, 从而进一步可以将检测时间应用到同一捐助者20。除了这些研究进展之外, Lauenstein et 。21最近调查了各种化学品的风险评估, 这些化学物质可能会成为人类 PCLS 职业性哮喘的潜在敏。
职业性哮喘, 其症状是气流阻塞和气道高反应性, 类似于过敏性哮喘, 是由接触高分子量 (蛋白) 22 或低分子量 (LMW)物质23(如在工作环境中的、铂化合物)。LMW 剂在形成分子半抗原和绑定到载体蛋白时具有很高的敏化电位21。新的高分子量或 LMW 化学物质的注册需要体外和体内风险评估, 关于它们所假定的敏化电位 (e., 经合组织准则 429)24。然而, 用于确定所假定的敏化电位的测试最初不是为呼吸敏的风险评估而设计的, 但对于接触敏来说, 尽管似乎有某种物质的一个小子集的一致性25.Lauenstein et . 的工作是作为欧洲联盟项目的一部分而设计的, 目的是制定可供选择的接触或肺敏21风险评估的替代测试策略。对于这个项目, 我们专注于测试人类 PCLS 的可用性作为一种替代测试工具。因此, 选择了一套免疫调节端点 (例如、生存能力和细胞因子分泌) 来确定化学物质的刺激性或炎症电位, 如 LMW 铂化合物。Lauenstein et . 没有发现可应用于所有呼吸道敏的一般模式;但是, 它们的工作为最近发布的协议26提供了基础。
总之, 在这里提出的准备和随后暴露的人类 PCLS 提供了一个有用的方法来评估潜在的肺毒性和/或免疫调节物质可能参与发展呼吸道疾病, 如职业性哮喘。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1373px;" width="1373">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silicon hose 3.0 x 5.0 mm</td>
			<td style="width:471px;">A. Hartenstein (Leipzig, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">SS04</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Syringe</td>
			<td style="width:471px;">Faust Lab Science (Klettgau, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">9.410 050</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Coring tools</td>
			<td style="width:471px;">custom-made</td>
			<td style="width:317px;">custom-made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blade Handle (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205530001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blades (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205500000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome: Tissue Slicer</td>
			<td style="width:471px;">Alabama R&#38;D (Bad Homburg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">303400-ADPT</td>
			<td style="width:227px;">Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:471px;">Wilkinson Sword (Solingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">ENR-4027800011506</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tissue culture dishes</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z666246-420EA</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell strainer filter (100 &#181;m Nylon)</td>
			<td style="width:471px;">Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">BD352360</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Inoculation loop</td>
			<td style="width:471px;">Copan Diagnostics (Murrieta, USA)</td>
			<td style="width:317px;">&#160;CD176S01</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TPP Tissue culture plates 24wells</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z707791-126EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cassette</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>1000957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MaxiSorp flat-bottom</td>
			<td style="width:471px;">Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MicroWell 96-Well&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">260836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Confocal LSM Meta 510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Image rendering software</td>
			<td style="width:471px;">Bitplane AG (Z&#252;rich, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">IMARIS 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LSM Image Browser</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Multiwell-Reader</td>
			<td style="width:471px;">Tecan Group Ltd. (M&#228;nnedorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;">Tecan infinite F200Pro</td>
			<td style="width:227px;">Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Plate shaker</td>
			<td style="width:471px;">Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">KM-2 Akku</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">BenchMark ULTRA</td>
			<td style="width:471px;">Ventana Medical Systems (Tucson, USA)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Automated IHC/ISH slide staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Assays</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644807001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644793001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:359px;">Microscopical vitality staining&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Invitrogen (Carlsbad, USA)</td>
			<td>L-3224</td>
			<td style="width:227px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ELISA assay kit</td>
			<td style="width:471px;">R &#38; D systems</td>
			<td>various, e.g. DY210 (TNF-&#945;) or DY200 (IL-1&#945;)</td>
			<td style="width:227px;">DuoSet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Reagents</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarose, low gelling temperature&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9414-100G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle&#8217;s Balanced Salts (EBSS)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>E2888-500ML</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td>17-602E</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)</td>
			<td style="width:471px;">Gibco (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>11039-047</td>
			<td style="width:227px;">Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Phosphate with Ca and Mg (DPBS)</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td style="width:317px;">BE17-513F&#160;&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9647-500G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Detergent</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (Saint Louis, USA)</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td style="width:227px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:471px;">Merck (Darmstadt Germany)</td>
			<td>524653</td>
			<td style="width:227px;">&#160;0.05% Tween 20 in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices

呼吸道疾病在其广泛的多样性需要适当的模型系统, 以了解的基础机制, 并使新疗法的发展。此外, 新物质的登记需要适当的风险评估和适当的测试系统, 以避免个人受到伤害的风险, 例如在工作环境中。这种风险评估通常是在动物研究中进行的。鉴于3Rs 原则和公众对动物实验的怀疑, 人类的替代方法, 如精密切割肺切片 (PCLS) 已经在进化。本文介绍了人体 PCLS 的体外技术, 研究了 hexachloroplatinate 铵 (HClPt) 等低分子量物质的免疫调节电位. 测量终点包括生存能力和局部呼吸道炎症, 其特征是细胞因子和趋化因子的分泌改变。在暴露于 HClPt 亚毒性浓度后, 人 PCLS 的促炎细胞因子、肿瘤坏死因子α (TNF α) 和白细胞介素1α (IL-1α) 显著增加。尽管 PCLS 技术在过去几十年里已经得到了极大的优化, 但它对免疫测试的适用性仍在发展之中。因此, 在这里提出的结果是初步的, 尽管它们显示了人类 PCLS 作为呼吸研究的宝贵工具的潜力。

利用目前的研究方法, 制备了人体 PCLS, 并暴露在五种工业物质浓度下, 对人肺材料的化学诱导免疫调节作用进行了评估。肺组织暴露在水淹条件下, 为24小时的永久性培养, 通过测定乳酸脱氢酶、线粒体活性和显微活性染色来评估其毒性。此外, 测定了规范化和促炎性细胞因子的总蛋白含量。只要可能, 用非线性 sigmoidal 曲线拟合计算抑制浓度 (IC) 75 值。阳性参考物质, 细胞毒性的洗涤剂和 LPS 的先天细胞因子反应, 用于验证每一个运行。对数转化的 IC75 [µM] 值 (日志 IC50) 被用作 "刺激性" 浓度的后续细胞因子释放测量。
图 1和图 2显示了填充人体肺材料的过程和人体 PCLS 的模范 H & E 染色。必须遵循例行的卫生程序, 以避免对健康的不利影响, 确保处理人肺材料的工作人员的安全。该技术需要人员培训和实践。有经验的病理学家区分不同的区域 (上部/下部裂片和胸膜下对更中央) 和患病的与健康的区域是需要评估人肺材料的病理状态。所生成的人体 PCLS 应用于制备 H & E 染色薄切片, 可由病理学家重新评估。该程序帮助用户获得的做法, 以辨别不同的疾病地区和地点在肺部。
图 3显示了 PCLS 在使用 SLS 孵化24小时后, 人体内乳酸脱氢酶和 WST-1 活性的测量结果。不加 sls 的未经治疗的培养基控制, 显示在0µg/毫升 sls, 是一个重要的质量控制。与洗涤剂-裂解组织和 > 0.7 WST-1 测定的吸光度单位相比, LDH 的值应低于20%。这些质量控制也作为组织生存能力不足的指标。人体组织对洗涤剂溶液的反应, 作为一种有效的有毒物质, 必须包括在积极的控制中。与未经处理的组织和价值 < 0.1 吸光度单位相比, 乳酸脱氢酶 300-500% (> 2.0 吸光度单位) 的增加, WST-1 化验。SLS 导致了剂量依赖性降低细胞的生存能力, 通过增加乳酸脱氢酶和减少代谢活动的 WST-1 化验在浓度 > 87 µg/毫升。对数据进行了乙状结肠浓度响应模型的拟合, 从而可以计算 IC75 或 IC50 值。这些值随后可用于选择细胞因子和趋化因子水平的浓度: 在剧毒浓度, 通常没有或只减少细胞因子和趋化因子可以检测。因此, 建议使用无毒或仅轻微毒性浓度 (IC75)。必须指出的是, 在细胞培养上清液中 LDH 活性的预期增加通常受应用物质21的影响。频繁地, 干扰发生在物质和酵素活动之间, 如果 LDH 化验是使用的唯一的细胞毒性试验, 导致对结果的误解。因此, 进行几种细胞毒性检测, 获得可靠有效的结果是非常重要和必要的。此外, 应该提到, 乳酸脱氢酶和 WST-1 测定的敏感性是高度可比的。
在图 4中, PCLS 的显微生存性图像表明人体组织对洗涤剂的反应是一种有效的有毒物质。这些结果对于确认其他生存能力数据非常有用, 但这需要额外的设备。通过对 calcein 阳性组织与 EthD-1-positive 细胞核的评价, 可以直观地评估毒性效应。在实质中随机选择的片段通常导致可比数据, 而气管或血管应避免, 因为较大的腔可能会改变结果。根据我们的经验和上面描述的显微设置, 测量了控制组织的 1.5 x 106和 5 x 10 6 µm 3之间的平均音量。其价值取决于肺材料质量、PCLS 质量以及肺组织捐献者的疾病。尽管人肺组织的生存能力在捐献者中有所不同, 但与活组织相比, 死细胞核的数量不应超过组织控制的15%。然而, 如果死细胞核主要存在于组织控制中, 则应放弃实验。
图 5显示了 HClPt 和 SLS 对人肺组织免疫调节作用的代表性数据。促炎性细胞因子 IL-1α和 TNF α是炎症的标志物, 表明在接触刺激物质后炎症过程的开始。用 ELISA 法测定两种细胞因子。细胞外 IL-1α通常是低的人 PCLS, 而胞内 IL-1α达到 1000 pg/毫升和以上水平。细胞内 IL-1α的减少表明正在进行的细胞毒性过程, 而且大部分是在人类 PCLS 接触到化学物质之后观察到的。如果组织的刺激与 LPS, 一个活化剂的先天免疫系统, 并作为这样的积极治疗控制, 那么大多数诱导 IL-1α只能检测 intracellularly 后24小时。与此相反, LPS 刺激诱发的 TNF α分泌物主要可以测量 extracellularly。使用适当的积极控制, 如 LPS, 证明了方法的有效性。利用目前的研究方法, 人类 PCLS 暴露在三浓度的 HClPt (32, 64, 125 µg/毫升) 或两个浓度的 SLS (1 和10µg/毫升) 为 24 h. 细胞因子分泌被确定为细胞外和细胞因子的总和按照图 5中的描述对总蛋白质浓度进行规范化。在这里值得一提的是, 在蛋白质含量测定中一般都采用了综合体分析法, 但也反映了物质诱导的细胞毒性。因此, 在剧毒浓度下, 总蛋白含量不能用于细胞因子数据的规范化。IL-1α分泌量显著增加, 从 263 38 pg/毫克到 887 @ 216 pg/毫克和 TNF α从 263 @ 38 pg/毫克到 1160 @ 286 pg/毫克 (图 5A, B)。此外, 与静态组织控制相比, LPS 诱导的 IL-1α和 TNF α分泌物。由病原体相关的分子模式诱导炎症细胞因子, 如 LPS, 证明了方法的有效性, 并强烈建议使用时, 与人类 PCLS 研究免疫调节作用。有关 HClPt 和 SLS 数据的详细信息, 请参阅 Lauenstein et的研究。21
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig1.jpg"> 图 1: 填充人肺材料的过程.人肺在切除后立即准备好。肺应贮存在室温下, 以保持琼脂糖的一致充填, 避免在灌装过程中出现突然的琼脂糖聚合。肺位于水平位置, 裂片在主支气管或支气管 (A & B用于支气管特写) 上展开, 以获得最佳视图。支气管是空心的灵活的硅胶管和固定钳 (C)。在充填过程和琼脂糖聚合组织后, 训练有素的病理学家将肺部切成 3-5 厘米厚度的切片 (D)。从这些切片圆柱形的组织核心 (Ø例如, 8 毫米) 是用取心工具 (e) 准备的。这些组织核心被切开与组织切片器入 PCLS, 立刻被转移入培养基填充培养皿为孵化在正常细胞培养情况下 (E)。在几个洗涤的步以后 PCLS 转移入细胞培养板材 (例如, 24 井板材以二 PCLS 每井和500µL 媒介) 去除残余的细胞残骸和释放的细胞调解人 (F)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig2.jpg"> 图 2: 用 H & E 染色法测定人体 PCLS 的健康状况.该图像中的 PCLS 是由一个由肺肿瘤的捐献者准备的, 它显示了完整的肺组织, 有肺泡实质, 周围气道 (**) 和血管 (箭头) 在概述 (a)。在更高的放大率, 传导呼吸道与完整的纤毛呼吸上皮 (箭头) (B), 一个完整的肺泡结构内衬有活力的 pneumocytes, 包括毛细血管与许多红细胞 (箭头) (C),肺泡腔内含有肺泡巨噬细胞 (CD68 免疫组化) (D), 以及具有完整内皮 (CD31 免疫组化) (E) 的血管可以观察到。只有无肿瘤组织被用于 PCLS, 这就是为什么没有宏观病变区域是可见的。与其他肺部疾病 (如肺气肿或纤维化) PCLS 准备的不同, 肺泡结构没有中断, PCLS 只在外侧有轻微的磨损, 很可能是由于准备步骤。缩放条形图分别指示1000µm (A) 和50µm (BE)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig3.jpg"> 图 3: 测定 PCLS 中 SLS 的细胞毒性, 并以酶乳酸激酶的渗漏为培养基 (A), 并以染料 WST-1 (B) 评定代谢酶活性的损失.人类 PCLS 暴露在增加的 SLS 浓度。一个乙状结肠浓度反应模型随后被安装到数据, 因此 IC75 或 IC50 价值 (抑制浓度在25% 和50% 减少细胞生存能力) 可以被计算 (正确的数字)。数据显示为平均值, 即扫描电镜, n = 3-5。乳酸脱氢酶测定的吸光度测定为 492 nm (参考 630 nm) 和 WST-1 化验 450 nm (参考在 630 nm)。数据已从 Lauenstein et . 中进行了调整和修改。21<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig4.jpg"> 图 4: 三维显微染色和人 PCLS 图像渲染的代表性图像.活体组织控制和组织对洗涤剂的反应, 作为一种有效的有毒物质, 显示后, 人 PCLS 与 calcein AM (黄色) 和 EthD-1 (红色) 染色。使用10X 目标 (a) 和呈现 (B) 的30µm 堆栈。刻度条指示100µm. 励磁波长488毫微米和543毫微米, 发射过滤器 BP 505-550 毫微米和 LP 560 毫微米。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig5.jpg"> 图 5: hexachloroplatinate 铵 (HClPt) 诱导的 IL-1α和 TNF-α分泌在人类 PCLS 后24小时暴露.PCLS 暴露在三浓度 (32 µg/毫升, 64 µg/毫升, 125 µg/毫升) HClPt 和两种不同浓度 (1 µg/毫升和10µg/毫升) 的 SLS。细胞外和胞内 IL-1α (A) 和 TNF α (B) 由 ELISA 和规范化的总蛋白含量决定。为了表明该方法的有效性, 本发明的阳性活化剂为细胞内 IL-1α (a) 和胞外 TNF α (B) 释放的一个参考, 对总蛋白含量进行规范化。数据显示为平均值, * SEM, *p < 0.05 和 ***p < 0.001;HClPt 和 SLS: n = 9, IL-1αlps: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 在技术重复 (曼-惠特尼测试)。此数字已从 Lauenstein et . 中进行了修改。21<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig1.jpg"> 补充图 1: 使用渲染软件对显微生存能力染色图像进行详细的计算处理.为 calcein 染色的可行组织 (A-G, I) 和斑点检测溴 homodimer 染色细胞核 (H,) 进行图像分析的分步操作过程J-M)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig2.jpg"> 补充图 2: 人体肺组织显微生存能力染色的计算图像分析概述.可存活组织 (黄色) 通过表面渲染 (BI) 和检测到死细胞核 (红色) 进行了现场检测 (J-P)。快照模式用于导出图像 (Q)。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

鉴于3Rs 原则, 呼吸道模型作为动物研究的替代品正在演变。特别是对于呼吸物质的风险评估, 缺乏适当的化验方法。在这里, 我们描述了使用人的精密切割肺切片评估机载物质。

人精切肺切片中物质的细胞毒性及免疫调节作用的评价

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

确定最佳人力Her2neu特异性CD8 + T细胞的细胞毒活性的比较CR51发行含量xCELLigence系统

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

科研

免疫与感染

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

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人骨髓间充质干细胞（干细胞）的免疫调节性能评估

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Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

巨噬细胞集落刺激因子分化的人单核细胞衍生的巨噬细胞的培养

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Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

粒子结合Bet v 1的变应原PM10的流式细胞分析

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

可视化痰生物膜发展影响使用腔室盖玻片型号

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

T淋巴细胞有丝分裂原诱导芽生的快速定量辨识免疫调节药物

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

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对于检测磁力搅拌器方法<em&gt;旋毛虫</em&gt;幼虫肌肉样品

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

精密切割的小鼠肺切片可视化现场肺树突状细胞

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

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铜绿假单胞菌感染肺内皮细胞后细胞毒性 Amyloids 的检测方法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

立体定向移植人胶质瘤多形性移植小鼠细胞毒性免疫细胞模型的研究

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...