Name: assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices
Uploaded: 2018-05-09T13:00:00
Duration: 12 min 4 s
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Nous tenons à remercier Lan Lauenstein pour son travail préliminaire au sujet des stratégies alternatives de tests d’évaluation des risques avec PCLS humaine. Certains aspects de la recherche a été financée par une subvention de la Commission européenne dans le programme de cadre 6ème SENS-IT-IV « Roman Testing and Strategies for In Vitro Assessment d’allergènes ».

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La technique PCLS humaine est bien établie dans notre laboratoire. Le présent document donne une description de cette technique et son utilisation pour l’évaluation toxicologique des substances dans les tissus pulmonaires ex vivo. En général, n’importe quel laboratoire à l’aide de que cette technique devrait s’efforcer de mettre en place un test associés définition des gammes quantifiables, estimation des variabilités et des contrôles de qualité garantissant la validité de l’expérience. Procédures standards possibles pourraient être, par exemple, de répéter à chaque point de terminaison, par exemple, le test de cytotoxicité, en un minimum de trois donateurs biologiques (exécutions individuelles) avec un minimum de deux ou trois répétitions techniques par échantillon y compris positive et références négatives. Personnel de laboratoire doit être formé pour améliorer la cohérence de l’analyse et de réduire la variabilité du dosage.
Paramètres fréquemment utilisés pour évaluer les effets immunomodulateurs des substances sur les tissus pulmonaires comprennent la cytotoxicité des mesures à l’aide de différentes épreuves (p. ex., dosage LDH, WST-1 test, test de coloration microscopique), analyses de cytokines, ainsi que changements dans le profil d’expression et la caractérisation de l’évolution des populations cellulaires par immunohistopathological méthodes6. En outre, il y a des techniques décrivant la visualisation des cellules, comme les cellules dendritiques pulmonaires, murin PCLS28 qui peuvent aussi être transférées à PCLS humain et pourrait ainsi fournir un aperçu plus détaillé de la composition cellulaire avant et après le traitement avec des substances cytotoxiques putatifs.
Ce protocole de base et la technique pour la préparation des coupes de tissus pulmonaires humains est comparable aux techniques qui ont été bien décrits dans les publications29. En bref, le matériel organique est obtenu chez des patients souffrant de maladies chroniques vivent en danger telles que le cancer du poumon, qui doivent subir une intervention chirurgicale de résection ou de la transplantation. Les études doivent être approuvés par le Comité d’éthique local. Consentement écrit éclairé des patients est nécessaire. Mise en place d’un flux de travail clinique et le laboratoire est une question essentielle et requiert la communication et la définition des interfaces et des infrastructures entre les deux sites. Poumon humain matériel doit être traitée directement après résection de préserver la viabilité des tissus. Il est à noter que la technique décrite ici pour PCLS humaine peut être appliquée aux jeunes et moins jeunes poumons et à poumons sains et malades. Aux États-Unis, par exemple, il est possible d’obtenir des poumons de donneurs d’organes sains qui sont morts dans des accidents ou dont les organes ont été rejetés à la transplantation.
La première étape critique dans le protocole est l’inflation des voies respiratoires et parenchyme environnant avec une solution d’agarose. Cette étape est nécessaire pour consolider le tissu très doux pour la suite de la procédure tranchage. La qualité du matériau du poumon humain, basé sur le fond de la maladie, est ici essentielle. Seulement les lobes avec plèvre intacts peuvent être remplis. Les tumeurs de stade près de la bronche empêchent parfois le processus de remplissage. Avant de gonfler le matériel humain, la température de la solution d’agarose doit être soigneusement vérifié. Trop de sang (ou autres fluides, exsudats) à l’intérieur de l’homme tissu pulmonaire se traduira par une dilution intempestif d’agarose et influera sur le procédé de polymérisation. Après inflation du tissu pulmonaire et gélifiants d’agarose sur glace, les poumons sont découpées en sections de 200 à 300 µm d’épaisseur. La cohérence du tissu est un problème très sérieux. Si le tissu est trop mou, il est difficile de trancher de sections égales. Même si le microtome même paramètres sont définis pour chaque donneur, l’épaisseur des tranches entre bailleurs de fonds peut-être varier, les due à des conditions et les changements pendant le gonflage du processus pour chaque poumon. Remplissage non homogène du tissu se traduira par tranche de différentes épaisseurs. Au lieu de mesurer et de normaliser l’épaisseur des tranches, mesure de la teneur totale en protéines peut être utilisé pour surveiller indirectement les épaisseurs de tranches de poumon. Plusieurs maladies terminale d’entraver le processus de découpage en tranches ; par exemple, le sang navires sont très épaissies dans l’hypertension pulmonaire et de tissu fibreux peut être si raide que découper des cylindres de tissu n’est guère possible, et la lame microtome doit être remplacé très souvent.
Après la préparation des humains PCLS et intensifs, étapes de lavage, qui sont nécessaires pour éliminer les débris cellulaires et libéré des enzymes, tissu sections peuvent être utilisées pour des expériences29. PCLS humaines sont cultivées dans des conditions de culture cellulaire normale et exposés, par exemple, aux produits chimiques, médicaments ou lipopolysaccharides. La contamination occasionnelle des PCLS due à des infections (inconnues) est un numéro spécial dans la culture du matériel de poumon humain. Les cultures de tissus présentant des infections doit être abandonnées et l’équipement doit être soigneusement désinfecté. Séparation spatiale entre lieux de laboratoire utilisés pour la préparation d’une part et la mise en culture en revanche peut aider à éviter les infections croisées. En ce qui concerne l’équipement, le microtome peut fuir, et vis à six pans lâches peuvent conduire à endommager le moteur et l’arrêt du mouvement de la lame. Pas toutes les parties de la trancheuse sont faite d’acier inoxydable, et donc il va s’oxyder si ne pas séché modifier immédiatement le nettoyage. Pour surmonter les problèmes de matériel, il peut être nécessaire d’avoir au moins une unité de sauvegarde.
Dans des publications antérieures, agarose a été signalé à être rincés et enlevé au cours intensifs étapes de lavage après confection. En fait, ce n’est pas possible, l’agarose ne peuvent pas être supprimé. Vue de l’élimination complète de l’agarose, il doit être re-fondu à haute température, ce qui détruirait le tissu. L’agarose dans les alvéoles et airways n’interfère pas avec les points de terminaison décrits. Autres points de terminaison peuvent être influencées par la présence d’agarose (voir aussi les limites). La nécessité de préparer des coupes de tissus très frais doit souligner que la viabilité des tissus est une question essentielle dans la culture. Bronchoconstriction n’est pas un paramètre valide pour la viabilité. Nous recommandons d’utiliser au moins deux ou trois analyses de cytotoxicité indépendants pour vérifier la viabilité du parenchyme environnant ; Cela doit être vérifié à chaque expérience30. Contrôles de la qualité dans les analyses de cytotoxicité servir d’indicateurs de viabilité des tissus insuffisant. Par conséquent, il est recommandé d’évaluer la souplesse des tissus, par exemple, la substance toxique efficace comme un détergent dans toutes les analyses de cytotoxicité. Basées sur les courbes dose-réponse, les valeurs minimale et maximale d’absorption doivent être définis pour les analyses de cytotoxicité et rencontré des expériences subséquentes. Autres modifications au protocole dépendent principalement de produits chimiques appliqués et les points de terminaison d’intérêt. L’applicabilité des produits insolubles ou très réactifs chimiques est limitée. La plus forte concentration de solvant pour DMSO est limitée à 1 %. Des concentrations plus élevées peuvent être utilisées mais pouvant entraîner un rejet prononcé des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-8. En revanche, le stimulus utilisé peut être relativement faible. Dans ce cas, la quantité de tissu peut être augmentée de deux à quatre tranches / puits. Cette approche limite la viabilité à 24h.
Une limitation majeure de PCLS humaine, c’est qu’en Allemagne ils peuvent seulement être préparés de matériel du poumon humain malade. Les patients qui subissent une chirurgie sont normalement plus de 50 ans et 80 % des patients atteints de cancer du poumon sont ou l’habitude d’être des fumeurs. Médicaments des patients, comme les glucocorticoïdes, peuvent également influencer l’issue des expériences utilisant des tissus humains. Par conséquent, il est essentiel de : i) valider chaque expérience de références positives, vérifier la viabilité, la fonctionnalité et la sensibilité du tissu individuel et ii) Croix-valider les résultats à l’aide du tissu pulmonaire sain, non malades, âge moyen de animaux de laboratoire (des primates comme les macaques et, si possible, souris, rat, cochon d’Inde). Le mieux le score de pathologie des tissus malades, plus les résultats expérimentaux. Tissu fortement malade difficilement utilisable et montre très souvent limité la viabilité, des niveaux de cytokine insuffisamment basse ou très élevée, des infections bactériennes ou fongiques et moins bronchoconstriction. Donateurs-à-donneur variation est plus élevés comparée aux résultats obtenus provenant d’animaux de laboratoire, reflétant la variabilité individuelle de l’homme. Il s’agit, cependant, pas une limitation en général ; comme mentionné ci-dessus, dans d’autres pays (par exemple, aux États-Unis), qu'il est possible d’obtenir des poumons en santé de donneurs d’organes décédée a rejeté à la transplantation. La réactivité du tissu a été bien décrit pour la première jusqu'à 48 h dans les expériences d’exposition aiguë. Viabilité et la fonctionnalité du tissu est réduite après plusieurs jours de culture ou après stockage à-80 ° C. Il est possible de tissu de poumon humain de la culture pour jusqu'à environ 14 jours. La viabilité continue pendant cette période ; Toutefois, une augmentation de la variabilité, mais aussi une perte de fonctionnalité de plusieurs populations de cellules, tels que les macrophages dans les tissus est observée, aboutissant à la libération de cytokines limitée en réponse aux mitogènes. Une autre limite pour certains critères d’évaluation est la présence d’agarose dans le tissu, entraver, par exemple, l’isolement des montants suffisants et de qualité de RNA31 ou la préparation des suspensions de cellules individuelles pour cytométrie ultérieures et phénotypage des cellules. La possibilité d’éclairer mécaniste dans réponses unicellulaire et la fonctionnalité est donc limitée.
Organotypique tissu modèles, tels que PCLS humaine, sont considérés comme avoir un fort impact sur la recherche fondamentale et non cliniques. Poumon humain matériel a une composition biologique qui reflète fidèlement l’architecture de l’organe normal. Il contient, par exemple, des cellules épithéliales alvéolaires et bronchiques résidentiels, cellules musculaires lisses, fibroblastes, cellules endothéliales, des fibres nerveuses et les macrophages. Le tissu est viable et cellules répondent à plusieurs stimuli. Nerveuses des fibres, bien coupé, peut être activée localement, conduisant à des réponses réflexes borne14. Par conséquent, ce modèle ex vivo offre la possibilité d’étudier cellulaire les réponses immunitaires innées, réactions de défense, cytokine signalisation et induction de marqueurs de surface cellulaire. Plusieurs améliorations dans la technique, mise en culture et validation des points de terminaison de permettent l’utilisation de PCLS humain dans la science translationnelle. Exemples d’approches futures sont : i) validation de nouveau cible dans les tissus pulmonaires humains, ii) évaluation de la réponse immunitaire après l’exposition, par exemple, aux produits chimiques, médicaments, nanoparticules, etc., iii) supplémentation du tissu pulmonaire avec des cellules immunitaires, telle comme les lymphocytes T, iv) identification et modification des profils moléculaires, par exemple, après une exposition à des sensibilisants respiratoires, substances inductrices de la maladie ou actifs composés inhibant les voies ; en outre, v) remodelage des voies aériennes et vi) Règlement neuronale32. Le domaine scientifique s’intéresse à ces approches actuelles et futures avec PCLS. En outre, il existe une variété de différents développements qui contribueront à améliorer la technique PCLS, tels que la cryo-préservation20et tissus qui s’étend de33 qui imite le mouvement naturel des tissus au cours de la respiration ou mécanique ventilation.
L’avantage majeur de PCLS humaine par rapport aux autres modèles 3D est la présence de cellules immunitaires et des fibres nerveuses. Expériences peuvent également être effectuées en souris, rat et les primates non humains, qui sont les espèces animales qui sont encore plus souvent utilisés en pharmacologie et en toxicologie. La complexité du tissu pulmonaire humaine prend en charge la traduction des résultats d’un animal à l’homme et de l' in vitro à in vivo. Dans le cadre des essais alternatifs existants pour l’identification des sensibilisants respiratoires, PCLS humaines sont très complexes et ne permettent pas d’aperçus de réponses de cellule unique. Encore, microscopie et écoulement cytometry pourrait donner des informations sur les réponses cellulaires, si le marqueur droite cellulaire est utilisé en combinaison, par exemple, avec les marqueurs intracellulaires, nécrose ou apoptose. Il y a des essais publiés qui ont été validés et déclarés avoir été utilisé pour l’identification des sensibilisants respiratoires. Toutefois, les progrès dans l’utilisation de la CIP avec tous leurs avantages par rapport aux analyses unicellulaires font une contribution précieuse en ce sens que la technique peut être utilisée pour le criblage à haut débit, telle que décrite par Watson et al. 34 , ils ont développé un test de criblage à haut débit pour prédire la toxicité des voies respiratoires chez les murins PCLS cryoconservés. Avec leur format PCLS 96 puits miniaturisé, on détecte lectures similaires dans le liquide de lavage murine, rendant PCLS un test haut débit possible.

Maladies respiratoires comme l’asthme allergique, asthme professionnel, maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), l’emphysème et les infections des voies respiratoires supérieures et inférieures sont en augmentation et représentent une santé dans le monde entier fardeau1,2. Systèmes de test appropriée sont nécessaires, afin d’identifier certains des mécanismes fondamentaux qui sous-tendent ces maladies, en plus de la mise au point et l’essai des substances appropriées. La recherche fondamentale ainsi que le développement préclinique de drogue se concentrent sur les résultats obtenus lors d’essais in vitro ou in vivo . Ces tests, cependant, ont leurs limites3. Tout d’abord, in vitro tests utilisent des cellules humaines qui ont été isolés et retirés des organes ou des tissus adjacents et ne sont donc plus en mesure d’interagir avec ou être protégés par d’autres cellules3. Deuxièmement, les modèles animaux ne sont souvent pas traduisibles pour l’être humain en raison des différences dans la physiologie et les divergences biochimiques4. Afin de minimiser ces limites et dans le contexte des 3R (remplacement, réduction, raffinement) principe5, nouveaux modèles alternatifs sont en constante évolution.
Modèles alternatifs de tissus humains 3D, tels que PCLS, constituent un lien entre humains in vitro et complexe animales in vivo modèles. PCLS refléter l’hétérogénéité fonctionnelle avec tous les types de cellules pertinents présents dans les voies respiratoires6. En outre, la technique PCLS a l’avantage de préparation reproductible de plusieurs fines tranches d’épaisseur précise provenant d’un donneur unique tissu animal ou humain. Cela permet un contrôle interne, ainsi que des concentrations différentes ou pour tester des médicaments.
Depuis la première introduction de tranches de poumon humain rempli d’agar en 1994 par Fisher et al. 7 la technique de tranchage et mise en culture des tissus pulmonaires a été considérablement amélioré. Christian Martin et al. ont amélioré cette technique pour davantage les applications chimiques et pharmacologiques8. Notre groupe a été présenté à cette technique par Christian Martin en 2007. Depuis lors, la demande de CIP en recherche a élargi des essais de réponses fonctionnelles, telles que des voies9,10 et la vasoconstriction11, à immunologiques, pharmacologiques12,13, et toxicologiques7 essais chez diverses espèces dans plusieurs laboratoires. Par exemple, Schlepütz et al. 14 a étudié les réactions des voies respiratoires pour les différences entre les espèces et comparé activation du neurone périphérique par une stimulation électrique (EFS) ou par la capsaïcine chez les souris, rats, cochons, moutons, ouistitis et l’homme. Ils ont trouvé les diverses espèces d’avoir des motifs distincts mais différentes de la bronchoconstriction induite par le nerf et a conclu que les animaux de laboratoire couramment utilisés (souris et rats) ne reflètent pas toujours la réponse de l’homme. Pour les essais de toxicité pulmonaire et de réduire le nombre d’animaux dans ce contexte, Hess et al. 15 prévalidées rat PCLS comme alternative ex vivo pour les études de toxicité par inhalation. Cette étude multicentrique de pré-validation a abouti dans le développement des deux modèles de prédiction à l’aide de PCLS avec des résultats prometteurs.
En outre, dans la recherche fondamentale, PCLS ont été utilisés pour élucider le calcium signalisation16, premières réactions allergiques17et infection virale réponses18,19. Progrès technique sont en cours et nouvelles avancées sont explorées. Par exemple, le champ augmente l’avantage du tissu humain par le stockage et la réutilisation des tissus congelés. Rosner et coll. décrit une technique de gel et dégel PCLS murin qui préserve la capacité des voies respiratoires se contracter lors de la stimulation : par conséquent, la technique prolonge la fenêtre de temps limité, dans lequel les tissus restent viables et donc plus des essais peuvent être appliqués au fil du temps au même donneur20. En plus de ces avancées de la recherche, Lauenstein et al. 21 a récemment étudié évaluation des risques de divers produits chimiques qui pourraient agir comme des sensibilisateurs potentiels pour l’asthme professionnel dans PCLS humaine.
L’asthme professionnel, dont les symptômes sont l’obstruction de la circulation de l’air et l’hyperréactivité des voies aériennes, semblables à l’asthme allergique, est induite par une exposition à haut poids moléculaire (HMW)22 ou de faible poids moléculaire (HBPM) substances23 (par exemple , composés de platine) dans le milieu de travail. LMW agents ont une potentiel élevé de sensibilisation lors de la formation des haptènes et lient au transporteur protéines21. Inscription de nouvelles substances chimiques HMW ou LMW nécessite l’évaluation de risque in vitro et in vivo au sujet de leur potentiel de sensibilisation putatif (e.g., 429 lignes directrices de l’OCDE)24. Les tests utilisés pour déterminer la potentiel, de sensibilisation putative cependant, initialement ne visaient pas d’évaluation des risques des sensibilisants respiratoires, mais sensibilisateurs contact, bien qu’il ne semblait pas certaine congruence pour un petit sous-ensemble des substances25 . Le travail de Lauenstein et coll. a été conçu dans le cadre du projet européen Sens-it-iv, à élaborer des stratégies d’expérimentation alternatives pour l’évaluation des risques de contact putatif ou poumon sensibilisants21. Pour ce projet, nous nous sommes concentrés sur le test de l’utilisabilité des PCLS humain comme un outil de test alternatif. Par conséquent, un ensemble de points de terminaison immunomodulateurs (sécrétionpar exemple, la viabilité et cytokines) a été choisi afin de déterminer le potentiel irritant ou inflammatoire des produits chimiques, tels que les composés LMW platine. Lauenstein al ne trouvé aucune tendance générale qui pourrait s’appliquer à tous les sensibilisants respiratoires ; Cependant, leur travail fourni la Fondation pour les protocoles publiés récemment26.
En résumé, le protocole présenté ici pour la préparation et l’exposition subséquente de PCLS humaine fournit une méthode utile pour l’évaluation du poumon toxiques et/ou substances immunomodulatrices qui pourraient être impliqués dans le développement des voies respiratoires maladies comme l’asthme professionnel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1373px;" width="1373">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silicon hose 3.0 x 5.0 mm</td>
			<td style="width:471px;">A. Hartenstein (Leipzig, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">SS04</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Syringe</td>
			<td style="width:471px;">Faust Lab Science (Klettgau, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">9.410 050</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Coring tools</td>
			<td style="width:471px;">custom-made</td>
			<td style="width:317px;">custom-made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blade Handle (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205530001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blades (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205500000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome: Tissue Slicer</td>
			<td style="width:471px;">Alabama R&#38;D (Bad Homburg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">303400-ADPT</td>
			<td style="width:227px;">Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:471px;">Wilkinson Sword (Solingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">ENR-4027800011506</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tissue culture dishes</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z666246-420EA</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell strainer filter (100 &#181;m Nylon)</td>
			<td style="width:471px;">Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">BD352360</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Inoculation loop</td>
			<td style="width:471px;">Copan Diagnostics (Murrieta, USA)</td>
			<td style="width:317px;">&#160;CD176S01</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TPP Tissue culture plates 24wells</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z707791-126EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cassette</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>1000957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MaxiSorp flat-bottom</td>
			<td style="width:471px;">Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MicroWell 96-Well&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">260836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Confocal LSM Meta 510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Image rendering software</td>
			<td style="width:471px;">Bitplane AG (Z&#252;rich, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">IMARIS 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LSM Image Browser</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Multiwell-Reader</td>
			<td style="width:471px;">Tecan Group Ltd. (M&#228;nnedorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;">Tecan infinite F200Pro</td>
			<td style="width:227px;">Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Plate shaker</td>
			<td style="width:471px;">Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">KM-2 Akku</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">BenchMark ULTRA</td>
			<td style="width:471px;">Ventana Medical Systems (Tucson, USA)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Automated IHC/ISH slide staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Assays</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644807001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644793001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:359px;">Microscopical vitality staining&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Invitrogen (Carlsbad, USA)</td>
			<td>L-3224</td>
			<td style="width:227px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ELISA assay kit</td>
			<td style="width:471px;">R &#38; D systems</td>
			<td>various, e.g. DY210 (TNF-&#945;) or DY200 (IL-1&#945;)</td>
			<td style="width:227px;">DuoSet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Reagents</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarose, low gelling temperature&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9414-100G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle&#8217;s Balanced Salts (EBSS)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>E2888-500ML</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td>17-602E</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)</td>
			<td style="width:471px;">Gibco (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>11039-047</td>
			<td style="width:227px;">Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Phosphate with Ca and Mg (DPBS)</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td style="width:317px;">BE17-513F&#160;&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9647-500G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Detergent</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (Saint Louis, USA)</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td style="width:227px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:471px;">Merck (Darmstadt Germany)</td>
			<td>524653</td>
			<td style="width:227px;">&#160;0.05% Tween 20 in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices

Maladies respiratoires dans leur vaste diversité besoin de systèmes de modèle approprié pour comprendre les mécanismes sous-jacents et permettre le développement de nouvelles thérapeutiques. De plus, l’inscription de nouvelles substances exige évaluation appropriée des risques avec des systèmes de tests adéquats pour éviter le risque d’individus mis à mal, par exemple, dans le milieu de travail. Ces évaluations des risques sont habituellement menées chez l’animal. Étant donné le principe des 3R et le scepticisme public contre l’expérimentation animale, humaines autres méthodes, comme des tranches de coupe de précision du poumon (CIP), ont aussi évolué. Le présent document décrit la technique ex vivo de PCLS humaine pour étudier le potentiel immunomodulateur des substances de faible poids moléculaire, comme diammonium d’ammonium (HClPt). Paramètres mesurés comprennent viabilité et une inflammation locale respiratoire, marquée par la sécrétion altérée de cytokines et de chimiokines. Cytokines pro-inflammatoires, facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), et alpha de l’interleukine 1 (IL-1α) ont augmenté de PCLS humaine importante après exposition à une concentration des toxique de HClPt. Même si la technique du CIP a été considérablement optimisée ces dernières décennies, son applicabilité à l’essai de l’immunomodulation est encore en développement. Par conséquent, les résultats présentés ici sont préliminaires, même si ils montrent le potentiel de PCLS humain comme un outil précieux dans la recherche en pneumologie.

Avec la méthode de recherche actuelle, PCLS humaines ont été préparés et exposés à des cinq concentrations des substances industrielles pour évaluer les effets immunomodulateurs chimiquement induites en matière de poumon humain. Les tissus pulmonaires a été exposé dans des conditions submergées comme culture permanente pendant 24 h. toxicité a été évaluée par la mesure de la LDH libérée, l’activité mitochondriale et viabilité microscopique coloration. En outre, la teneur totale en protéines pour la normalisation et des cytokines pro-inflammatoires ont été mesurés. La mesure du possible, la concentration inhibitrice (IC) 75 valeurs ont été calculées par un montage non linéaire courbe sigmoïde. Les substances de référence positive, détergents pour cytotoxicité et LPS pour la réponse cytokine innée, ont été utilisés pour la validation de chaque course. La transformation logarithmique IC75 [µM] valeurs (Journal CI50) ont été utilisées comme concentrations « irritantes » pour les mesures de libération ultérieure de cytokine.
Figure 1 et Figure 2 illustrent la procédure de mastic du poumon humain et coloration H & E exemplaire de PCLS humaine. Procédures de routine hygiéniques doivent être suivies pour éviter des effets négatifs sur la santé et assurer la sécurité du personnel de manutention des matériaux du poumon humain. La technique nécessite la formation du personnel et la pratique. Connu des pathologistes qui distinguent les différentes régions (lobes supérieur et inférieur et sous-pleurales versus plus central) et malades par rapport aux zones saines sont nécessaires pour évaluer l’état pathologique de la matière du poumon humain. Le PCLS humain généré doit être utilisé pour la préparation de H & E-teint les coupes minces, qui peuvent être réévaluées par un pathologiste. Cette procédure permet aux utilisateurs d’acquérir pratique en discriminants différentes zones malades et emplacements dans les poumons.
Figure 3 présente les résultats de mesure pour l’activité LDH et WST-1 humaine PCLS après 24 h d’incubation avec SLS. La moyenne non traitée sans SLS, montré à 0 µg/mL SLS, est un contrôle de qualité important. Valeurs doivent être inférieurs à 20 % pour LDH comparé avec tissu de détergent-lysées et > 0,7 unités d’absorbance de l’essai de WST-1. Ces contrôles de qualité servent également d’indicateurs de viabilité des tissus insuffisant. La réactivité du tissu humain vers la solution détergente, comme une substance toxique efficace, doit être incluse à titre de témoin positif. Il devrait se traduire par une augmentation de 300 à 500 % (> 2,0 unités d’absorbance) de LDH par rapport aux tissus non traités et dans les valeurs < 0,1 unités d’absorbance de l’essai de WST-1. SLS a entraîné une réduction dose-dépendante de la viabilité cellulaire telle que mesurée par une augmentation des LDH et une diminution de l’activité métabolique dans le dosage de WST-1 à des concentrations > 87 µg/mL. Un modèle de concentration-réponse sigmoïde a été ajusté aux données, afin qu’il soit possible de calculer les valeurs IC75 ou CI50. Ces valeurs peuvent par la suite utilisées pour sélectionner les concentrations pour les niveaux de cytokines et de chimiokines : des concentrations hautement toxique, généralement no ou seulement diminuée de cytokines et chimiokines peuvent être détectées. Par conséquent, des concentrations non toxiques ou seules légèrement toxiques (IC75) sont recommandées. Il est important de noter ici que l’augmentation prévue de l’activité LDH dans le surnageant de culture cellulaire est souvent influencée par la substance appliquée21. Fréquemment, les interférences se produisent entre l’activité enzymatique et de la substance, conduisant à une mauvaise interprétation des résultats si le dosage LDH est le test de cytotoxicité seul utilisé. Ainsi, il est important et nécessaire d’effectuer plusieurs analyses de cytotoxicité pour obtenir des résultats fiables et valides. En outre, il convient de mentionner que la sensibilité des essais LDH et WST-1 est très comparable.
Dans la Figure 4, images microscopiques de la viabilité de PCLS démontrent réactivité du tissu humain à détergent comme substance toxique efficace. Les résultats sont très utiles pour confirmer d’autres données de viabilité, mais cela nécessite un équipement supplémentaire. Les effets toxiques sont visuellement évalués par évaluation du tissu de calcéine positifs par rapport aux noyaux des cellules EthD-1 positives. Segments choisis au hasard au sein du parenchyme généralement lieu à données comparables, alors que les voies respiratoires ou des vaisseaux sanguins doivent être évités, comme les plus grandes cavités peuvent se déplacer les résultats. De notre expérience et avec les paramètres microscopiques décrits ci-dessus, un volume moyen entre 1.5 x 106 et 5 x 106 µm3 du tissu contrôle est mesuré. Les valeurs dépendent de qualité matérielle du poumon, qualité PCLS et aussi sur la maladie du donneur de tissus pulmonaires. Même si la viabilité des tissus pulmonaires humains varie entre les donateurs, le nombre de noyaux de cellules mortes par rapport aux tissus viables ne doit pas dépasser 15 % du contrôle des tissus. Si les noyaux des cellules mortes sont principalement présents dans le contrôle de tissus, cependant, l’expérience devrait être abandonnée.
Figure 5 affiche des données représentatives pour l’effet immunomodulateur de HClPt et SLS sur le tissu de poumon humain. Les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-1α sont des marqueurs biologiques de l’inflammation, indiquant le début des processus inflammatoires après exposition à stimuler des substances. Les deux cytokines ont été mesurés par ELISA. IL-1α extracellulaire est généralement faible dans PCLS humaine, alors qu’IL-1α intracellulaire atteint des niveaux de 1 000 pg/mL et plus. Une diminution de IL-1α intracellulaire indique les processus cytotoxiques en cours - et est plus souvent observée après exposition des PCLS humaine aux produits chimiques. Si le tissu est stimulé avec le LPS, un activateur du système immunitaire inné et comme tel la bientraitance contrôler, puis la plus grande partie de l’IL-1α induite ne peut être détectées dans les cellules après 24h. En revanche, la sécrétion de TNF-α induite par la stimulation de la LPS principalement mesurable extracellulaire. L’utilisation d’un contrôle positif approprié, tels que des disques vinyles, démontre la validité d’une méthode. Avec la méthode de recherche actuelle, PCLS humains ont été exposés à trois concentrations de HClPt (32, 64 et 125 µg/mL) ou deux concentrations de SLS (1 et 10 µg/mL) pendant 24 h sécrétion a été déterminée comme une somme des cytokines intracellulaires et extracellulaires de Cytokine normalisé à des concentrations de protéines totales, comme illustré à la Figure 5. Il est à noter ici que le test de BCA est généralement utilisé pour la détermination de la teneur en protéines totales, cependant, elle reflète aussi la cytotoxicité induite par la substance. Par conséquent, à des concentrations hautement toxiques la teneur totale en protéines ne peut servir pour la normalisation des données de cytokine. Sécrétion d’IL-1α a augmenté significativement de 263 ± 38 pg/mg à 887 ± 216 pg/mg et de TNF-α de 263 ± 38 pg/mg à 1 160 ± 286 pg/mg (Figure 5A, B). En outre, la sécrétion de TNF-α et IL-1α induite par LPS est présentée par rapport à un contrôle de tissus non stimulées. Induction de cytokines pro-inflammatoires par les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés, tels que des disques vinyles, démontre la validité d’une méthode et est fortement recommandée à utiliser lorsque vous travaillez avec PCLS humaine pour étudier les effets immunomodulateurs. Pour plus de détails sur les données HClPt et SLS, veuillez vous reporter à l’étude de Lauenstein et al. 21
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig1.jpg"> Figure 1 : Procédure pour le garnissage du poumon humain. Le poumon humain est préparé immédiatement après résection. Le poumon doit être conservé à température ambiante pendant remplissage compatible avec agarose et d’éviter la polymérisation d’agarose soudaine pendant le remplissage. Le poumon est positionné horizontalement, avec les lobes étalés pour une vue optimale sur la bronche ou des bronches (A & B pour les gros plan sur les bronches). Les bronches sont canulés avec un tube souple en silicone et fixés avec des colliers de serrage (C). Après le remplissage intérieur et agarose polymérisation dans les tissus, formés pathologistes couper le poumon en tranches d’environ d’épaisseur 3-5 cm (D). Ces tranches de carottes de tissu cylindrique (Ø par exemple, 8 mm) sont préparés avec un outil de carottage (E). Ces noyaux de tissus est coupés avec une trancheuse de tissu en CIP, qui est immédiatement transférés en milieu rempli de Pétri pour incubation dans des conditions de culture de cellules normales (E). Après que plusieurs étapes de lavage le PCLS sont transférées dans des plaques de culture cellulaire (p. ex., plaque 24 puits avec deux PCLS par puits et 500 µL de milieu) pour supprimer les débris cellulaires résiduelle et médiateurs cellulaires libérés (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig2.jpg"> Figure 2 : Détermination de l’état de santé de PCLS humaine par la coloration H & E. Le PCLS dans cette image, préparée à partir d’un donneur avec une tumeur du poumon, montre le tissu de poumon intact avec parenchyme alvéolaire, périphérique airways (*) et les vaisseaux sanguins (pointes de flèche) dans la vue d’ensemble (A). À fort grossissement, conduite airways avec l’épithélium respiratoire cilié intact (pointes de flèches) (B), une structure alvéolaire intacte bordée de pneumocytes viables, y compris un capillaire avec nombreux érythrocytes (pointes de flèches) (C), les espaces alvéolaires contenant des macrophages alvéolaires (CD68 immunohistochimie) (D), ainsi que les vaisseaux sanguins avec l’endothélium intact (CD31 immunohistochimie) (E) peut être observée. Seulement le tissu exempt de tumeur a été utilisé pour le CIP, c’est pourquoi aucune zone macroscopiquement malades n’est visibles. Contrairement à PCLS préparés à partir de donneurs avec d’autres maladies pulmonaires, comme l’emphysème ou la fibrose, la structure alvéolaire n’est pas perturbée et le CIP est seulement légèrement effiloché à la frontière extérieure, probablement en raison des étapes de préparation. Barres d’échelle indiquent 1 000 µm (A) et 50 µm (B–E), respectivement. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig3.jpg"> Figure 3 : Détermination de la cytotoxicité induite par SLS dans PCLS humaine, mesurée par la fuite de l’enzyme LDH dans le milieu de culture (A) et la perte de l’activité enzymatique métabolique évaluée avec le colorant WST-1 B. PCLS humains ont été exposés à des concentrations croissantes de SLS. Un modèle de concentration-réponse sigmoïde a été par la suite ajusté aux données, afin que les valeurs IC75 ou CI50 (concentration inhibitrice à 25 % et 50 % de réduction de la viabilité des cellules) peuvent être calculés (figures de droite). Les données sont présentées comme moyenne ± et, n = 3-5. Absorbance de l’essai de la LDH a été mesurée à 492 nm (référence à 630 nm) et de dosage de WST-1 à 450 nm (référence à 630 nm). Données ont été adaptées et modifiées de Lauenstein et al. 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig4.jpg"> Figure 4 : Des images représentatives du rendu de coloration et de l’image microscopique en trois dimensions de humaine PCLS. Contrôle des tissus vivants et la réactivité des tissus à détergent, comme une substance toxique efficace, sont indiqués après coloration de PCLS humaine avec calcéine AM (jaune) et EthD-1 (rouges). Piles de 30 µm ont été prises avec un objectif 10 X (A) et (B) a rendu. La barre d’échelle indique 100 µm. Excitation longueurs d’onde 488 nm et 543 nm, émission filtres BP 505-550 nm et LP 560 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig5.jpg"> Figure 5 : Diammonium d’ammonium (HClPt)-induite par la sécrétion de TNF-α et IL-1α dans PCLS humaine après 24 h d’exposition. PCLS ont été exposés à trois concentrations (µg/mL 32, 64 µg/mL et 125 µg/mL de HClPt) et deux concentrations différentes (1 µg/mL et 10 µg/mL) de SLS. Extracellulaires et intracellulaires de IL-1α (A) et de TNF-α (B) ont été déterminées par ELISA et normalisée à la teneur totale en protéines. Pour montrer la validité de la méthode un positif activateur du système immunitaire inné, LPS, est montré comme une référence intracellulaire IL-1α (A) et libération de TNF-α (B) extracellulaire, normalisée à la teneur totale en protéines. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM, *p < 0,05 et ***p < 0,001 ; HClPt et SLS : n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 en technique double (test de Mann-Whitney). Ce chiffre a été modifié par Lauenstein et al. 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig1.jpg"> Supplémentaire Figure 1 : détaillé traitement algorithmique pour les images de viabilité microscopique coloration à l’aide du logiciel de rendu. Opératoire étape par étape pour l’analyse d’image des images téléchargées de LSM pour rendu de surface des tissus viables calcéine teinté (A–G, I) et spot détection des noyaux des cellules colorées homodimère d’éthidium (H, J–M). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig2.jpg"> Supplémentaire Figure 2 : vue d’ensemble de l’analyse d’image informatique de viabilité microscopique coloration des tissus pulmonaires humains. Des tissus viables (jaune) a été analysée par le rendu de surface (B–j’ai) et des noyaux de cellules mortes (rouges) ont été détectés par détection spot (J–P). Le mode de capture instantanée a été utilisé pour exporter l’image (Q). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

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