Name: assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices
Uploaded: 2018-05-09T13:00:00
Duration: 12 min 4 s
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Gostaríamos de agradecer o pre-trabalho sobre estratégias alternativas de testes para avaliação do risco com PCLS humana a Lan Lauenstein. Algumas das pesquisas foi apoiado por uma subvenção da Comissão Europeia no âmbito do 6. º programa-quadro deth SENS-IT-IV "Romance estratégias de testes para avaliação In Vitro de alérgenos".

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	<li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+change,+air+pollution+and+extreme+events+leading+to+increasing+prevalence+of+allergic+respiratory+diseases.">Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases.</a> Multidiscip Respir Med. 8 (1), 12 (2013).</li><li>Pawankar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+world+allergy+report+2008:+allergy+and+chronic+respiratory+diseases.">State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases.</a> World Allergy Organ J. 1 (6), 4-17 (2008).</li><li>Hartung, T., Daston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+in+vitro+tests+suitable+for+regulatory+use.">Are in vitro tests suitable for regulatory use.</a> Toxicol Sci. 111 (2), 233-237 (2009).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+for+the+twenty-first+century.">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460 (7252), 208-212 (2009).</li><li>Balls, M., Straughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+Rs+of+Russell+&amp;+Burch+and+the+testing+of+biological+products.">The three Rs of Russell &amp; Burch and the testing of biological products.</a> Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).</li><li>Sewald, K., Braun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunotoxicity+using+precision-cut+tissue+slices.">Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices.</a> Xenobiotica. 43 (1), 84-97 (2013).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+lung+slices+in+toxicology.">The use of human lung slices in toxicology.</a> Hum Exp Toxicol. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Ressmeyer, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+guinea+pig+precision-cut+lung+slices:+comparison+with+human+tissues.">Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues.</a> Eur Respir J. 28 (3), 603-611 (2006).</li><li>Donovan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+elicits+in+vitro+relaxation+in+airways+and+precision+cut+lung+slices+from+a+mouse+model+of+chronic+allergic+airways+disease.">Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (10), 1219-1228 (2015).</li><li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+spleen+tyrosine+kinase+attenuates+IgE-mediated+airway+contraction+and+mediator+release+in+human+precision+cut+lung+slices.">Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices.</a> British journal of pharmacology. 173 (21), 3080-3087 (2016).</li><li>Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomorphometric+analysis+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-pulmonary+arteries+using+murine+precision+cut+lung+slices.">Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices.</a> J Vis Exp. (83), e50970 (2014).</li><li>Lamb, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bl+1002494,+a+Novel+Potent+and+Selective+Oral+Spleen+Tyrosine+Kinase+Inhibitor,+Displays+Differential+Potency+in+Human+Basophils+and+B+Cells.">Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells.</a> J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 554-561 (2016).</li><li>Leus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+3-selective+inhibitor+RGFP966+demonstrates+anti-inflammatory+properties+in+RAW+264.7+macrophages+and+mouse+precision-cut+lung+slices+by+attenuating+NF-kappaB+p65+transcriptional+activity.">HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity.</a> Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).</li><li>Schleputz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurally+mediated+airway+constriction+in+human+and+other+species:+a+comparative+study+using+precision-cut+lung+slices+(PCLS).">Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS).</a> PLoS One. 7 (10), 47344 (2012).</li><li>Hess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalidation+of+the+ex-vivo+model+PCLS+for+prediction+of+respiratory+toxicity.">Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-induced+calcium+signaling+and+contraction+of+airway+smooth+muscle+cells+in+lung+slices.">Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices.</a> J Gen Physiol. 119 (2), 187-198 (2002).</li><li>Wohlsen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+allergic+response+in+small+airways+of+human+precision-cut+lung+slices.">The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 21 (6), 1024-1032 (2003).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+H3N2+and+H1N1+influenza+virus+infection+in+a+human+lung+organ+culture+model.">Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model.</a> Virology. 396 (2), 178-188 (2010).</li><li>Zmora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-human+primate+orthologues+of+TMPRSS2+cleave+and+activate+the+influenza+virus+hemagglutinin.">Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin.</a> PLoS One. 12 (5), 0176597 (2017).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Lauenstein, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunotoxicity+induced+by+chemicals+in+human+precision-cut+lung+slices+(PCLS).">Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS).</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28 (4), 588-599 (2014).</li><li>Wild, L. G., Lopez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+asthma+caused+by+high-molecular-weight+substances.">Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances.</a> Immunol Allergy Clin North Am. 23 (2), 235-250 (2003).</li><li>Di Stefano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+asthma+due+to+low+molecular+weight+agents.">Occupational asthma due to low molecular weight agents.</a> Int J Immunopathol Pharmacol. 17 (2), 77-82 (2004).</li><li>Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+assessment's+insensitive+toxicity+testing+may+cause+it+to+fail.">Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail.</a> Environ Res. 135, 139-147 (2014).</li><li>Boverhof, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+sensitization+and+allergy:+current+research+approaches+and+needs.">Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 226 (1), 1-13 (2008).</li><li>Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GARD+assay+for+assessment+of+chemical+skin+sensitizers.">The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27 (3), 1163-1169 (2013).</li><li>Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thickness+estimation+of+fluorescent+sections+using+a+CSLM.">Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM.</a> Journal of Microscopy. 184 (2), 106-116 (1996).</li><li>Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+Mouse+Lung+Slices+to+Visualize+Live+Pulmonary+Dendritic+Cells.">Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li><li>Switalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+innate+cytokine+response+to+immunomodulators+and+adjuvants+in+human+precision-cut+lung+slices.">Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 246 (3), 107-115 (2010).</li><li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices.">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li><li>Niehof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+isolation+from+precision-cut+lung+slices+(PCLS)+from+different+species.">RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species.</a> BMC Res Notes. 10 (1), 121 (2017).</li><li>De Proost, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+the+pulmonary+neuroepithelial+body+microenvironment+unraveled+by+live+cell+imaging.">Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging.</a> FASEB J. 23 (4), 1153-1160 (2009).</li><li>Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+of+Remnant+Human+Lung+Tissue+for+Mechanical+Stretch+Studies.">Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies.</a> Cell Mol Bioeng. 6 (2), 175-182 (2013).</li><li>Watson, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Chemical+Toxicity+Using+Cryopreserved+Precision+Cut+Lung+Slices.">Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices.</a> Toxicol Sci. 150 (1), 225-233 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar. ITEM de Fraunhofer é uma organização de pesquisa sem fins lucrativos pública independente para a investigação aplicada, realizando pesquisa de contrato em nome das indústrias de biotecnologia, farmacêutica, química e cosméticos. Financiamento do Instituto vem de projetos públicos nacionais e internacionais.

A técnica PCLS humana está bem estabelecida no nosso laboratório. O presente trabalho dá uma descrição da técnica e o seu uso para testar a toxicidade de substâncias em pulmão tecido ex vivo. Em geral, qualquer laboratório usando que esta técnica deve procurar criar um ensaio relacionados a definição de intervalos quantificáveis, estimativa de variabilidades e controles de qualidade, garantindo a validade do experimento. Possíveis procedimentos padrão poderiam ser, por exemplo, repetir a cada ponto de extremidade, por exemplo, o ensaio de citotoxicidade, num mínimo de três doadores biológicos (corridas individuais) com um mínimo de duas a três repetições técnicas por exemplo incluindo positivo e referências negativas. Pessoal de laboratório deve ser treinado para aumentar a consistência de ensaio e minimizar a variabilidade do ensaio.
Pontos de extremidade, frequentemente usados para avaliar efeitos imunomoduladores de substâncias no tecido pulmonar incluem citotoxicidade as medições utilizando ensaios diferentes (por exemplo, ensaio LDH, WST-1 ensaio, microscópico de coloração do ensaio), ensaios de liberação de citocinas, bem como mudanças no perfil de expressão e caracterização de alterações nas populações celulares por métodos de immunohistopathological6. Além disso, existem técnicas descrevendo a visualização das células, como células dendríticas pulmonares, em murino PCLS28 que também pode ser transferido para PCLS humana e, portanto, pode fornecer um insight mais detalhada sobre a composição celular antes e após o tratamento com substâncias citotóxicas putativos.
Este protocolo básico e técnica para a preparação de cortes de tecido de pulmão humano é comparável a técnicas que têm sido bem descritas em publicações29. Em suma, o material do órgão é obtido a partir de pacientes que sofrem de viver em risco de doenças crônicas como câncer de pulmão, que têm de se submeter à cirurgia para ressecção ou transplante. Os estudos devem ser aprovados pelo Comitê de ética local. Consentimento informado por escrito dos pacientes é necessário. Criação de um fluxo de trabalho entre a clínica e laboratorial é uma questão crítica e requer comunicação e definição de interfaces e infra-estrutura entre os dois locais. Material de pulmão humano tem que ser processados diretamente após a ressecção de preservar a viabilidade do tecido. Vale ressaltar que a técnica descrita aqui para PCLS humana pode ser aplicada para jovens e velhos pulmões e pulmões saudáveis e doentes. Nos EUA, por exemplo, é possível obter os pulmões de doadores de órgãos saudáveis que morreram em acidentes ou foram rejeitados cujos órgãos para transplante.
O primeiro passo crítico no protocolo é a inflação das vias aéreas e parênquima circundante com solução de agarose. Essa etapa é necessária para solidificar o tecido muito macio para o procedimento de corte posterior. A qualidade do material do pulmão humano, com base no plano de fundo de doença, é fundamental aqui. Só lóbulos com pleura intacta podem ser preenchidos. Tumores de estágio final perto do brônquio, por vezes, impedir o processo de enchimento. Antes de inflar o material humano, a temperatura da solução de agarose tem de ser cuidadosamente verificado. Muito sangue (ou outros líquidos, exsudatos) dentro do ser humano tecido pulmonar irá resultar em indesejável diluição de agarose e irá influenciar o processo de polimerização. Após a insuflação do tecido pulmonar e a coagulação de agarose no gelo, os pulmões são cortados em seções de 200 a 300 µm de espessura. Consistência do tecido é um problema muito crítico. Se o tecido estiver muito mole, corte de secções iguais é difícil. Mesmo se o micrótomo mesmo parâmetros são definidos para cada doador, a espessura das fatias entre doadores pode variar, devido ao indivíduo condições e mudanças durante a inflar de processo para cada pulmão. Enchimento não homogênea do tecido resultará em fatia de diferentes espessuras. Em vez de medir e padronizar a espessura das fatias, medição do teor de proteína total pode ser usada para monitorar indiretamente espessuras de fatia de pulmão. Várias doenças da fase final dificultam o processo de corte; por exemplo, navios são extremamente engrossados no tecido fibrótico e hipertensão pulmonar o sangue pode ser tão duro que corte dos cilindros de tecido é quase impossível e a lâmina do micrótomo precisa ser substituído muitas vezes.
Após a preparação do humano PCLS e intensivo de etapas de lavagem, que são necessárias para remover os resíduos de célula e lançado enzimas, tecido seções podem ser usadas para experimentos29. PCLS humanas são cultivadas em condições de cultura celular normal e expostos, por exemplo, produtos químicos, drogas ou lipopolissacarídeos. Contaminação ocasional de PCLS devido a infecções (desconhecidas) é uma edição especial na cultura de material de pulmão humano. Culturas de tecidos, apresentando infecções deve ser descartadas e o equipamento deve ser desinfectado cuidadosamente. Por outro lado, separação espacial entre os lugares de laboratório usados para a preparação de um lado e cultivo pode ajudar a evitar infecções-Cruz. No que diz respeito o equipamentos, o micrótomo pode vazar, e solta parafusos hexadecimais podem originar danos ao motor e parada do movimento da lâmina. Não todas as partes da segmentação de dados é feita de aço inoxidável, e então oxida se não secou imediatamente alterar a limpeza. Para superar problemas de equipamento, pode ser necessário ter pelo menos um dispositivo de backup.
Em publicações anteriores, agarose foi relatado para ser lavada e removido durante o intensivo de etapas de lavagem após a preparação. Na verdade, isso não é possível, não pode ser removido da agarose. Para a remoção completa da agarose, precisa ser re-derretido em altas temperaturas, que iria destruir o tecido. A agarose em alvéolos e vias aéreas não interfere com os pontos de extremidade descritos. Outros pontos de extremidade podem ser influenciados pela presença de agarose (Veja também limitações). A necessidade de preparar as secções de tecido muito fresco tem que ser enfatizado, como viabilidade de tecido é uma questão crítica na cultura. Broncoconstrição não é um parâmetro válido para viabilidade. Recomendamos o uso de pelo menos dois ou três ensaios de citotoxicidade independente para verificar a viabilidade do parênquima circundante; Isto tem que ser verificado em cada experimento,30. Controles de qualidade em ensaios de citotoxicidade servir como indicadores de viabilidade do tecido insuficiente. Portanto, é recomendável para avaliar a capacidade de resposta do tecido, por exemplo, para uma substância tóxica eficaz como um detergente em todos os ensaios de citotoxicidade. Com base em curvas dose-resposta, valores mínimos e máximos de absorção devem ser definidos para os ensaios de citotoxicidade e reuniram-se para experiências posteriores. Outras modificações ao protocolo dependem na maior parte dos produtos químicos aplicados e os pontos de extremidade de interesse. A aplicabilidade dos produtos químicos insolúveis ou altamente reativos é limitada. A maior concentração de solvente para DMSO é limitada a 1%. Concentrações mais elevadas podem ser usadas, mas podem resultar na pronuncia-se liberação de citocinas pró-inflamatórias, como IL-8. Por outro lado, o estímulo usado pode ser relativamente fraco. Neste caso, a quantidade de tecido pode ser aumentada de duas a quatro fatias por bem. Essa abordagem limita a viabilidade de 24 h.
Uma grande limitação de PCLS humano é que na Alemanha eles só podem ser preparados de material de pulmão humano doente. Pacientes que se submetem à cirurgia são normalmente mais de 50 anos e 80% dos pacientes que sofrem de câncer de pulmão são ou eram fumantes. Medicação dos pacientes, como glicocorticoides, também pode influenciar o resultado de experimentos usando o tecido humano. Portanto, é essencial para: i) validar cada experimento por referências positivas, verificar a viabilidade, a funcionalidade e sensibilidade do tecido individual e ii) validação cruzada os resultados usando o tecido de pulmão saudável, não-doentes, meia-idade animais de laboratório (primatas não-humanos, tais como cynomolgus e, se possível, rato, rato, cobaia). Melhor o resultado da patologia do tecido doente, melhor os resultados experimentais. Tecido fortemente doente dificilmente pode ser usado e mostra muitas vezes limitado a viabilidade, níveis de citocina inadequadamente baixa ou extremamente alta, infecções bacterianas ou fúngicas e menos broncoconstrição. Variação de doador-para-doador é superior comparada com resultados obtidos em animais de laboratório, refletindo a variabilidade individual dos seres humanos. Isso, no entanto, não é uma limitação em geral; Como mencionado acima, em outros países (por exemplo, os EUA), é possível obter os pulmões saudáveis de doadores de órgãos falecido rejeitados para transplante. Capacidade de resposta do tecido tem sido bem descrita para o primeiro até 48 h em experimentos de exposição aguda. Viabilidade e funcionalidade do tecido é reduzido, depois de muitos dias de cultura ou armazenamento a-80 ° C. É possível que a cultura humana do tecido pulmonar para até cerca de 14 dias. Viabilidade continua durante este tempo; no entanto, é observado um aumento na variabilidade, bem como uma perda de funcionalidade de várias populações de células, como macrófagos, nos tecidos, resultando na liberação de citocinas limitada em resposta a mitógenos. Uma outra limitação para alguns pontos de extremidade é a presença de agarose no tecido, dificultando, por exemplo, o isolamento de alta qualidade e suficientes quantidades de RNA31 ou a preparação de suspensões de célula única para citometria de fluxo subsequente e fenotipagem de células. A possibilidade de obter insights mecanicistas em respostas de célula única e funcionalidade, assim, é limitada.
Organotypic modelos de tecido, tais como PCLS humano, são considerados para ter um impacto elevado na pesquisa básica e não-clínicos. Pulmão humano material tem uma composição biológica que reflete de perto a arquitetura normal do órgão. Ele contém, por exemplo, células epiteliais brônquicas e alveolares residenciais, células musculares lisas, fibroblastos, células endoteliais, fibras nervosas e macrófagos. O tecido é viável e células respondem a vários estímulos. Nervo fibras, apesar de corte, pode ser localmente activada, levando a respostas reflexas terminal14. Consequentemente, este modelo ex vivo oferece a possibilidade de estudar a resposta imune inata celular, respostas de defesa, citocinas sinalização e indução de marcadores de superfície celular. Várias melhorias na técnica de cultivo e validação de pontos de extremidade permitem o uso de combustível humano na ciência translacional. Exemplos de abordagens futuras são: i) validação de novas metas no tecido de pulmão humano, ii) a avaliação das respostas imunes após a exposição, por exemplo, para produtos químicos, drogas, nanopartículas, etc., iii) suplementação de tecido pulmonar com células do sistema imunológico, tais como os linfócitos T, iv) identificação e modificação de padrões moleculares, por exemplo, após exposição a sensitizers respiratórias, doença de indução de substâncias ou compostos ativos inibindo vias; Além disso, v) remodelação das vias respiratórias e vi) neuronal Regulamento32. O campo científico está interessado nessas abordagens actuais e futuras com combustível. Além disso, há uma variedade de diferentes desenvolvimentos que irão ajudar a melhorar a técnica de combustível, como crio-preservação20e tecido33 para imitar o movimento natural do tecido durante a respiração ou mecânica de alongamento ventilação.
A vantagem principal de PCLS humano em comparação com outros modelos 3D é a presença de células do sistema imunológico e fibras nervosas. Experiências também podem ser executadas no rato, rato e primatas não-humanos, que são as espécies de animais que ainda são usadas com mais frequência em farmacologia e toxicologia. A complexidade do tecido pulmonar humano suporta a tradução dos resultados de animal para humano e de em vitro in vivo. No contexto dos ensaios alternativos existentes para a identificação de sensitizers respiratórias, PCLS humanas são muito complexas e não permitem insights sobre respostas de célula única. Ainda, citometria de fluxo e microscopia pode dar informação sobre respostas celulares, se o marcador bem celular é usado em combinação, por exemplo, com marcadores intracelulares, necrose ou apoptose. Existem ensaios publicados que tenham sido validados e relatados para ter sido usado para a identificação de sensitizers respiratórias. No entanto, os avanços no uso de combustível com todas suas vantagens sobre ensaios de célula única estão fazendo uma contribuição valiosa no sentido de que a técnica pode ser usada para rastreio de alto rendimento, conforme descrito por Watson et al 34 eles desenvolveram um ensaio do elevado-throughput screening para prever a toxicidade de vias aéreas em murino PCLS crio-preservados. Com seu formato PCLS miniaturizado de 96 poços, detectaram leituras semelhantes no líquido de lavagem murino, tornando PCLS um ensaio da elevado-produção viável.

Doenças respiratórias como a asma alérgica, asma ocupacional, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), enfisema e infecções das vias aéreas superiores e inferiores estão em ascensão e representam um fardo de saúde em todo o mundo1,2. Sistemas de teste adequado são necessários, a fim de identificar alguns dos mecanismos básicos subjacentes a estas doenças, além de desenvolvimento e testes de substâncias adequadas. Pesquisa básica, bem como desenvolvimento de drogas pré-clínicos concentram-se em resultados adquiridos em ensaios em vitro ou na vivo . Estes ensaios, no entanto, têm suas limitações,3. Em primeiro lugar, em vitro ensaios utilizam células humanas que foram isoladas e removidas do tecido adjacente ou órgãos e, portanto, não são mais capazes de interagir com ou ser protegidos por outras células3. Em segundo lugar, os modelos animais muitas vezes não são traduzíveis para os seres humanos devido a diferenças na fisiologia e bioquímica de divergências4. Para minimizar estas limitações e no contexto da 3R (substituição, refinamento, redução) princípio5, novos modelos alternativos estão constantemente evoluindo.
Modelos alternativos de tecido 3D humano, tais como combustível, são um elo entre humanas em vitro e modelos complexos animais na vivo . PCLS refletem a heterogeneidade funcional com todos os tipos de células relevantes presentes no trato respiratório6. Além disso, a técnica PCLS tem a vantagem de preparação pode ser reproduzida de várias fatias finas de espessura precisa de um doador único tecido animal ou humana. Isto permite um controle interno, bem como diferentes concentrações ou drogas a serem testadas.
Desde a primeira introdução de fatias de pulmão humano cheio de ágar em 1994 por Fisher et al . 7 a técnica para fatiar e cultivo do tecido pulmonar foi substancialmente melhorada. Christian Martin et al . melhoraram a essa técnica para outras aplicações químicas e farmacológicas8. Nosso grupo foi introduzido para esta técnica por Christian Martin em 2007. Desde então, ampliou-se a aplicação de PCLS na investigação de testes de respostas funcionais, tais como as vias aéreas9,10 e vasoconstrição11, para imunológicos, farmacológicos12,13, e toxicológicas7 testes em várias espécies em vários laboratórios. Por exemplo, Schlepütz et al 14 investigado respostas das vias aéreas para diferenças de espécie e comparado ativação do neurônio periférico por estimulação de campo elétrico (EFS) ou por capsaicina em camundongos, ratos, cobaias, ovelhas, saguis e seres humanos. Eles encontraram várias espécies que têm padrões distintos, mas diferentes de broncoconstrição mediada por nervo e concluíram que os animais de laboratório comumente utilizados (camundongos e ratos) não reflectem sempre a resposta humana. Para testes de toxicidade pulmonar e reduzir o número de animais, neste contexto, Hess et al 15 previamente validado rato PCLS como alternativa ex vivo para estudos de toxicidade de inalação. Este estudo multicêntrico de pré-validação resultou no desenvolvimento de dois modelos de previsão usando PCLS com resultados promissores.
Além disso, em pesquisa básica, PCLS têm sido utilizados para elucidar o cálcio sinalização16, início respostas alérgicas17e infecção viral respostas18,19. Progresso técnico está em curso e ainda mais avanços estão sendo explorados. Por exemplo, o campo está aumentando o benefício de tecido humano pelo armazenamento e reutilização de tecidos congelados. Rosner et al descreveram uma técnica de congelamento e degelo PCLS murino que preserva a capacidade das vias aéreas de contrato mediante estimulação: portanto, a técnica prolonga a janela de tempo limitado, dentro do qual os tecidos permanecem viáveis e muito mais os ensaios podem ser aplicados ao longo do tempo para o mesmo doador de20. Além destes avanços da pesquisa, Lauenstein et al 21 recentemente investigado a avaliação do risco de vários produtos químicos que podem atuar como potenciais sensitizers para asma ocupacional em PCLS humana.
Asma ocupacional, cujas sintomas são obstrução do fluxo de ar e as vias aéreas hyperresponsiveness, semelhante à asma alérgica, é induzida pela exposição ao alto peso molecular (HMW)22 ou de baixo peso molecular (HBPM) substâncias23 (por exemplo, , compostos de platina) no ambiente de trabalho. Agentes de HBPM têm uma elevado potencial de sensibilização quando formando haptens e vincule a transportadora proteínas21. Registro de novos produtos químicos HMW ou HBPM exige avaliação de riscos em vitro e em vivo sobre seu potencial de sensibilização putativa (EG., OCDE diretriz 429)24. Os testes utilizados para determinar a sensibilização putativa potencial, no entanto, originalmente não foram concebidos para avaliação do risco de sensitizers respiratórias, mas para contatos sensitizers, embora parecia haver uma congruência para um pequeno subconjunto de substâncias25 . O trabalho de Lauenstein et al foi criado como parte do projecto da União Europeia Sens-it-iv, para desenvolver estratégias alternativas de testes para avaliação do risco de contato putativo ou pulmão sensitizers21. Para este projeto, focamos em testar a usabilidade de PCLS humano como uma ferramenta de teste de alternativa. Portanto, um conjunto de pontos de extremidade imunomodulador (por exemplo, viabilidade e citocina secreção) foi selecionado para determinar o potencial irritante ou inflamatório de substâncias químicas, como compostos de HBPM platina. Lauenstein et al . não encontrado nenhum padrão geral que poderia ser aplicado a todas as sensitizers respiratórias; Contudo, seu trabalho desde a Fundação por protocolos recentemente publicado26.
Em resumo, o protocolo aqui apresentado para a preparação e posterior exposição de PCLS humana fornece um método útil para a avaliação do pulmão potencialmente tóxicos e/ou imunomoduladores substâncias que podem estar envolvidas no desenvolvimento de respiratória doenças como a asma ocupacional.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1373px;" width="1373">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silicon hose 3.0 x 5.0 mm</td>
			<td style="width:471px;">A. Hartenstein (Leipzig, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">SS04</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Syringe</td>
			<td style="width:471px;">Faust Lab Science (Klettgau, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">9.410 050</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Coring tools</td>
			<td style="width:471px;">custom-made</td>
			<td style="width:317px;">custom-made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blade Handle (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205530001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blades (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205500000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome: Tissue Slicer</td>
			<td style="width:471px;">Alabama R&#38;D (Bad Homburg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">303400-ADPT</td>
			<td style="width:227px;">Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:471px;">Wilkinson Sword (Solingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">ENR-4027800011506</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tissue culture dishes</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z666246-420EA</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell strainer filter (100 &#181;m Nylon)</td>
			<td style="width:471px;">Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">BD352360</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Inoculation loop</td>
			<td style="width:471px;">Copan Diagnostics (Murrieta, USA)</td>
			<td style="width:317px;">&#160;CD176S01</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TPP Tissue culture plates 24wells</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z707791-126EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cassette</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>1000957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MaxiSorp flat-bottom</td>
			<td style="width:471px;">Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MicroWell 96-Well&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">260836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Confocal LSM Meta 510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Image rendering software</td>
			<td style="width:471px;">Bitplane AG (Z&#252;rich, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">IMARIS 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LSM Image Browser</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Multiwell-Reader</td>
			<td style="width:471px;">Tecan Group Ltd. (M&#228;nnedorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;">Tecan infinite F200Pro</td>
			<td style="width:227px;">Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Plate shaker</td>
			<td style="width:471px;">Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">KM-2 Akku</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">BenchMark ULTRA</td>
			<td style="width:471px;">Ventana Medical Systems (Tucson, USA)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Automated IHC/ISH slide staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Assays</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644807001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644793001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:359px;">Microscopical vitality staining&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Invitrogen (Carlsbad, USA)</td>
			<td>L-3224</td>
			<td style="width:227px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ELISA assay kit</td>
			<td style="width:471px;">R &#38; D systems</td>
			<td>various, e.g. DY210 (TNF-&#945;) or DY200 (IL-1&#945;)</td>
			<td style="width:227px;">DuoSet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Reagents</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarose, low gelling temperature&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9414-100G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle&#8217;s Balanced Salts (EBSS)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>E2888-500ML</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td>17-602E</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)</td>
			<td style="width:471px;">Gibco (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>11039-047</td>
			<td style="width:227px;">Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Phosphate with Ca and Mg (DPBS)</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td style="width:317px;">BE17-513F&#160;&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9647-500G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Detergent</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (Saint Louis, USA)</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td style="width:227px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:471px;">Merck (Darmstadt Germany)</td>
			<td>524653</td>
			<td style="width:227px;">&#160;0.05% Tween 20 in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices

Doenças respiratórias em sua ampla diversidade precisam de sistemas de modelo apropriado para compreender os mecanismos subjacentes e permitir o desenvolvimento de novas terapias. Além disso, o registro de novas substâncias requer avaliação de risco adequada com sistemas de testes adequados para evitar o risco de indivíduos sendo prejudicado, por exemplo, no ambiente de trabalho. Essas avaliações de risco são geralmente realizadas em estudos com animais. Tendo em conta o princípio dos 3R e ceticismo público contra as experiências com animais, humanos métodos alternativos, tais como fatias de precisão de corte de pulmão (combustível), têm evoluído. O presente trabalho descreve a técnica ex vivo de PCLS humano para estudar o potencial de imunomoduladores de substâncias de baixo peso molecular, tais como hexachloroplatinate de amónio (HClPt). Medidos os pontos de extremidade incluem viabilidade e inflamação respiratória local, marcado por alterado secreção de citocinas e quimiocinas. Citocinas pró-inflamatórias, fator de necrose de tumor alfa (TNF-α), e alfa da interleucina 1 (IL-1 α) foram significativamente aumentado em PCLS humana após exposição a uma concentração de sub tóxica de HClPt. Mesmo que a técnica de PCLS foi otimizada substancialmente nas últimas décadas, sua aplicabilidade para o teste de imunomodulação ainda está em desenvolvimento. Portanto, os resultados aqui apresentados são preliminares, mesmo que eles mostram o potencial de PCLS humana como uma valiosa ferramenta na investigação respiratória.

Com o presente método de pesquisa, PCLS humanas foram preparados e expostos a cinco concentrações de substâncias industriais para avaliar efeitos imunomoduladores quimicamente induzida no material de pulmão humano. Tecido pulmonar foi exposto em condições submersas como cultura permanente por 24 h. toxicidade foi avaliada pela medição do LDH liberada, atividade mitocondrial e viabilidade microscópica de coloração. Além disso, o teor de proteínas totais para normalização e citocinas pró-inflamatórias foram medidos. Sempre que possível, 75 valores de concentração inibitória (IC) foram calculados pelo encaixe de curva sigmoidal não-linear. As substâncias de referência positiva, detergentes para citotoxicidade e LPS para a resposta inata cytokine, foram usadas para validação de cada execução. O IC75 transformados logaritmicamente [µM] valores (log de IC50) foram usados como "irritantes" concentrações para medições de liberação de citocinas subsequentes.
Figura 1 e Figura 2 mostram o procedimento de encher o pulmão humano material e exemplar H & E mancha de PCLS humana. Procedimentos rotineiros de higiene devem ser seguidas para evitar efeitos adversos sobre a saúde e garantir a segurança do pessoal de lidar com o material de pulmão humano. A técnica exige treinamento de pessoal e prática. Experientes patologistas que distinguem várias regiões (superior/inferior lóbulos e subpleurais contra mais central) e doentes contra áreas saudáveis são necessários para avaliar o estado patológico do material humano do pulmão. O combustível humano gerado deve ser usado para a preparação de H & seções finas E manchas, que podem ser re-avaliadas por um patologista. Esse procedimento ajuda os usuários a ganhar prática em discriminar diferentes áreas doentes e locais dentro dos pulmões.
A Figura 3 apresenta os resultados de medição para a atividade LDH e WST-1 em PCLS humano após incubação de 24h com SLS. O controle não tratado médio sem SLS, mostrado a 0 µ g/mL SLS, é um importante controle de qualidade. Valores devem ser inferiores a 20% para LDH comparado com detergente-lysed tecido e > 0,7 unidades de absorvância para o ensaio de WST-1. Esses controles de qualidade também servir como indicadores de viabilidade do tecido insuficiente. Capacidade de resposta do tecido humano para a solução de detergente, como substância tóxica eficaz, deve ser incluída como controle positivo. Isso deve resultar em um aumento de 300-500% (> 2,0 unidades de absorvância) de LDH em comparação com tecidos não tratados e em valores < 0,1 unidades de absorvância para o ensaio de WST-1. SLS resultou em uma redução dose-dependente da viabilidade celular, medida pelo aumento da LDH e diminuição da atividade metabólica no WST-1 ensaio em concentrações > 87 µ g/mL. Um modelo de concentração-resposta sigmoide foi montado para os dados, para que seja possível calcular valores IC75 ou IC50. Esses valores posteriormente podem ser usados para selecionar as concentrações para níveis de citocinas e chemokine: em concentrações altamente tóxicas, geralmente não ou apenas a diminuição de citocinas e quimiocinas podem ser detectadas. Portanto, não-tóxico ou apenas ligeiramente tóxicas concentrações (IC75) são recomendadas. É importante notar aqui que o aumento esperado da atividade LDH no sobrenadante de cultura de pilha é muitas vezes influenciado pela substância aplicada21. Frequentemente, as interferências ocorrem entre a atividade de substância e a enzima, levando a erros de interpretação dos resultados se o ensaio LDH foi o ensaio de citotoxicidade única usado. Assim, é importante e necessário realizar diversos ensaios de citotoxicidade para obter resultados fiáveis e válidos. Além disso, deve ser mencionado que a sensibilidade dos ensaios LDH e WST-1 é altamente comparável.
Na Figura 4, imagens microscópicas viabilidade de PCLS demonstram capacidade de resposta do tecido humano para detergente como substância tóxica eficaz. Os resultados são muito úteis para confirmar outros dados de viabilidade, mas isso requer equipamento adicional. Efeitos tóxicos são avaliados visualmente pela avaliação do tecido de calceína-positivo em relação ao núcleo de células EthD-1-positivo. Segmentos escolhidos aleatoriamente dentro parênquima geralmente resultam em dados comparáveis, Considerando que vias aéreas ou vasos sanguíneos devem ser evitados, como cavidades maiores podem mudar os resultados. De nossa experiência e com as configurações microscópicas descritas acima, um volume entre 1,5 x 106 e 5 x 106 µm3 do tecido controle é medido. Os valores dependem de qualidade material de pulmão, a qualidade do combustível e também sobre a doença da doação de tecido de pulmão. Mesmo que a viabilidade do tecido pulmonar humano varia entre os doadores, o número de núcleos de células mortas, comparado com tecido viável não deve exceder 15% do controle do tecido. Se o núcleo de células mortas é predominantemente presente no controle de tecido, no entanto, o experimento deve ser abandonado.
A Figura 5 exibe dados representativos para o efeito imunomodulador de HClPt e SLS no tecido de pulmão humano. As citocinas pró-inflamatórias IL-1 α e TNF-α são biomarcadores de inflamação, indicando o início do processo inflamatório após a exposição ao estímulo de substâncias. Ambas as citocinas foram medidas por ELISA. Extracelular de IL-1 α é geralmente baixa em PCLS humana, Considerando que a IL-1 α intracelular atinge níveis de 1.000 pg/mL e acima. Uma diminuição intracelular de IL-1 α indica processos citotóxicos em curso - e principalmente é observada após exposição de PCLS humana a substâncias químicas. Se o tecido é estimulado com LPS, um ativador do sistema imunológico inato e como tal o tratamento positivo controlar, então a maior parte da IL-1 α induzido só pode ser detectado intracelular após 24 h. Em contraste, a secreção de TNF-α induzida pela estimulação de LPS pode principalmente ser medida extracelularmente. O uso de um adequado controlo positivo, tais como LPS, demonstra a validade de um método. Com o presente método de pesquisa, PCLS humanas foram expostos a três concentrações de HClPt (32, 64 e 125 µ g/mL) ou duas concentrações de SLS (1 e 10 µ g/mL) por 24 h. Cytokine secreção foi determinada como uma soma das citocinas extracelulares e intracelulares normalizados para as concentrações de proteína total, conforme representado na Figura 5. Vale ressaltar aqui que o ensaio BCA é geralmente utilizado para a determinação do teor de proteína total, no entanto, ele também reflete citotoxicidade induzida por substância. Daí, em concentrações altamente tóxicas o conteúdo de proteína total não pode ser usado para normalização dos dados de citocina. Secreção de IL-1 α aumentou significativamente de 263 ± 38 pg/mg para 887 ± 216 pg/mg e de TNF-α de 263 ± 38 pg/mg para 1.160 ± 286 pg/mg (Figura 5A, B). Além disso, a secreção de IL-1 α e TNF-α induzida por LPS é apresentada em comparação com um controle de tecido unstimulated. Indução de citocinas pró-inflamatórias por padrões moleculares associados patógeno, tais como LPS, demonstra a validade de um método e é altamente recomendada para ser usado quando estiver trabalhando com PCLS humana investigar efeitos imunomoduladores. Para mais detalhes sobre os dados HClPt e SLS, refira por favor o estudo por Lauenstein et al 21
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig1.jpg"> Figura 1 : Procedimento para pulmão humano material de enchimento. O pulmão humano é preparado imediatamente após a ressecção. O pulmão deve ser armazenado em temperatura ambiente para recheio consistente com agarose e para evitar a polimerização de agarose repentina durante o enchimento. O pulmão é posicionado horizontalmente, com os lóbulos espalhar-se para uma visão óptima do brônquio principal ou brônquios (A e B para closeup no brônquio). Os brônquios são canulados com um tubo flexível de silicone e fixados com braçadeiras (C). Após o enchimento procedimento e agarose polimerização no tecido, patologistas treinados o pulmão cortar fatias de sobre 3-5 cm de espessura (D). Destas fatias núcleos do tecido cilíndrico (Ø p. ex., 8 mm) são preparados com uma ferramenta de retirada do dielétrico (E). Estes núcleos de tecido são cortados com um cortador de tecido em combustível, que é imediatamente transferidos para meio-cheio de pratos de Petri para incubação em condições de cultura celular normal (E). Depois de várias etapas de lavagem a PCLS são transferidas para placas de cultura de células (por exemplo, placa de 24 com dois motores por bem e 500 µ l meio) para remover os restos de célula residual e mediadores celulares lançado (F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig2.jpg"> Figura 2 : Determinação do estado de saúde de PCLS humana pela coloração H & E. O combustível nesta imagem, preparado a partir de um doador com um tumor de pulmão, mostra do tecido pulmonar intacto com parênquima alveolar, periférica airways (*) e os vasos sanguíneos (setas) no (A) visão geral. A maior ampliação, conduzindo a vias aéreas com epitélio respiratório ciliado intacto (setas) (B), uma estrutura alveolar intacta forrado com pneumócitos viáveis, incluindo um capilar com numerosas hemácias (setas) (C), espaços alveolares contendo macrófagos alveolares (CD68 imuno-histoquímica) (D), bem como os vasos sanguíneos com endotélio intacto (CD31 imuno-histoquímica) (E) pode ser observada. Só o tecido livre de tumor foi usado para o combustível, é por isso que não há áreas macroscopicamente doentes são visíveis. Em contraste com PCLS preparados a partir de doadores com outras doenças pulmonares, como enfisema ou fibrose, a estrutura alveolar não é interrompida e o combustível é apenas ligeiramente desfiado na fronteira externa, provavelmente devido as etapas de preparação. Escala barras indicam (A) de 1.000 µm e 50 µm (B–E), respectivamente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig3.jpg"> Figura 3 : Determinação da citotoxicidade induzida pelo SLS em PCLS humano, medido pelo vazamento da enzima LDH em meio de cultura (A) e perda da atividade da enzima metabólica avaliada com o corante WST-1 (B). PCLS humanas foram expostas a concentrações crescentes de SLS. Um modelo de concentração-resposta sigmoide posteriormente foi montado para os dados, para que os valores IC75 ou IC50 (concentração inibitória na redução de 25% e 50% de viabilidade celular) podem ser calculadas (figuras certa). Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 3-5. Absorvância do ensaio LDH foi medida em 492 nm (referência em 630 nm) e do ensaio WST-1 a 450 nm (referência em 630 nm). Os dados foram adaptados e modificados de Lauenstein et al 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig4.jpg"> Figura 4 : Imagens representativas da tridimensional microscópica prestação manchando e imagem da humana PCLS. Tecido vivo controle e capacidade de resposta do tecido ao detergente, como substância tóxica eficaz, são mostrados após coloração de PCLS humana com calceína AM (amarelo) e EthD-1 (vermelhos). Pilhas de 30 µm foram tiradas com um objectivo de X 10 (A) e processadas (B). Barra de escala indica 100 µm. excitação comprimentos de onda 488 nm e 543 nm, emissão filtros BP 505-550 nm e LP 560 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig5.jpg"> Figura 5 : Hexachloroplatinate de amónio (HClPt)-induzido a secreção de IL-1 α e TNF-α no PCLS humana após exposição de 24 h. PCLS foram expostas a concentrações de três (125 µ g/mL de HClPt, 64 µ g/mL e 32 µ g/mL) e duas concentrações diferentes (1 µ g/mL e 10 µ g/mL) de SLS. Extracelular e intracelular, IL-1 α (A) e (B) de TNF-α foram determinados por ELISA e normalizada para o teor de proteínas totais. Para mostrar a validade do método um positivo ativador do sistema imunológico inato, LPS, é mostrado como uma referência para o intracelular IL-1 α (A) e para a liberação de TNF-α (B) extracelular, normalizado para o teor de proteínas totais. Os dados são apresentados como média ± SEM, *p < 0,05 e * * *p < 0,001; HClPt e SLS: n = 9, IL-1 αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 em duplicatas técnicas (teste de Mann-Whitney). Esta figura foi modificada de Lauenstein et al 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig1.jpg"> Complementar Figura 1: detalhado processamento computacional para imagens de viabilidade microscópica coloração usando software de renderização. Passo a passo procedimento operacional para análise de imagem de imagens carregadas de LSM para processamento de superfície de tecido viável manchadas de calceína (A–G, eu) e detecção local de núcleos de células manchadas homodímero ethidium (H, J–M). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig2.jpg"> Complementar Figura 2: visão geral de análise de imagem computacional de viabilidade microscópica coloração do tecido pulmonar humano. Tecido viável (amarelo) foi analisado pelo processamento de superfície (B–eu) e núcleo de células mortas (vermelho) foram detectado por detecção pontual (J–P). O modo de instantâneo foi usado para exportar a imagem (Q). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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