Name: assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices
Uploaded: 2018-05-09T13:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices at JoVE.com

Lan Lauenstein insan PCLS ile risk değerlendirmesi için alternatif test stratejileri ile ilgili ön onun iş için teşekkür etmek istiyorum. Bazı araştırma bir hibe 6inci çerçeve programı SENS-BT-IV "Roman test stratejileri alerjenler Vitro değerlendirilmesi için" içinde Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen.

<ol>
	<li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+change,+air+pollution+and+extreme+events+leading+to+increasing+prevalence+of+allergic+respiratory+diseases.">Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases.</a> Multidiscip Respir Med. 8 (1), 12 (2013).</li><li>Pawankar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+world+allergy+report+2008:+allergy+and+chronic+respiratory+diseases.">State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases.</a> World Allergy Organ J. 1 (6), 4-17 (2008).</li><li>Hartung, T., Daston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+in+vitro+tests+suitable+for+regulatory+use.">Are in vitro tests suitable for regulatory use.</a> Toxicol Sci. 111 (2), 233-237 (2009).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+for+the+twenty-first+century.">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460 (7252), 208-212 (2009).</li><li>Balls, M., Straughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+Rs+of+Russell+&amp;+Burch+and+the+testing+of+biological+products.">The three Rs of Russell &amp; Burch and the testing of biological products.</a> Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).</li><li>Sewald, K., Braun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunotoxicity+using+precision-cut+tissue+slices.">Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices.</a> Xenobiotica. 43 (1), 84-97 (2013).</li><li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+lung+slices+in+toxicology.">The use of human lung slices in toxicology.</a> Hum Exp Toxicol. 13 (7), 466-471 (1994).</li><li>Ressmeyer, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+guinea+pig+precision-cut+lung+slices:+comparison+with+human+tissues.">Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues.</a> Eur Respir J. 28 (3), 603-611 (2006).</li><li>Donovan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+elicits+in+vitro+relaxation+in+airways+and+precision+cut+lung+slices+from+a+mouse+model+of+chronic+allergic+airways+disease.">Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (10), 1219-1228 (2015).</li><li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+spleen+tyrosine+kinase+attenuates+IgE-mediated+airway+contraction+and+mediator+release+in+human+precision+cut+lung+slices.">Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices.</a> British journal of pharmacology. 173 (21), 3080-3087 (2016).</li><li>Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomorphometric+analysis+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-pulmonary+arteries+using+murine+precision+cut+lung+slices.">Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices.</a> J Vis Exp. (83), e50970 (2014).</li><li>Lamb, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bl+1002494,+a+Novel+Potent+and+Selective+Oral+Spleen+Tyrosine+Kinase+Inhibitor,+Displays+Differential+Potency+in+Human+Basophils+and+B+Cells.">Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells.</a> J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 554-561 (2016).</li><li>Leus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC+3-selective+inhibitor+RGFP966+demonstrates+anti-inflammatory+properties+in+RAW+264.7+macrophages+and+mouse+precision-cut+lung+slices+by+attenuating+NF-kappaB+p65+transcriptional+activity.">HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity.</a> Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).</li><li>Schleputz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurally+mediated+airway+constriction+in+human+and+other+species:+a+comparative+study+using+precision-cut+lung+slices+(PCLS).">Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS).</a> PLoS One. 7 (10), 47344 (2012).</li><li>Hess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalidation+of+the+ex-vivo+model+PCLS+for+prediction+of+respiratory+toxicity.">Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).</li><li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-induced+calcium+signaling+and+contraction+of+airway+smooth+muscle+cells+in+lung+slices.">Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices.</a> J Gen Physiol. 119 (2), 187-198 (2002).</li><li>Wohlsen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+allergic+response+in+small+airways+of+human+precision-cut+lung+slices.">The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 21 (6), 1024-1032 (2003).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+H3N2+and+H1N1+influenza+virus+infection+in+a+human+lung+organ+culture+model.">Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model.</a> Virology. 396 (2), 178-188 (2010).</li><li>Zmora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-human+primate+orthologues+of+TMPRSS2+cleave+and+activate+the+influenza+virus+hemagglutinin.">Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin.</a> PLoS One. 12 (5), 0176597 (2017).</li><li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation.">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (5), 876-881 (2014).</li><li>Lauenstein, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunotoxicity+induced+by+chemicals+in+human+precision-cut+lung+slices+(PCLS).">Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS).</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28 (4), 588-599 (2014).</li><li>Wild, L. G., Lopez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+asthma+caused+by+high-molecular-weight+substances.">Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances.</a> Immunol Allergy Clin North Am. 23 (2), 235-250 (2003).</li><li>Di Stefano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occupational+asthma+due+to+low+molecular+weight+agents.">Occupational asthma due to low molecular weight agents.</a> Int J Immunopathol Pharmacol. 17 (2), 77-82 (2004).</li><li>Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+assessment's+insensitive+toxicity+testing+may+cause+it+to+fail.">Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail.</a> Environ Res. 135, 139-147 (2014).</li><li>Boverhof, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+sensitization+and+allergy:+current+research+approaches+and+needs.">Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 226 (1), 1-13 (2008).</li><li>Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GARD+assay+for+assessment+of+chemical+skin+sensitizers.">The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27 (3), 1163-1169 (2013).</li><li>Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thickness+estimation+of+fluorescent+sections+using+a+CSLM.">Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM.</a> Journal of Microscopy. 184 (2), 106-116 (1996).</li><li>Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+Mouse+Lung+Slices+to+Visualize+Live+Pulmonary+Dendritic+Cells.">Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li><li>Switalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+innate+cytokine+response+to+immunomodulators+and+adjuvants+in+human+precision-cut+lung+slices.">Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 246 (3), 107-115 (2010).</li><li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices.">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li><li>Niehof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+isolation+from+precision-cut+lung+slices+(PCLS)+from+different+species.">RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species.</a> BMC Res Notes. 10 (1), 121 (2017).</li><li>De Proost, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signaling+in+the+pulmonary+neuroepithelial+body+microenvironment+unraveled+by+live+cell+imaging.">Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging.</a> FASEB J. 23 (4), 1153-1160 (2009).</li><li>Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+of+Remnant+Human+Lung+Tissue+for+Mechanical+Stretch+Studies.">Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies.</a> Cell Mol Bioeng. 6 (2), 175-182 (2013).</li><li>Watson, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Chemical+Toxicity+Using+Cryopreserved+Precision+Cut+Lung+Slices.">Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices.</a> Toxicol Sci. 150 (1), 225-233 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok. Fraunhofer madde bir bağımsız devlet kar amacı gütmeyen araştırma uygulamalı araştırma, biyoteknoloji, ilaç, kimya ve kozmetik sanayi adına sözleşme araştırma organizasyondur. Enstitüsü finansman ulusal ve uluslararası kamu projelerden gelir.

İnsan PCLS bizim laboratuvarda iyi kurulmuş bir tekniktir. Mevcut kağıt bu tekniği ve akciğer doku ex vivomaddelerin toksisite testleri için kullanımı bir açıklamasını verir. Genel olarak, bu teknik bir tahlil ayarlamak için aramak gerekir kullanarak herhangi bir laboratuvar ölçülebilir aralıkları tanımını, tahmin variabilities ve kalite deneme geçerliliğini garanti denetimlerin ilgili. Mümkün Standart prosedürler olabilir, örneğin, her bir son nokta, örneğin, sitotoksisite tahlil üç biyolojik bağış (bireysel metinler) en az iki ya da üç teknik çoğaltır pozitif de dahil olmak üzere örnek başına en az yinelenecek ve negatif başvurular. Laboratuar personeli tahlil tutarlılığını artırmak ve tahlil değişkenlik en aza indirmek için eğitim.
Sık akciğer dokusu üzerinde maddeler immunomodulatory etkilerini değerlendirmek için kullanılan bitiş noktaları dahil sitotoksisite farklı deneyleri (örneğin, karaciğer tahlil, WST-1 tahlil, tahlil boyama mikroskobik) kullanarak ölçüleri, sitokin yayın deneyleri, de gibi değişiklikleri ifade profil ve immunohistopathological yöntemleri6hücresel nüfus değişiklikleri karakterizasyonu. Ayrıca, orada da insan PCLS için transfer edilebilir ve böylece daha önce hücresel kompozisyon gösteren daha ayrıntılı bilgilere sağlayabilir fare PCLS28 , pulmoner dendritik hücreleri gibi hücrelerin görselleştirme açıklayan teknikleri ve sözde sitotoksik maddelerle tedaviden sonra.
Bu temel Protokolü ve insan Akciğer doku bölümleri hazırlanması için teknik yayınlar29de tarif edilmiştir teknikleri karşılaştırılabilir. Kısacası, organ malzeme cerrahi rezeksiyon veya nakli geçmesi gibi akciğer kanseri, kronik hastalıkların canlı tehdit eden acı hastalar elde edilir. Çalışmalar yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir. Hastaların bilinçli yazılı izni gereklidir. Bir iş akışı arasında klinik ve laboratuar kurma kritik bir konudur ve iletişim ve arabirimleri ve her iki site arasında altyapı tanımını gerektirir. Doğrudan rezeksiyon canlılığı doku korumak için sonra işlenmek üzere insan akciğer malzeme vardır. İnsan PCLS için burada açıklanan tekniği hem genç ve yaşlı akciğerler ve sağlıklı ve hastalıklı akciğer uygulanabilir kayda değer olduğunu. Örneğin, ABD'de, kazalarda ölen veya kimin organ nakli için reddedilmiştir sağlıklı organ bağış akciğerler elde etmek mümkündür.
İlk kritik adım protokolündeki airways ve özel çözüm ile çevredeki parankimi enflasyon olduğunu. Bu adım sonraki Dilimleme yordam için çok yumuşak doku kuvvetlendirmek gereklidir. Hastalık özgeçmişlerine dayalı insan akciğer malzeme kalitesi ve burada önemlidir. Sadece loblar sağlam plevra ile doldurulabilir. Bronş yakınındaki son aşama tümörler bazen doldurma işlemi önlemek. İnsan malzeme şişirme önce özel çözüm sıcaklığını iyice kontrol edilmesi gerekiyor. Çok fazla kan (veya diğer sıvıları, exudates) insan içinde Akciğer doku özel istenmeyen seyreltme içinde neden olur ve polimerizasyon süreci etkileyecektir. Enflasyon akciğer dokusunun ve özel buz üzerinde gelling sonra akciğerler 200-300 µm kalınlık bölümlere kesilir. Tutarlılık dokusunun çok kritik bir konudur. Doku çok yumuşak ise, eşit bölüme Dilimleme zordur. Aynı microtome parametreleri her donör, bağışçılar arasında dilim kalınlığı değişebilir için ayarlanır, nedeniyle bireysel koşullar ve Şişirme sırasında değişiklikleri her akciğer için işlenmesi halinde bile. İnhomogeneous dolgu dokusunun farklı dilim kalınlıklarda neden olur. Ölçme ve dilim kalınlığı standartlaştırılması yerine toplam protein içeriği ölçümü dolaylı olarak akciğer dilim kalınlıkları izlemek için kullanılabilir. Dilimleme işlemi birkaç son aşama hastalıkları engel; örneğin, kan damarları son derece pulmoner hipertansiyon ve fibrotik doku kalınlaşmış-ebilmek var olmak çok sert doku silindir Dilimleme pek mümkün ve microtome bıçak çok sık değiştirilmesi gerekir.
İnsan PCLS ve adımları yıkama yoğun hazırlanması sonra hangi hücre artıkları kaldırmak için gerekli ve enzimler, doku bölümleri deneyler29için kullanılabilir serbest. İnsan PCLS normal hücre kültür koşullar altında kültürlü ve, örneğin, kimyasallar, uyuşturucu veya lipopolisakkaritler maruz. PCLS ara sıra kirlenme (bilinmeyen) enfeksiyonlar nedeniyle kültür insan akciğer malzemenin özel bir sorundur. Doku enfeksiyonları gösterilen kültürler atılmalıdır ve ekipman iyice dezenfekte gerekir. Bir yandan hazırlık için kullanılan Laboratuvar yerleri ve kültür arasında kayma ayrılık diğer taraftan çapraz-enfeksiyonları önlemek için yardımcı olabilir. İle ilgili ekipman, microtome kaçak ve gevşek onaltılık vida motor hasar ve bıçak hareketi durdurmak için neden olabilir. Dilimleyici her parçası paslanmaz çelikten imal edilmiştir ve çok o okside değil kurutulmuş Eğer hemen temizlik alter. Donanım sorunları aşmak için en az bir yedek aygıtı gerekli olabilir.
Önceki yayınlarda, özel yıkanması bildirdi ve yoğun adımları hazırlık sonra yıkama sırasında kaldırıldı. Aslında, bu mümkün değildir, özel kaldırılamaz. Özel tamamen kaldırılması için doku yok edeceğini yüksek sıcaklıklarda yeniden erimiş olması gerekir. Alveoller ve havayolları özel tarif bitiş noktaları ile karışmaz. Diğer bitiş noktaları özel varlığı ile etkilemiş (Ayrıca bkz: sınırlamalar). Doku canlılığı kültür kritik bir konu olduğu gibi vurguladı çok taze doku bölümleri hazırlamak için ihtiyaç vardır. Bronchoconstriction canlılık için geçerli bir parametre değil. Çevredeki parankimi canlılığı kontrol etmek için en az iki ya da üç bağımsız sitotoksisite deneyleri kullanmanızı öneririz; Bunun her deneme30' u kontrol edilmesi gerekiyor. Sitotoksisite deneyleri kalite denetimlerde yetersiz doku canlılığı göstergeleri olarak hizmet vermektedir. Bu nedenle, tüm sitotoksisite deneyleri bir deterjan gibi etkili bir toksik madde dokusunun, örneğin, yanıt verme becerisini değerlendirmek için önerilir. Doz-yanıt eğrileri üzerinde bağlı olarak, minimum ve maksimum değerleri emme sitotoksisite deneyleri için tanımlanmış olması gerekir ve sonraki deneyler için bir araya geldi. Protokol daha fazla değişiklikler çoğunlukla uygulamalı kimyasallar ve bitiş noktaları ilgi bağlıdır. Çözünmez ya da büyük ölçüde reaktif kimyasallar uygulanabilirliği sınırlıdır. DMSO için en yüksek çözücü konsantrasyonu % 1'e sınırlıdır. Daha yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir ancak belirgin serbest bırakmak-in Il-8 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin neden olabilir. Öte yandan, kullanılan uyarıcı nispeten zayıf olabilir. Bu durumda, 2-iyi başına dört dilim doku miktarı artırılabilir. Bu yaklaşım 24 h canlılığı sınırlar.
Bir büyük insan PCLS Almanya'da onlar sadece hastalıklı insan akciğer malzemeden hazırlanabilir olduğunu kısıtlamasıdır. Hastalar ameliyat normalde 50 yaşından büyük ve akciğer kanseri muzdarip hastaların % 80'i ya da sigara içenler eskiden. Gibi sebepler, hastaların ilaç da insan dokusu kullanarak deneyler sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, için esastır: doğrulamak i) her deney canlılığı, işlevsellik ve bireysel doku hassasiyeti doğrulama olumlu referanslar ve II) çapraz doğrulamak sağlıklı, hastalıklı olmayan, orta yaş akciğer dokusundan kullanarak sonuçları Laboratuvar hayvanlarının (cynomolgus gibi insan dışı primatlar ve mümkünse, fare, sıçan, eskiden şiling şimdi domuz). Hastalıklı dokuların daha iyi patoloji puanı daha iyi deneysel sonuçlar. Ağır hastalıklı doku-ebilmek var olmak kullanılmış çok zor ve çok sık gösterir canlılığı, yeterli ölçüde düşük veya çok yüksek sitokin düzeyleri, bakteriyel veya mantar enfeksiyonları ve daha az bronchoconstriction sınırlı. Donör donör varyasyon daha yüksek insanlar bireysel çeşitliliği yansıtan laboratuvar hayvanlardan elde edilen sonuçlar karşılaştırılır. Bu, ancak, bir sınırlama genel değildir; gibi yukarıda, diğer ülkelerde (örneğin, ABD) sağlıklı akciğerler nakli için reddetti vefat eden organ bağış elde etmek mümkündür. Yanıt dokusunun de akut maruz kalma deneylerde 48 h ilk kadar tarif edilmiştir. Canlılığı ve işlevselliği doku kültürünün birçok gün sonra veya depolama-80 ° C'de sonra azalır Kültür insan Akciğer doku için yaklaşık 14 gün kadar mümkündür. Canlılık bu süre içinde devam ediyor; Ancak, sınırlı sitokin yayın mitogens karşılık olarak sonuçlanan değişkenlik yanı sıra doku makrofajlar gibi birkaç hücre popülasyonlarının işlevsellik kaybı bir artış görülmektedir. Bir bitiş noktası için başka sınırlama dokusunda, örneğin, RNA31 yüksek kaliteli ve yeterli miktarda yalıtım veya tek hücre süspansiyonlar hazırlanması için sonraki Akış Sitometresi engelleyen özel varlığıdır ve hücre fenotipleme. Mekanik yorumlara tek hücreli yanıt ve işlevselliği elde etmek için olasılık böylece sınırlıdır.
Organotypic doku modelleri, insan PCLS gibi temel ve klinik olmayan araştırma üzerinde yüksek bir etkisi olarak kabul edilir. İnsan akciğer malzeme normal organ mimarisi en benzer biçimde yansıtan bir biyolojik kompozisyon vardır. Bu, örneğin, konut alveoler ve bronş epitel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri, sinir lifleri ve makrofajlar içerir. Uygun doku ve hücreler çeşitli uyaranlara cevap. Sinir lifleri, her ne kadar yerel olarak aktif, terminal refleks yanıt14' e lider, kes. Sonuç olarak, bu ex vivo model hücresel doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, savunma yanıt, sinyal sitokin ve indüksiyon hücre yüzey işaretlerinin çalışma imkanı sunuyor. Birkaç geliştirme tekniği, kültür ve geçerlilik bitiş noktalarının translasyonel bilimde insan PCLS kullanılsın. Gelecekteki yaklaşımlar örnekleri şunlardır: i) doğrulanmasını yeni hedefler insan akciğer dokusunda, bağışıklık yanıtı pozlama sonra bir değerlendirme II) Örneğin, kimyasallar, ilaçlar, nano tanecikleri, vb, III) takviyesi ile bağışıklık hücreleri, akciğer dokusunun böyle T-lenfositleri, IV) olarak kimlik ve solunum sensitizers, hastalık-inducing maddeler veya aktif bileşikler yollar; inhibe maruz kaldıktan sonra örneğin, moleküler kalıplarının değiştirilmesi Ayrıca, v) hava yolu remodeling ve VI) nöronal Yönetmeliği32. Bilimsel alan bu mevcut ve gelecekteki yaklaşımları PCLS ile ilgileniyor. Buna ek olarak, PCLS tekniği cryo-koruma20ve nefes alma sırasında veya mekanik doku doğal hareketini taklit etmek için33 uzanan doku gibi geliştirmek için yardımcı olacaktır farklı gelişmeler çeşitli vardır Havalandırma.
İnsan PCLS diğer 3D modelleri ile karşılaştırıldığında en büyük avantajı bağışıklık hücreleri ve sinir lifleri varlığıdır. Deneyler, fare, sıçan ve hala en sık Farmakoloji ve toksikoloji kullanılır hayvan türü olan insan dışı primatlar da gerçekleştirilebilir. İnsan Akciğer doku karmaşıklığı sonuçları hayvan insana ve vitro vivo içindeiçin çeviri destekler. Solunum sensitizers tanımlanması için varolan alternatif deneyleri bağlamında insan PCLS çok karmaşıktır ve tek hücre yanıt anlayışlar izin vermez. Henüz, doğru hücresel işaretçiyi birlikte, örneğin, Apoptozis, nekroz veya hücre içi işaretleri ile kullanılırsa mikroskobu ve Akış Sitometresi hücresel yanıt hakkında bilgi verebilir. Doğrulanmış ve solunum sensitizers tanımlanması için kullanılan rapor yayımlanmış deneyleri vardır. Ancak, tek hücreli deneyleri kendi avantajları PCLS kullanımıyla gelişmeler değerli katkıları teknik yüksek üretilen iş tarama için kullanılabilir anlamda Watson ve ark. tarafından açıklandığı gibi yapıyoruz 34 onlar fare cryo korunmuş PCLS hava yolu toksisite tahmin etmek için bir yüksek-den geçerek tarama tahlil geliştirilmiştir. Minyatür onların 96-şey PCLS biçimiyle, PCLS uygun bir yüksek-den geçerek tahlil yapma fare lavaj sıvı içinde benzer sonuçlar tespit etmişler.

Alerjik astım, mesleki astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), Amfizem ve üst ve alt solunum yolları enfeksiyonları gibi solunum yolu hastalıkları artmaktadır ve dünya çapında sağlık yük1,2temsil eder. Uygun test sistemleri, bazı uygun maddelerden test ve geliştirme ek olarak bu hastalıkların altında yatan temel mekanizmaları belirlemek için gereklidir. Temel araştırma yanı sıra preklinik ilaç geliştirme vitro veya vivo içinde deneyleri elde sonuçları üzerinde duruldu. Bu deneyleri, ancak, kendi sınırlamaları3var. İlk olarak, vitro deneyleri izole ve bitişik doku veya organ kaldırılması insan hücreleri kullanmak ve böylece artık ile etkileşim veya diğer hücreleri3tarafından korunuyor edebiliyoruz. İkinci olarak, hayvan modelleri insan fizyolojisi ve biyokimyasal farklılıkları gidermek4farklılıklar nedeniyle çevrilebilir değildir. Bu sınırlamalar, en aza indirmek için ve 3Rs bağlamında (değiştirme, arıtma, azaltma) ilke5, yeni alternatif modeller sürekli gelişen.
Alternatif insan 3D doku modelleri, PCLS gibi insan tabanlı vitro ve karmaşık hayvan vivo içinde modelleri arasında bir bağlantı vardır. PCLS solunum yolu6' mevcut tüm ilgili hücre tipleri ile fonksiyonel heterojenite yansıtır. Ayrıca, PCLS teknik birkaç ince dilimler kesin kalınlıkta bir tek hayvan veya insan doku donörden tekrarlanabilir hazırlanması bir avantaja sahiptir. Bu bir iç kontrol yanı sıra farklı konsantrasyonlarda izin verir veya test edilecek uyuşturucu.
İnsan akciğer agar dolu dilimleri Fisher ve ark. tarafından 1994 yılında ilk giriş beri 7 dilimleme ve akciğer dokusunun kültür için teknik önemli ölçüde geliştirilmiştir. Christian Martin vd. Bu teknik daha fazla kimyasal ve farmakolojik uygulamaları8için iyileştirilmiştir. Grubumuz bu teknik için 2007 yılında Christian Martin tarafından kullanılmaya başlandı. O zamandan beri PCLS uygulama araştırma fonksiyonel tepkileri, gibi hava yolu9,10 ve vazokonstriksiyona11, immünolojik, farmakolojik12,13test dan genişletmiştir, ve toksikolojik7 çeşitli türlerin birkaç laboratuarlarında test. Örneğin, Schlepütz vd. 14 hava yolu yanıt türler farklılıklar için araştırdık ve periferik nöron harekete geçirmek elektrik alanı stimülasyon (EFS) veya kapsaisin farelerde, sıçanlar, karşılaştırıldığında eskiden şiling şimdi pigs, koyun, marmosets ve insanlar. Sinir-aracılı bronchoconstriction farklı ama farklı desenler için çeşitli türler bulundu ve yaygın olarak kullanılan Laboratuvar hayvanlarının (fare ve sıçanlar) her zaman insan yanıt yansıtmaz sonucuna vardı. Akciğer toksisite test etmek ve bu bağlamda, Hess vd. hayvanlarda sayısını azaltmak için 15 sıçan PCLS inhalasyon toksisite araştırmaları için ex vivo alternatif olarak önceden doğrulanmış. PCLS umut verici sonuçlar ile kullanarak iki tahmin modelleri geliştirilmesi çok merkezli bu ön doğrulama çalışma sonuçlandı.
Ayrıca, temel araştırma, PCLS16, erken Alerjik yanıt-e doğru17ve viral enfeksiyon yanıt-e doğru18,19sinyal kalsiyum aydınlatmak için kullanılmıştır. Teknik ilerleme devam ediyor ve daha da ileri incelenmiştir. Örneğin, alan insan dokusu yararına depolama ve yeniden donmuş doku tarafından artmaktadır. Rosner ve ark. açıklanan donma ve solunum yolları stimülasyon sözleşme yeteneğini korur fare PCLS çözme tekniği: Bu nedenle, sınırlı bir süre pencerenin içinde doku kalır uygun ve çok daha fazla teknik uzatır deneyleri zamanla aynı donör20' ye uygulanır. Ek olarak bu araştırma gelişmeler, Lauenstein vd. 21 son zamanlarda insan PCLS mesleki astım için potansiyel sensitizers olarak hareket çeşitli kimyasal risk değerlendirmesi araştırıldı.
Mesleki astım belirtileri olan hava akımı tıkanma ve hava yolu hyperresponsiveness, Alerjik astım için benzer, yüksek molekül ağırlıklı (HMW)22 veya düşük molekül ağırlıklı (LMW) maddeler23 maruz kalma tarafından indüklenen (Örneğin , Platin bileşikleri) işyeri ortamında. LMW ajanlar anhidridler oluşturan yüksek Sensitizasyonu potansiyel var ve taşıyıcı proteinler21' e bağlanın. Yeni HMW veya LMW kimyasalların kayıt gerektiren içinde in vitro ve in vivo risk değerlendirmesi ile ilgili potansiyel onların sözde Sensitizasyonu (örn., OECD kılavuz 429)24. Olsa orada görünüyordu bazı uyum için küçük bir alt kümesi maddeler25 potansiyel, sözde Sensitizasyonu belirlemek için kullanılan testler ancak, aslında solunum sensitizers, risk değerlendirmesi, ama iletişim sensitizers için tasarlanmamıştır . Lauenstein ve ark. eseri Sens-BT-IV, Avrupa Birliği projesi kapsamında risk değerlendirmesi sözde temas veya akciğer sensitizers21için alternatif test stratejileri geliştirmek için tasarlanmıştır. Bu proje için biz insan PCLS kullanılabilirlik alternatif bir test aracı olarak test üzerinde duruldu. Bu nedenle, immunomodulatory bitiş noktaları (örneğin, canlılık ve sitokin salgısının) bir dizi LMW Platin bileşikleri gibi kimyasal maddelerin tahriş edici veya inflamatuar potansiyelini belirlemek üzere seçildi. Lauenstein için tüm solunum sensitizers uygulanabilir genel yok desen bulundu vd. ; Ancak, işlerini Vakfı kısa bir süre önce protokolleri26için sağlanan.
Özetle, burada hazırlık ve insan PCLS sonraki maruz kalma için sunulan Protokolü potansiyel akciğer toksik değerlendirilmesi ve/veya solunum gelişiminde dahil immunomodulatory maddeler için yararlı bir yöntem sağlar Mesleki astım gibi hastalıkların.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1373px;" width="1373">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silicon hose 3.0 x 5.0 mm</td>
			<td style="width:471px;">A. Hartenstein (Leipzig, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">SS04</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Syringe</td>
			<td style="width:471px;">Faust Lab Science (Klettgau, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">9.410 050</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Coring tools</td>
			<td style="width:471px;">custom-made</td>
			<td style="width:317px;">custom-made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blade Handle (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205530001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trimming Blades (FEATHER)</td>
			<td style="width:471px;">pfm medical ag&#160; (Cologne, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">205500000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome: Tissue Slicer</td>
			<td style="width:471px;">Alabama R&#38;D (Bad Homburg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">303400-ADPT</td>
			<td style="width:227px;">Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:471px;">Wilkinson Sword (Solingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">ENR-4027800011506</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tissue culture dishes</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z666246-420EA</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell strainer filter (100 &#181;m Nylon)</td>
			<td style="width:471px;">Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">BD352360</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Inoculation loop</td>
			<td style="width:471px;">Copan Diagnostics (Murrieta, USA)</td>
			<td style="width:317px;">&#160;CD176S01</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TPP Tissue culture plates 24wells</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">Z707791-126EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cassette</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>1000957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MaxiSorp flat-bottom</td>
			<td style="width:471px;">Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nunc MicroWell 96-Well&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">260836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Confocal LSM Meta 510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Image rendering software</td>
			<td style="width:471px;">Bitplane AG (Z&#252;rich, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">IMARIS 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LSM Image Browser</td>
			<td style="width:471px;">Zeiss (Jena, Germany)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Multiwell-Reader</td>
			<td style="width:471px;">Tecan Group Ltd. (M&#228;nnedorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:317px;">Tecan infinite F200Pro</td>
			<td style="width:227px;">Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Plate shaker</td>
			<td style="width:471px;">Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">KM-2 Akku</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">BenchMark ULTRA</td>
			<td style="width:471px;">Ventana Medical Systems (Tucson, USA)</td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;">Automated IHC/ISH slide staining system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Assays</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644807001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td style="width:471px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td>11644793001</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:359px;">Microscopical vitality staining&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Invitrogen (Carlsbad, USA)</td>
			<td>L-3224</td>
			<td style="width:227px;">LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:471px;">Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ELISA assay kit</td>
			<td style="width:471px;">R &#38; D systems</td>
			<td>various, e.g. DY210 (TNF-&#945;) or DY200 (IL-1&#945;)</td>
			<td style="width:227px;">DuoSet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Reagents</td>
			<td style="width:471px;"></td>
			<td style="width:317px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarose, low gelling temperature&#160;</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9414-100G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle&#8217;s Balanced Salts (EBSS)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td>E2888-500ML</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td>17-602E</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)</td>
			<td style="width:471px;">Gibco (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>11039-047</td>
			<td style="width:227px;">Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dulbecco&#180;s Phosphate with Ca and Mg (DPBS)</td>
			<td style="width:471px;">Lonza (Verviers, Belgium)</td>
			<td style="width:317px;">BE17-513F&#160;&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (M&#252;nchen, Germany)</td>
			<td style="width:317px;">A9647-500G</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Detergent</td>
			<td style="width:471px;">Sigma (Saint Louis, USA)</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td style="width:227px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Washing buffer</td>
			<td style="width:471px;">Merck (Darmstadt Germany)</td>
			<td>524653</td>
			<td style="width:227px;">&#160;0.05% Tween 20 in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the cytotoxic and immunomodulatory effects of substances in human precision-cut lung slices

Onların geniş çeşitlilik solunum hastalıkları uygun model sistemleri temel mekanizmaları anlamak ve yeni tedavi gelişimi etkinleştirmek gerekir. Ayrıca, kayıt, yeni maddelerin uygun risk değerlendirmesi bireylerin, örneğin, çalışma ortamında zarar riskini önlemek için yeterli test sistemleri ile gerektirir. Bu tür risk değerlendirmeleri genellikle hayvan çalışmaları yapılmaktadır. 3Rs prensip ve hayvan deneyleri karşı kamu şüphecilik içinde görüş-in gibi hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS), insan alternatif yöntemler gelişen. Mevcut kağıt amonyum hexachloroplatinate (HClPt) gibi düşük moleküler ağırlıklı maddeler immunomodulatory potansiyelini çalışmaya insan PCLS ex vivo teknik anlatılmaktadır. Ölçülen bitiş noktaları canlılığı ve yerel solunum inflamasyon, sitokinler ve kemokinler değişmiş salgılanmasını tarafından işaretlenmiş bulunmaktadır. Pro-inflamatuar sitokinlerin, tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve İnterlökin 1 alfa (IL-1α) anlamlı bir artış içinde insan PCLS HClPt alt toksik konsantrasyon maruz kaldıktan sonra. PCLS tekniği önemli ölçüde son on yıl içinde optimize edilmiş olsa bile, immunomodulation test için onun uygulanabilirliği hala gelişme olduğunu. İnsan PCLS potansiyel değerli bir araç solunum araştırmada gösteriyorlar olsa bile bu nedenle, burada sunulan ön, sonuçlarıdır.

Mevcut araştırma yöntemi ile insan PCLS hazırlanan ve beş insan akciğer malzeme kimyasal olarak indüklenen immunomodulatory etkileri değerlendirmek için endüstriyel maddeler konsantrasyonları maruz. 24 h toksisite için kalıcı kültür tarafından yayımlanan karaciğer, mitokondrial faaliyet ve mikroskobik canlılığı boyama ölçüm değerlendirildi gibi Akciğer doku batık koşullar altında maruz kalmış. Buna ek olarak, normalleştirme ve pro-inflamatuar sitokinlerin için toplam protein içeriği ölçülür. Mümkün olduğunda, inhibitör konsantrasyon (IC) 75 değerler doğrusal olmayan sigmoidal eğri uydurma tarafından hesaplanır. Olumlu referans maddeler, doğuştan gelen sitokin yanıt için sitotoksisite ve LPS için deterjan her çalışması doğrulamak için kullanılmıştır. Logaritmik olarak dönüştürülmüş IC75 [µM] değerleri (günlük IC50) sonraki sitokin yayın ölçülerini "tahriş edici" konsantrasyonları kullanılmıştır.
Şekil 1 ve Şekil 2 insan akciğer malzeme ve örnek H & E boyama insan PCLS doldurma yordamı gösterir. Rutin hijyenik prosedürleri sağlık üzerinde olumsuz etkileri önlemek ve insan akciğer malzeme işleme personel güvenliği sağlamak için takip edilmesi gerek. Teknik personel eğitimi ve pratik gerektirir. Deneyimli farklı bölgeleri (üst/alt LOB ve subpleural karşı daha fazla orta) ayırt patologlar ve hastalıklı karşı sağlıklı alanları insan akciğer malzeme patolojik durumunu değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Oluşturulan insan PCLS H & bir patolog tarafından yeniden değerlendirilebilir E lekeli ince bölümler hazırlanması için kullanılmalıdır. Bu yordamı kullanıcıların ayrımcılık farklı hastalıklı alanlarda ve akciğerlerin içindeki konumları pratikte elde yardımcı olur.
Şekil 3 karaciğer ve WST-1 etkinliği için ölçüm sonuçları 24 saat kuluçka SLS ile sonra insan PCLS sunar. SLS, 0 µg / mL SLS, gösterilen olmadan tedavi edilmezse orta kontrol önemli bir kalite kontrol var. Değerleri için karaciğer deterjan lysed doku ile karşılaştırıldığında % 20 altında olması gerektiğini ve > WST-1 tahlil için 0.7 Absorbans birimleri. Bu kalite denetimleri de yetersiz doku canlılığı göstergeleri olarak hizmet. İnsan dokusu deterjan solüsyonu doğru yanıt olarak etkili bir toksik madde pozitif kontrol olarak dahil edilmelidir. 300-500 oranında bir artış yol açmalıdır (> 2.0 Absorbans birimleri) karaciğer değerleri ve tedavi edilmezse doku ile karşılaştırıldığında, < 0.1 Absorbans birimleri WST-1 tahlil için. SLS sonuçlandı karaciğer ve metabolik aktivite, bir düşüş WST-1 tahlil konsantrasyonlarda artış tarafından ölçülen hücre canlılık doz bağımlı azalma > 87 µg/mL. Böylece IC75 veya IC50 değerleri hesaplamak olası bir sigmoid konsantrasyon-yanıt modeli veri için takıldı. Bu değerler daha sonra konsantrasyonları sitokin ve Kemokin düzeyleri için seçmek için kullanılabilir: yüksek derecede toksik konsantrasyonlarda genellikle Hayır veya yalnızca azalmış sitokinler ve kemokinler tespit. Bu nedenle, toksik olmayan ya da sadece biraz toksik konsantrasyonları (IC75) tavsiye edilir. Burada karaciğer aktivite süpernatant hücre kültüründe beklenen artış kez uygulanan madde21tarafından etkilendiğini unutmamak önemlidir. Sık sık, parazit türleri karaciğer tahlil kullanılan tek sitotoksisite tahlil olsaydı sonuçların yanlış yorumlanmasına yol önde gelen madde ve enzim aktivitesi arasında meydana gelir. Böylece, önemli ve güvenilir ve geçerli sonuçlar elde etmek için birkaç sitotoksisite deneyleri gerçekleştirmek gerekli olur. Ayrıca, karaciğer ve WST-1 deneyleri duyarlılığını son derece karşılaştırılabilir belirtilmelidir.
Şekil 4' te, PCLS görüntülerini mikroskobik canlılığı yanıt için deterjan etkili bir toksik madde olarak insan dokusunun göstermektedir. Sonuçları diğer canlılığı veri onaylamak çok yararlıdır, ama bu ek donanım gerektirir. Toksik etkileri görsel olarak değerlendirilmesi EthD 1 pozitif hücre çekirdeği için karşılaştırıldığında calcein pozitif doku tarafından değerlendirilir. Airways veya kan damarları kaçınılmalıdır ise daha büyük boşluklar sonuçları kayabilir gibi parankimi içinde rasgele seçilmiş parçaları genellikle karşılaştırılabilir veri içinde sonuçlanır. Bizim deneyim ve yukarıda açıklanan mikroskobik ayarları ile bir ortalama hacmi 1.5 x 106 ve 5 x 106 µm3 kontrol doku arasında ölçülür. Değerleri akciğer malzeme kalitesi, PCLS kalite ve aynı zamanda Akciğer doku donör hastalık bağlıdır. İnsan Akciğer doku canlılığı bağışçılar arasında değişir de, uygun doku ile karşılaştırıldığında ölü hücre çekirdeği sayısı %15 doku denetiminin aşmaması gerekir. Ancak, ölü hücre çekirdeği doku denetiminde ağırlıklı olarak varsa, deneme terk.
Şekil 5 insan akciğer dokusu üzerinde HClPt ve SLS immunomodulatory etkisi için temsilcisi verileri görüntüler. IL-1α ve TNF-α pro-inflamatuar sitokinlerin biyolojik inflamasyon, inflamatuar işlemlerin başında uzun süre maruz gösteren çoğu maddeler uyarıcı. Her iki sitokinler ELISA tarafından ölçüldü. Hücre dışı IL-1α insan PCLS içinde genellikle düşük ise hücre içi IL-1α 1000 pg/mL ve üzerinde düzeyleri ulaşır. Hücre içi IL-1α bir düşüş devam eden sitotoksik süreçleri - gösterir ve çoğunlukla kimyasallara maruz kalma insan PCLS sonra görülmektedir. Doku LPS ile uyarılır, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ve bu nedenle bir aktivatör olumlu tedavi kontrol, o zaman bağlı IL-1α çoğunu sadece intracellularly 24 saat sonra tespit edilebilir. Buna ek olarak, TNF-α salgı LPS stimülasyon tarafından indüklenen esas olarak extracellularly ölçülebilir. LPS gibi uygun bir olumlu denetim geçerlilik bir yöntemin kullanımı gösterilmiştir. Mevcut araştırma yöntemi ile insan PCLS HClPt (32, 64 ve 125 µg/mL) üç konsantrasyonları veya iki konsantrasyonları SLS (1 ile 10 µg/mL) için 24 h salgısı hücre içi ve hücre dışı sitokinler toplamı olarak belirlendi sitokin sinin şekil 5' te gösterildiği gibi toplam protein konsantrasyonları için normalleştirilmiş. Sanki burada kayda değer BCA tahlil genellikle toplam protein içeriği belirlenmesi için kullanılır, ancak, aynı zamanda madde kaynaklı sitotoksisite yansıtır. Dolayısıyla, yüksek derecede toksik konsantrasyonları sitokin veri normalleştirme için toplam protein içeriği kullanılamaz. IL-1α salgılanmasını önemli ölçüde 263 ± 38 pg/mg 887 ± 216 pg/mg ve TNF-α için 263 ± 38 pg/mg 1,160 ± 286 pg/mg (şekil 5A, B) artar. Ayrıca, IL-1α ve TNF-α salgı LPS kaynaklı bir unstimulated doku denetimi ile karşılaştırıldığında sunulmaktadır. Pro-inflamatuar sitokinlerin LPS gibi patojen ilişkili moleküler desenleri tarafından indüksiyon bir yöntem geçerliliğini gösterir ve insan PCLS ile çalışırken immunomodulatory etkilerini araştırmak için kullanılması önerilir. HClPt ve SLS veriler üzerinde daha fazla ayrıntı için lütfen çalışma odasına Lauenstein vd tarafından bakın. 21
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig1.jpg"> Resim 1 : İnsan akciğer dolgu yordamı. İnsan akciğer rezeksiyonu hemen sonra hazırlanır. Akciğer tutarlı dolum ile özel ve ani özel polimerizasyon dolum sırasında önlemek için oda sıcaklığında saklanmalıdır. Akciğer yatay olarak, ana bronş veya bronşlar (A & B closeup bronş Tarih için) en iyi bir görünüm için yayılmış loblar ile yer alıyor. Bronşlar esnek silikon tüp ile cannulated ve kelepçeler ile (C) sabit. Doldurma prosedürü ve özel polimerizasyon sonra doku, eğitimli patologlar dilimleri hakkında 3-5 cm kalınlıkta (D) akciğer oyulmuş. Bu dilimler silindirik doku çekirdek (Ø örneğin, 8 mm) bir ambara aracı (E) ile hazırlanır. Bu doku çekirdek içine orta dolu Petri yemekler normal hücre kültür koşullar (E) altında kuluçka için hemen transfer PCLS içine bir doku dilimleyici kesilir. Birkaç yıkama adım PCLS arta kalan hücre artıkları ve serbest bırakılan hücre arabulucu (F) kaldırmak için hücre kültür tabak (örneğin, iyi ve 500 µL orta başına iki PCLS ile 24-şey plaka) içine aktarıldıktan sonra. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig2.jpg"> Resim 2 : H & E boyama tarafından insan PCLS Sağlık durumunun belirlenmesi. Bir donör akciğer tümörü ile hazırlanan bu resim PCLS olduğu gibi Akciğer doku alveoler parankimi ile periferik gösterir airways (*) ve kan damarlarının (ok uçları)(a)genel bakış. Yüksek büyütme oranında airways sağlam siliyer solunum epitel (ok) (B), bir kılcal ile çok sayıda eritrositler (ok) (C), dahil olmak üzere uygun pneumocytes ile kaplı bozulmamış bir alveoler yapı ile iletken alveoler alanlarda alveoler makrofajlar (CD68 immünhistokimya) içeren (D), kan damarları ile sağlam endotel (CD31 immünhistokimya) yanı sıra (E) görülebilir. Sadece tümör ücretsiz doku yok macroscopically hastalıklı alanlarda görünür olmasıdır PCLS için kullanıldı. PCLS aksine bağış diğer akciğer hastalıkları amfizem gibi ile hazırlanan veya fibrozis, alveoler yapı değil bozulur ve PCLS sadece biraz dış yatılı, hazırlık adımları nedeniyle büyük olasılıkla, yıpranmış. Ölçek çubuklar 1000 µm(a)ve 50 µm (B-E), anılan sıraya göre gösterir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig3.jpg"> Şekil 3 : İnsan PCLS, SLS tarafından indüklenen sitotoksisite belirlenmesi ölçülen kültür orta içine karaciğer enzim kaçağı (A) ve kaybı metabolik enzim aktivitesinin boya WST-1 (B) ile değerlendirildi. İnsan PCLS SLS konsantrasyonları artan maruz bırakıldı. Böylece IC75 veya IC50 değerleri (inhibitör konsantrasyonu hücre canlılığı % 25 ve % 50 azalma) hesaplanan (doğru rakamlar) bir sigmoid konsantrasyon-yanıt modeli veri için daha sonra takıldı. Veri ± SEM, demek gibi sunulmaktadır n = 3-5. Karaciğer testin Absorbans 492 ölçülen nm (başvurusu, 630 nm) ve WST-1 testin 450 nm (başvurusu, 630 nm). Verinin adapte ve Lauenstein vd. 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig4.jpg"> Şekil 4 : İnsan PCLS üç boyutlu mikroskobik boyama ve resim render temsilcisi görüntülerini. Canlı doku denetim ve doku için deterjan, etkili bir toksik madde olarak yanıt calcein AM ile insan PCLS (sarı) ve EthD-1 boyama sonra (kırmızı) gösterilir. 30 µm yığınları 10 X amacı(a)ile alınan ve (B) işlenir. Ölçek çubuğu 100 µm. uyarma dalga boylarında 488 nm ve 543 nm, emisyon filtreleri BP 505-550 nm ve LP 560 nm gösterir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig5.jpg"> Şekil 5 : Amonyum hexachloroplatinate (HClPt)-24 h maruz kaldıktan sonra insan PCLS içinde IL-1α ve TNF-α salgı indüklenen. PCLS üç konsantrasyonları (32 µg/mL, 64 µg/mL ve 125 µg/mL HClPt) ve iki farklı konsantrasyonlarda (1 µg/mL ve 10 µg/mL) SLS maruz kalmışlar. Hücre içi ve hücre dışı IL-1α(a)ve TNF-α (B) ELISA tarafından belirlenen ve toplam protein içeriği için normalleştirilmiş. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin LPS, olumlu bir aktivatör yönteminin geçerliliğini göstermek için hücre içi IL-1α(a)ve toplam protein içeriği için normalleştirilmiş ekstraselüler TNF-α (B) yayın için bir referans olarak gösterilir. Veri ± SEM, demek gibi sunulmaktadır *p < 0,05 ve ***p < 0,001; HClPt ve SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n 4'te teknik çoğaltmaları (Mann-Whitney testi) =. Bu rakam Lauenstein ve ark. değiştirildi 21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig1.jpg"> Ek şekil 1: ayrıntılı hesaplama işleme görüntü işleme yazılımı kullanarak boyama mikroskobik canlılık için. Yüzey işleme uygun doku (A-G, ben) calcein lekeli ve etidyum homodimer lekeli hücre çekirdeği (H, nokta tespiti için karşıya yüklenen LSM görüntülerin görüntü analizi için adım adım yordam çalışma J-M). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig2.jpg"> Ek Şekil 2: sayısal görüntü analizi mikroskobik canlılığı insan akciğer dokusunun boyama bakış. Uygun doku (sarı) yüzey işleme tarafından (B-ben) analiz edildi ve ölü hücre çekirdeği (kırmızı) nokta algılama (J-P) tarafından tespit edildi. Anlık görüntü modu (Q) görüntü vermek için kullanıldı. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices at JoVE.com

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

3Rs prensibi içinde görüş-in seçimli-e doğru hayvan çalışmaları olarak solunum modelleri gelişmektedir. Özellikle solunum maddelerin risk değerlendirmesi için uygun deneyleri eksikliği vardır. Burada, biz insan hassas kesim akciğer dilimleri hava maddelerin değerlendirilmesi için nasıl kullanılacağını açıklar.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...