Name: kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro at JoVE.com

يعترف الكتاب لوسي ميلر، ليني هرنانديز، الدكتور ديفيد هاس، بريتاني Yeley (إنديانا مدرسة الطب في جامعة)، والدكتور كارين بولوك، Mund جولي، ماثيو ريباس واميلي سيمز (Angio بيوكوري في مركز السرطان سيمون جامعة إنديانا) تقديم المساعدة التقنية الممتازة في اشتقاق عينات أكفك. الكتاب أيضا أن نقر الدكتور مورين هارينغتون ألف، إدوارد ف. سرور، ريتشارد أ. يوم، ميرفن جيم يودر وكلاوس أ ماتياس (إنديانا مدرسة الطب في جامعة) للمناقشة العلمية، فضلا عن "الجدران جانيس" (إنديانا مدرسة الطب في جامعة) الدعم الإداري. وأجرى تصوير كافة في مركز إنديانا "الفحص المجهري البيولوجية"، كلية الطب بجامعة إنديانا. أيد هذا العمل مؤسسة "الطفولة رايلي" والمعاهد الوطنية للصحة (R01 HL094725 و P30 CA82709 U10 HD063094). بالإضافة إلى ذلك، هذا المنشور كان ممكناً بفضل دعم جزئي من الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة # T32 HL007910.

<ol>
	<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tips,+stalks,+tubes:+notch-mediated+cell+fate+determination+and+mechanisms+of+tubulogenesis+during+angiogenesis.">Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis.</a> CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298 (2011).</li><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+health+and+disease.">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Functional+Characterization+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Blood.">Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularization:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).</li><li>Crabtree, B., Subramanian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+endothelial+cells+on+Matrigel+and+development+of+a+method+for+a+rapid+and+reproducible+in+vitro+angiogenesis+assay.">Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay.</a> In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Allier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+lensfree+microscopy+of+2D+and+3D+culture+of+cells.">Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells.</a> SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).</li><li>Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10+overexpression+improves+the+function+of+endothelial+progenitor+cells+stimulated+with+TNF-&#945;+through+the+activation+of+the+STAT3+signaling+pathway.">Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-&#945; through the activation of the STAT3 signaling pathway.</a> Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hyperglycemia+or+a+diabetic+intrauterine+environment+reduces+neonatal+endothelial+colony-forming+cell+numbers+and+function.">In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function.</a> Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).</li><li>Blue, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+diabetes+induces+alterations+in+the+function+of+neonatal+endothelial+colony-forming+cells.">Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells.</a> Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).</li><li>. WimTube Available from: <a target="_blank" href="https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube">https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube</a> (2012)</li><li>Varberg, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+of+vasculogenesis+inform+mechanistic+studies.">Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies.</a> Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fern&#225;ndez-Gonz&#225;lez, R., Mu&#241;oz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+blood.">Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

كف يتيح تقييم مجموعات البيانات الكبيرة مع نقاط زمنية متعددة تقليديا، وكوانتيتيشن من فاسكولوجينيسيس في المختبر تمثلت واحدة أو بضع الوقت نقطة القياسات. هذا النهج الثابت ببساطة غير كافية لالتقاط والتحديد الكمي لعملية دينامية ومعقدة. ولذلك، هذا الأسلوب الرواية قد وضعت لتمكين تحليل كفاءة حركية تشكيل شبكة التبصر في الآليات الجزيئية المحتملة التي تشارك في عملية دينامية فاسكولوجينيسيس. الكفاءة والتشغيل الآلي للمكاتب، عناصر هامة في تطوير تقنيات مبتكرة لتوليد وتحليل كميات كبيرة من البيانات التصوير. ووضعت كف على وجه التحديد لتحليل رصات الصور كبيرة تتألف من مئات الصور لتقليل الوقت والعمالة اللازمة لاستخلاص استنتاجات ذات معنى بيولوجيا من الوقت الفاصل بين مجموعات البيانات. الأهم من ذلك، كف تجري معالجة الصور وتوليد البيانات في غضون ثانية للصغيرة (أقل من 100 صور) صورة المداخن ودقيقة لأكبر (أكثر من 100 صورة) صورة المكدسات، أسفر عن كفاءة لا مثيل لها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنظيم البيانات في جداول البيانات بالزمن ومعلمات قياس الجيل السريع للعرض البياني والتحليل الإحصائي.
التحديات في التطبيق الناجح لهذا النهج على الرغم من أن هذا الفحص يتضمن تحسينات للحصول على الصور وتحليلها، قد تعوق بعض تحديات التنفيذ الناجح. وتشمل العقبات الرئيسية الأربعة الرطوبة الاستقرار ودقة توقيتها من الطلاء للحصول على الصور وموثوقية الأجهزة والبرامج وإدارة مجموعات كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها لكل تجربة. تصوير الخلايا الحية مستقرة على مدى عدة ساعات يمكن أن يكون تحديا. على وجه التحديد، مطلوب الترطيب المناسبة ومتسقة للدوائر التصوير. شرائح الأوعية المستخدمة في هذا التحليل، التي صممت لفحوصات الأوعية المستندة إلى مصفوفة parallelizing. يجعل حجمها منخفضة، ما يقرب من 50 ميليلتر، التبخر والتكثيف اعتبارات هامة لشروط الثقافة الموسعة. ولمكافحة هذه المشكلة التجريبية، من الضروري استخدام حاضنة الذي ينظم الرطوبة. ومع ذلك، قد يكون أيضا المطلوبة لزيادة هذه اللائحة إذا تجفيف المفرطة في دائرة التصوير يحدث على مر الزمن. وجدنا أن أبسط نهج زيادة الرطوبة لزيادة مساحة سطح المياه في الدائرة. ولتحقيق هذا الهدف، تقترح لدينا بروتوكول مصادر المياه الثلاثة التالية: شريحة ثانية غرف مملوءة بالماء، وأيضا حيث يتم قياس درجة حرارة الحاضنة، المياه في المنطقة المحيطة بابار على الشرائح، وورق الترشيح ترطب أو مناديل. على العكس من ذلك، يحدث التكثف عند درجة حرارة الهواء في الغرفة يبرد الجزء السفلي من الشريحة والرطوبة داخل قاعة يتكثف على الشرائح والآبار. هذا التعقيد يمكن أن يؤدي إلى إضعاف وسائل الإعلام الخلية وتأثير لينسينج الذي يتداخل مع التباين المرحلة. وفي هذه الدراسات، تم تصغير التكثيف من خلال التطبيق للهواء الساخن (39-42 درجة مئوية) على الجزء السفلي من الشريحة.
هو أحد الاعتبارات رئيسية لأية دراسة الوقت الفاصل بين الاتساق بين بدء التجربة والتصوير. توقيت عندما يبدأ تصوير أمر بالغ الأهمية لتفسير الأحداث المتلقين للمعلومات. لضمان دقة التوقيت لهذا التحليل، ينبغي أن تتم مراقبة مشددة الوقت بين الطلاء الأولى والنقطة الزمنية المصورة الأولى. في الممارسة العملية، يمكن التقليل من هذا "الوقت الميت"، ولكن الأهم من ذلك، فإنه يجب أن يكون متسقا للسماح بتجارب في أيام مختلفة بالمقارنة. على سبيل المثال، نحن نتوقع في هذا البروتوكول وقت ميت لما يقرب من 30 دقيقة. ويمكن تيسير هذا بالقرب من إعداد تجريبية والتصوير المرافق.
ما قد يبدو وكأنه التفاصيل الدنيوية للوهلة الأولى هامة للبرمجيات واستقرار الأجهزة، وإدارة البيانات. البرمجيات وبرامج تشغيل الأجهزة المقترنة وبيئة الشبكة والبرامج الآلية التحديثات كل يؤثر على استقرار البرنامج. أنها تستحق اختبار هذا البروتوكول في "تشغيل الجاف" تحديد الاختناقات والمصادر المحتملة للمشاكل في الحصول على الصورة؛ على سبيل المثال، تحقق من إعداد الخلية الحية لا يمكن الاعتماد عليها، وموثوقية المرحلة ومصراع الكاميرا، وسياسات تكنولوجيا المعلومات المؤسسية في نظام التشغيل، وتحديثات البرامج.
إدارة البيانات هي شغلا شاغلا لأي تجربة التصوير الذي يولد مئات الآلاف من الصور. لحسن الحظ، البرمجيات التجارية غالباً ما يتحقق من المساحة المتوفرة قبل البدء بتجربة تصوير. بيد أن هذا التحليل يشمل أيضا معالجة ما بعد التقاط الصور والتحليل التي يمكن إضافة إلى عبء مساحة محرك الأقراص الثابتة وتتداخل مع تصوير التجارب، إذا كانت المساحة المتوفرة محدودة. علاوة على ذلك، الأمن والاستقرار للكمبيوتر لا يمكن ضمانة، حتى مع حلول الأجهزة مثل صفيف مكرر من الأقراص متطابقة. وهكذا، استراتيجية لإدارة بيانات التأكد من الفضاء على محركات الأقراص الثابتة للكمبيوتر للتجارب الجارية وأرشفة البعيد قوية، على سبيل المثال مع مورد محفوظات مؤسسية، أمر ضروري.
استراتيجيات تحقيق أقصى قدر من جودة الصورة على الرغم من قدرة كف دقة التعرف اكفكس من خلفية ماتريكس قوية، حساسية المقايسة فيعتمد على جودة الصورة. على سبيل المثال، إذا كانت الصورة على النقيض منخفضة، سيكشف البرنامج شبكات الخليوي بأقل دقة (الشكل 2ب). نوعية على النقيض من المرحلة تتأثر بعوامل عدة، بما في ذلك إعدادات المجهر المستخدمة للحصول على الصور، تحميل المصفوفة ووسائط الإعلام تعليق الخلية أثناء إعداد المقايسة، والحفاظ على مستويات الإعلام داخل الآبار طوال التصوير. لتحسين تباين المرحلة لهذه الاختبارات، قدمت تعديلات طفيفة لمحاذاة الدائري المرحلة في المجهر لتحسين التباين. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار إعداد عينة صارم لضمان تحميل الوسائط متساوية ومتسقة. إذا كان المبلغ من المصفوفة و/أو وسائل الإعلام التي تم تحميلها في الآبار أما تحت أو فوق النطاق الأمثل، يمكن أن تشكل غضروف مما يؤدي إلى تباين مرحلة تغيير. وأخيراً، نظراً لصغر حجم السائل في الآبار، أنها حاسمة للحفاظ على مستويات الإعلام بالتقليل من التبخر والتكثيف، كما ذكر أعلاه. عموما، الأمثل المقايسة الحاسمة لإنشاء صور ذات جودة عالية التباين للتحليل.
بالإضافة إلى مرحلة نوعية على النقيض، يمكن أيضا أن تؤثر عوامل أخرى نتائج الفحص بما في ذلك التلوث بوسائل الإعلام، عيوب في المصفوفة، وجسيمات أو الحطام في مصفوفة أو وسائل الإعلام. التلوث يشكل خطرا من هذا التحليل نظراً لأنه ينطوي على تصوير الخلايا الحية على مدى عدة ساعات في غرفة الفحص المجهري. للحد من خطر التلوث، يتم تحميل المعلقات مصفوفة وخلية على الشريحة في غطاء عقيمة. وبالإضافة إلى ذلك، هو عادة مطلي كل عينة في تكرار أو ثلاث نسخ لتجربة للتقليل من خطر فقدان البيانات بسبب المسائل غير المتوقعة مثل الحطام أو الخلط التحليل الجزيئات.
عينة التغايرية محركات الأقراص تحتاج للمقايسة زيادة حساسية لاحظ عدم التجانس وقدمت تقريرا في دراسات سابقة من اكفكس يتعرض إلى غدم13. مستوى عال من عدم التجانس في وظيفة الخلية التي لوحظت في هذه العينات هناك تكهنات بأن ذلك يعزى إلى عدة عوامل منها شدة الأم المرض، ومدة المرض، وأسلوب الإدارة المستخدمة لتنظيم مستويات السكر في الدم. الأهم من ذلك، أن هذا النهج التحليلي يلتقط فاسكولوجينيسيس مجموعة ديناميكية من أكفك، مما يجعل من إمكانية تحديد الاختلافات المظهرية نظراً لعدم تجانس الوظيفية في عينات من الحمل غدم. عموما، يمكن الأخذ باستخدام عينات المريض الأولية، مثل تلك المستخدمة في هذه الدراسات، وتقلب أكبر مقارنة بخط خلية. كما ينصب تركيز أكبر على متعدية دراسات شملت العينات الحيوانية أو البشرية الأولية متعددة مع التقلبات الوظيفية، حساسية الفحص ضروري للكشف والاشتقاق من قياسات ذات مغزى بيولوجيا والاستنتاجات. ولذلك، وضع نهج مثل كف سيؤدي إلى تحسين كمية ونوعية البيانات التي تولدها فاسكولوجينيسيس في المختبر والأوعية فحوصات لتمكين أكثر قوة من الملاحظات والاستنتاجات. وعلاوة على ذلك، سوف تيسر هذه البيانات التحقيق في المستقبل للآليات الجزيئية الكامنة التي تسهم في تغيير أكفك فاسكولوجينيسيس عقب التعرض غدم داخل الرحم.
التطبيقات المستقبلية لهذا النهج على الرغم من أن تم تطبيق هذا الأسلوب لتقييم الجنين أكفك فاسكولوجينيسيس في المختبر في هذه الدراسات، تتعدد التطبيقات المحتملة لهذا النهج. ويمكن تنفيذ هذا الأسلوب سهولة لدراسة أي سكان الخلية التي تشارك في عمليات فاسكولوجينيسيس أو الأوعية. على وجه التحديد، فإنه يمكن استخدامها لدراسة السكان الخلايا الفردية، كما تجلى في هذه الدراسة، ولكن يمكن تطبيقه أيضا على نظم الثقافة المشتركة. في المستقبل، سيكون من المفيد لتوسيع هذا النهج بعد الفحص ثنائي الأبعاد في المختبر لتقييم نماذج ثلاثية الأبعاد (3D). على الرغم من أن الإصدار الحالي من كف لن تكون كافية كوانتيتاتينج 3D تصوير البيانات، نهجاً تحليلية متعددة حدودي، والوقت الفاصل بين مصممة بالمثل خصيصا لنماذج 3D أو في فيفو ستبلغ في حالة إبداء الملاحظات في أبعاد اثنين في المختبر هي الممثل للدالة cell في أجواء أكثر بيولوجيا ذات صلة.

قدرة الخلايا السلف بطانية للخضوع فاسكولوجينيسيس، أو تشكيل السفينة حيثياته ، أمر بالغ الأهمية في إقامة المفرج الجنينية أثناء التنمية1. بالإضافة إلى ذلك، مواصلة تشكيل السفينة ونضوج الأوعية الموجودة من قبل، والذي يعرف باسم "الانجيوجينسس"، أيضا عملية رئيسية في التنمية وفي الحياة بعد الولادة للحفاظ على تدفق الدم والتوازن في جميع أنحاء الجسم2. كل عضو في الجسم فيعتمد على نظام الأوعية الدموية لإيصال الأوكسجين والمواد المغذية، وإزالة النفايات3. إذا كان لا يتم الاحتفاظ التوازن الأوعية الدموية، مثل أن تشكيل الأوعية الدموية وإصلاح أما غير كافية أو في الزائدة، يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية4. ولذلك، تشكيل الأوعية الدموية والتكيف هي عادة دراسة، كما أنها ضرورية للحفاظ على صحة الجهاز ومتورطة في تنمية العديد من الدول باثولوجي.
نظراً لزيادة فهم مشاركة الأوعية الدموية في التنمية، فضلا عن مظاهر المرض والتقدم، وضعت فحوصات لنموذج فاسكولوجينيسيس والأوعية في المختبر و في فيفو5 ،،من67. النمذجة تشكيل السفينة ينطوي تصفيح خلايا الأوعية الدموية، مثل خلايا بطانية، في مصفوفة الغشاء يعزز تنظيم الخلية وتشكيل السفينة شبكات8،،من910. عادة ما يلي بين عشية وضحاها الحضانة، صوراً لخلية الشبكات التي تم التقاطها في نقطة مرة واحدة، مما أدى إلى عدد صغير من الصور لتحليل11،،من1213. ولذلك النهج التحليلي إلى حد كبير تم تطويرها والأمثل لمرة واحدة نقطة تقييمات10،14. بيد أن تحليلات ثابتة هي ببساطة غير كافية في التقاط دينامية عملية تشكيل السفينة والتبصير محدودة الآليات المحتملة التي تشارك. على الرغم من تزايد وتيرة التصوير سوف المحتمل أن توفر البيانات اللازمة لتحديد تشكيل حركية، سيكون تطبيق التحليلات المتقدمة سابقا إلى نقطة متعددة وقت التصوير نهج الكفاءة والعمل المكثف14. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من تطور تحليلات المتاحة تجارياً، رسوم الدفع كل صورة يجعل هذا الخيار التكلفة الباهظة للدراسات الحركية بآلاف صور التي تم إنشاؤها15. ولذلك، هناك حاجة في الميدان لنهج مبسط وفعال لالتقاط وتحديد فاسكولوجينيسيس في المختبر، بما في ذلك القدرة على تحليل مجموعات الصور الكبيرة المتولدة عن الوقت الفاصل بين الخلية حية مجهرية.
للتغلب على هذه القيود، تم تطوير نهج جديد هدف توسيع نقطة مرة واحدة تصوير للتمكن من تقييم ديناميكي من فاسكولوجينيسيس مع الصور المكتسبة كل 15 دقيقة16. بواسطة التقاط النقاط الزمنية متعددة على مدى عدة ساعات، يوفر هذا النهج تصوير أكثر تفصيلاً لعملية فاسكولوجينيسيس، فضلا عن التبصر في الآليات الممكنة التي تساهم في تكوين وصيانة شبكات السفينة. بالإضافة إلى تحسين نوعية للحصول على الصور والتردد، يتضمن هذا النهج البرمجيات الرواية في شكل مفتوح المصدر المكونات في17. البرمجيات، ويشار إليها بوصفها الحركية التحليل من فاسكولوجينيسيس (كف)، هو تطبيق مبسطة تتضمن معالجة الصور وتحليلها خصيصا لمجموعات الصور الكبيرة المتولدة من امتلاك الوقت متعدد نقطة. ويحلل كف المرحلة تباين الصور من خلال تجزئة الصورة متبوعاً سكيليتونيزيشن18. معلمات العشرة لهيكل الشبكة كمياً بكف بما في ذلك: فروع وشبكات مغلقة والعقد، شبكة المناطق، هياكل شبكة، تشعبت ثلاثية العقد، العقد تشعبت رباعية، فرع مجموع طول، فرع متوسط طول والفرع إلى العقدة نسبة (انظر 16من تخطيطي في الشكل 1). ويشمل تطبيق النهج كف النمط الظاهري رواية، المحسوب من فاسكولوجينيسيس في المختبر ، يشار إليه كالفرع لنسبة العقدة. عملنا مؤخرا أظهر أن هذه النسبة يدل على الاتصال بالشبكة، وقد يكون مرتبطاً بالعمليات الخلوية الأخرى المشاركة في تكوين شبكة الاتصال، مثل حركية16.
على الرغم من أن تم تقييم الجنين مستعمرة غشائي تشكيل الخلية (أكفك) فاسكولوجينيسيس في هذه الدراسات، يمكن تطبيق هذا النهج اقتناء وتحليل الصورة سهولة لتقييم أي أنواع الخلايا التي يخضع لها فاسكولوجينيسيس أو الأوعية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النهج لتحديد تغيير وظيفة الأوعية الدموية الناجمة عن مجموعة متنوعة من الدول باثولوجي، مثل السكري الحملي، كما هو مبين في هذه الدراسات. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا الأسلوب لتقييم تكوين الشبكة والتفريع، التي تعتبر هامة للعمليات الأخرى ذات الصلة بيولوجيا. وهكذا، لا يزال يحدد الأثر المحتمل لتطبيق هذا النهج المبتكر للنظم البيولوجية الفريدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mm Tissue Culture Plates</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495949B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Angiogenesis 15-well micro-slides</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">81506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGM2 Medium</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC3162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PSA Antimyocytic, Antibiotic</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT30004C1</td>
			<td style="width:167px;">Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">MT25052CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Type 1 Collagen</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354226</td>
			<td style="width:167px;">100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A38-212</td>
			<td style="width:167px;">Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kim Wipes</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chambered slide</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80296</td>
			<td style="width:167px;">This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">20012027</td>
			<td>1x solution, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 and MEF55030</td>
			<td style="width:167px;">Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Stage</td>
			<td style="width:127px;">Prior Instruments</td>
			<td style="width:119px;">ProScan II</td>
			<td style="width:167px;">Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Objective</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">93178</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Fluor DL 10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera</td>
			<td style="width:127px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:167px;">ORCA Flash 4.0LT</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Stage Blower</td>
			<td style="width:127px;">Precision Controls</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stage-top Incubator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">OKOLabs</td>
			<td style="width:119px;">H301</td>
			<td style="width:167px;">BoldLine including a two position slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:127px;">Hewlett-Packard</td>
			<td style="width:119px;">Z620 or equivalent</td>
			<td style="width:167px;">4 core Intel Xeon processor, &#62;32 GB RAM, &#62;2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nikon Elements Software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">AR v 4.20</td>
			<td style="width:167px;">ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">FIJI (ImageJ) Software</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">KAV Plug-In</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro

فاسكولوجينيسيس هو عملية معقدة بموجبه الخضوع غشائي الخلايا الجذعية والسلف تشكيل السفينة حيثياته . أصبح التقييم الكمي فاسكولوجينيسيس قراءات مركزية من السلف غشائي خلية وظيفة، وذلك، بذلت محاولات عدة لتحسين نماذج فاسكولوجينيسيس في المختبر و في فيفو . ومع ذلك، محدودة النطاق، الأساليب القياسية مع قياسات ثابتة الفشل في القبض على العديد من جوانب هذه العملية ديناميكية للغاية. ولذلك، كان الهدف من وضع هذا البروتوكول الرواية لتقييم الحركية في المختبر فاسكولوجينيسيس كي كوانتيتاتي معدلات تكوين الشبكة وتثبيت الاستقرار، فضلا عن توفير نظرة ثاقبة الآليات المحتملة الكامنة وراء الأوعية الدموية خلل وظيفي. ويظهر تطبيق هذا البروتوكول استخدام الجنين مستعمرة غشائي تشكيل خلايا (اكفكس) يتعرضون لآلام السكري. اكفكس الجنينية المستمدة من دم الحبل السري بعد الولادة، ومثقف، ومطلي في الشرائح يحتوي على مصفوفة غشاء الطابق السفلي، حيث أنها خضعت فاسكولوجينيسيس. صور الآبار الشريحة بأكملها التي تم الحصول عليها باستخدام الوقت الفاصل بين الطوري أكثر من 15 ساعة. وجرى تحليل الصور لاشتقاق البيانات الكمية باستخدام برنامج تحليل يسمى تحليل الحركية من فاسكولوجينيسيس (كف). كف يستخدم تجزئة الصورة متبوعاً سكيليتونيزاتيون لتحليل مكونات شبكة الاتصال من أكوام من نقطة الوقت متعدد المرحلة تباين الصور لاشتقاق المعلمات عشر (قياس 9، 1 حساب) لهيكل الشبكة بما في ذلك: الشبكات، الشبكة المناطق المغلقة العقد وفروع وفرع مجموع طول، فرع متوسط الطول، تشعبت ثلاثية العقد، العقد تشعبت رباعية، هياكل شبكة والفرع إلى نسبة العقدة. تطبيق هذا البروتوكول، وحدد تغيير معدلات فاسكولوجينيسيس في اكفكس التي تم الحصول عليها من الحمل معقدة بمرض البول السكري. ومع ذلك، هذا الأسلوب له آثار واسعة النطاق تتجاوز نطاق ذكرت هنا. تنفيذ هذا النهج سيعزز آليا إلى تقييم وتحسين قراءات وظيفية فاسكولوجينيسيس والعمليات الأخرى المتفرعة بيولوجيا هاما في العديد من أنواع الخلايا أو الحالات المرضية.

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro at JoVE.com

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

هنا، نقدم بروتوكول للتصوير بمرور الزمن والمرحلة تحليل فاسكولوجينيسيس في المختبر باستخدام مجهر التباين مقترنا مع برمجيات المصدر المفتوح، "تحليل فاسكولوجينيسيس الحركية". يمكن تطبيق هذا البروتوكول على كمي تقييم إمكانات فاسكولوجينيك من العديد من أنواع الخلايا أو الظروف التجريبية النموذجية أمراض الأوعية الدموية.

تحليل الحركية فاسكولوجينيسيس يقد ديناميات فاسكولوجينيسيس والأوعية في المختبر

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

تحليل النسخي التي كتبها الوليدة RNA FISH من<em&gt; في فيفو</em&gt; خلايا الأرومة الغاذية العملاق أو<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات قصير الأجل من المشيمة الظاهر المخروط إإكسبلنتس

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...