Name: kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00
Duration: 11 min 3 s
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Die Autoren erkennen Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Munder, Matthew Repass und Emily Sims (Angio BioCore an der Indiana University Simon Cancer Center) für ausgezeichnete technische Unterstützung bei der Ableitung ECFC Proben. Die Autoren erkennen auch DRS. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder und Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) wissenschaftlichen Diskussion sowie Janice Wände (Indiana University School of Medicine) für administrative Unterstützung. Alle Bildgebung wurde an der Indiana-Zentrum für biologische Mikroskopie, Indiana University School of Medicine durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 und U10-HD063094) und der Riley Children Foundation unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Publikation mit teilweiser Unterstützung vom National Heart, Lung und Blut-Institut von der National Institutes of Health unter Award # T32 HL007910 möglich.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

KAV ermöglicht Auswertung großer Datenmengen mit mehreren Zeitpunkten Traditionell bestand Quantifizierung der Vaskulogenese in Vitro eine Single oder ein paar Mal Punktmessungen. Diese statische Methode ist schlicht ungenügend für die Erfassung und Quantifizierung einen dynamischen und komplexeren Prozess. Daher wurde diese neuartige Methode entwickelt, um effiziente Analysen des Netzwerk Bildung Kinetik Einblick in mögliche molekularen Mechanismen des dynamischen Prozesses der Vaskulogenese zu ermöglichen. Effizienz und Automatisierung sind wichtige Bestandteile bei der Entwicklung neuer Techniken zur Erzeugung und Analyse von großen Mengen an Bilddaten. KAV wurde entwickelt, speziell um großes Bild Stapel bestehend aus Hunderten von Bildern, die Zeit und Arbeitsaufwand biologisch sinnvolle Schlussfolgerungen aus Zeitraffer Datensätzen ableiten senken zu analysieren. Vor allem KAV führt Bildverarbeitung und Datengenerierung in einer Angelegenheit von Sekunden für kleine (weniger als 100 Bilder) image-Stacks und Minuten für größere (mehr als 100 Bilder) Bild-Stapel, beispiellose Effizienz führt. Darüber hinaus ermöglicht die Organisation der Daten in Tabellenkalkulationen von Zeit und gemessenen Parameter schnelle Erzeugung von grafische Darstellung und statistische Analyse.
Herausforderungen bei der erfolgreichen Anwendung dieses Ansatzes Obwohl dieser Assay Verbesserungen zur Bildaufnahme und Analyse enthalten sind, können einige Herausforderungen erfolgreiche Umsetzung behindern. Die vier Haupthindernisse sind Luftfeuchtigkeit Stabilität, Timing Präzision von Beschichtung zur Bildaufnahme, Software und Hardwarezuverlässigkeit und Verwaltung großer Datenmengen erzeugt für jedes Experiment. Stabil live Cell Imaging über mehrere Stunden kann schwierig sein. Insbesondere ist angemessen und konsequent Befeuchtung für die Bildgebung Kammern erforderlich. In diesem Assay, eignen sich für Matrix-basierte Angiogenese-Assays parallelisieren Angiogenese Folien eingesetzt. Ihre geringe Volumen, ca. 50 µL macht Verdampfung und Kondensation wichtige Überlegungen zur erweiterten Kulturbedingungen. Um dieses experimentelle Problem zu bekämpfen, ist es notwendig, einen Inkubator zu verwenden, der Feuchtigkeit reguliert. Allerdings kann es auch sein erforderlich, um diese Verordnung zu erweitern, wenn übermäßiges Trocknen der bildgebenden Kammer im Laufe der Zeit auftritt. Wir fanden, dass die einfachste Methode zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit ist Wasserfläche in der Kammer zu erhöhen. Um dieses Ziel zu erreichen, schlägt unser Protokoll die folgenden drei Wasserquellen: eine zweite Kammern Folie gefüllt mit Wasser, die auch bei die Brutkasten Temperatur gemessen wird, Wasser in der Gegend um den Brunnen auf den Folien und benetzte Filterpapier oder wischt. Umgekehrt tritt Kondensation, wenn die Lufttemperatur im Raum unten auf die Folie kühlt und die Feuchtigkeit im Inneren der Kammer auf den Folien und den Brunnen kondensiert. Diese Komplikation kann führen zu einer Verwässerung der Zelle Medien und ein Linseneffekt, die mit dem Phasenkontrast stört. In diesen Studien wurde durch Anwendung der erwärmten Luft (39-42 ° C) auf die Unterseite der Folie Kondenswasser minimiert.
Ein entscheidendes Kriterium für eine Zeitraffer-Studie ist die Konsistenz zwischen Experiment Einleitung und Bildgebung. Das Timing der Bildgebung beim Starten ist entscheidend für Interpretation der nachgeschalteten Ereignisse. Um die Präzision Timing des Assays zu gewährleisten, sollte die Zeit zwischen den ersten Beschichtungs- und der erste Zeitpunkt der abgebildeten streng kontrolliert werden. In der Praxis dieses "Totzeit" minimiert werden, aber noch wichtiger ist, es muss konsequent, Experimente an verschiedenen Tagen verglichen werden können. Zum Beispiel erwarten wir in diesem Protokoll eine Totzeit von etwa 30 Minuten. Dies kann durch die Nähe der experimentellen Vorbereitung und imaging-Einrichtungen erleichtert werden.
Was mag wie banalen Details auf den ersten Blick für Software, Hardware-Stabilität und Datenmanagement wichtig sind. Software und zugehörige Hardware-Treiber, Netzwerk-Umgebung und automatisierte Software-updates alle beeinflussen die Stabilität der Software. Es lohnt sich dieses Testprotokoll in ein "Dry Run" zu identifizieren Sie Engpässe und mögliche Ursachen für Probleme in der Bildaufnahme; zum Beispiel für unzuverlässig live Zelle Setup, Bühne, Auslöser und Kamera Zuverlässigkeit und institutionellen Informationspolitik Technologie auf automatisierte Betriebssystem und Software-Updates überprüfen.
Datenmanagement ist ein ständiges Anliegen jedes imaging Experiment, das Hunderte oder Tausende von Bildern erzeugt. Zum Glück sucht kommerzieller Software oft verfügbaren Platz vor dem Start ein imaging Experiment. Dieser Test umfasst aber auch Post-Capture-Bildverarbeitung und Analyse, die die Festplatte Platz Last hinzufügen und stören mit imaging-Experimente, wenn der verfügbare Speicherplatz begrenzt ist. Darüber hinaus können die Sicherheit und Stabilität des Computers, auch mit Hardware-Lösungen wie z. B. eine redundante Festplattenarray identisch garantiert werden. Somit ist eine Daten-Management-Strategie darauf Platz auf den Festplatten für laufende Experimente und eine robuste Fernbedienung Archivierung, zum Beispiel mit einer institutionellen Archivierung Ressource erforderlich.
Strategien zur Maximierung der Bildqualität Obwohl die Fähigkeit des KAV, genau ECFCs aus dem Matrix Hintergrund erkennen robust ist, richtet sich die Empfindlichkeit des Tests auf die Bildqualität. Hat das Bild geringen Kontrast, wird die Software beispielsweise Zelle Netzwerke mit geringerer Genauigkeit (Abbildung 2B) erkennen. Die Qualität der Phasenkontrast wird von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Einstellungen des Mikroskops zur Bildaufnahme, beeinflusst von der Matrix und die Zelle Aussetzung Medien während der Assay-Erstellung und Pflege von medialen Ebenen innerhalb der Brunnen laden in der gesamten Bildgebung. Zur Optimierung der Phasenkontrast für diese Assays wurden kleinere Anpassungen an Ring Phasenanpassung im Mikroskop Kontrast zu verbessern. Darüber hinaus wurde Probenvorbereitung rigoros getestet, um gleich und konsequente Medien laden zu gewährleisten. Wenn der Betrag der Matrix und/oder Druckmedien in die Vertiefungen unterhalb oder oberhalb des optimalen Bereichs ist, kann ein Meniskus führt zu veränderten Phasenkontrast bilden. Schließlich ist es aufgrund des geringen Volumens der Flüssigkeit in den Vertiefungen, entscheidend für Medien Niveau zu halten, durch die Minimierung der Verdampfung und Kondensation, wie oben erwähnt. Insgesamt ist Assay Optimierung kritischer Kontrast Bilder in hoher Qualität für die Analyse zu generieren.
Neben der Phase Kontrast Qualität können andere Faktoren auch Assay-Ergebnisse einschließlich der Medien Verunreinigung, Mängel in der Matrix, und Partikel oder Schmutz in die Matrix oder Medien auswirken. Kontamination ist eine Gefährdung des Assays, denn es geht um live Cell Imaging über mehrere Stunden in einer Mikroskopie-Kammer. Um das Risiko einer Kontamination zu reduzieren, sind die Matrix und Zelle Aufhebungen auf der Folie in eine sterile Haube geladen. Darüber hinaus ist jede Probe in der Regel doppelt oder dreifach für ein Experiment zur Minimierung des Risikos von Datenverlust aufgrund von unvorhergesehenen Problemen wie Schmutz oder Partikel Störfaktoren die Analyse plattiert.
Probe Heterogenität Laufwerke müssen für erhöhte Assay Empfindlichkeit Heterogenität beobachtet und berichtet in früheren Studien von ECFCs, GDM13ausgesetzt. Ein hohes Maß an Heterogenität in der Zelle Funktion in diesen Proben beobachtet wird spekuliert, um darauf zurückzuführen sein, mehrere Faktoren, die Schwere der mütterlichen Erkrankung, Dauer der Krankheit und Management-Stil verwendet, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren. Wichtig ist, fängt dieser analytischen Ansatz der dynamischen Bereich ECFC Vaskulogenese, so dass es möglich ist, phänotypische Unterschiede aufgrund der funktionalen Heterogenität in Proben von GDM Schwangerschaften zu identifizieren. Insgesamt kann die Verwendung von primären Patientenproben, wie Sie in diesen Studien, größere Variabilität im Vergleich zu einer Zelllinie einführen. Als stärker auf translationale Studien mit mehreren primären tierischen oder menschlichen Proben mit funktionellen Variabilität gelegt wird, unbedingt Assay Sensitivität für die Erkennung und Ableitung von biologisch sinnvolle Messungen und Schlussfolgerungen. Aus diesem Grund generiert Entwicklung von Ansätzen wie KAV die Quantität und Qualität der Daten verbessert werden durch in-vitro- Vaskulogenese und Angiogenese Assays damit robuster Beobachtungen und Schlussfolgerungen. Außerdem erleichtert diese Daten zukünftige Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die zu veränderten ECFC Vaskulogenese nach intrauteriner GDM-Exposition beitragen.
Zukünftige Anwendungen dieses Ansatzes Obwohl diese Methode angewendet wurde, um fetale ECFC Vaskulogenese in Vitro in diesen Studien zu bewerten, sind die Einsatzmöglichkeiten dieses Ansatzes zahlreich. Diese Technik kann leicht implementiert werden, um jede Zellpopulation zu studieren, die in den Prozessen der Vaskulogenese oder Angiogenese beteiligt ist. Speziell, es kann verwendet werden, um einzelne Zellpopulationen zu studieren, wie in dieser Studie zeigte, aber es könnte auch zu Kokultur Systeme angewendet werden. In Zukunft wäre es vorteilhaft, diesen Ansatz über die zweidimensionale in Vitro Assay dreidimensionale (3D) Modelle beurteilen zu erweitern. Obwohl die aktuelle Version von KAV für Quantifizierung 3D Bilddaten nicht ausreichen würden, wäre ein ähnlich gestaltete Zeitraffer, multiparametrischen analytische Ansatz speziell für 3D oder in Vivo Modelle informieren, wenn in zwei Dimensionen Beobachtungen in Vitro sind Vertreter der Zellfunktion in eine mehr biologisch relevante Einstellung.

Die Fähigkeit der endothelialen Vorläuferzellen, Vaskulogenese, oder de Novo Schiff Bildung zu unterziehen ist kritisch embryonalen Gefäßsystem zu etablieren, während der Entwicklung1. Darüber hinaus ist weitere Schiff Bildung und Reifung der bereits vorhandenen Schiffe, die als Angiogenese bezeichnet wird, auch ein Schlüsselprozess in Entwicklung und postnatale Leben, Durchblutung und Homöostase im gesamten Körper2zu erhalten. Jedes Organ im Körper ist das Gefäßsystem für die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen und für die Beseitigung von Abfall3abhängig. Vaskuläre Homöostase ist nicht gepflegt, so dass Blutgefäß-Bildung und Reparatur entweder unzureichend oder im Übermaß sind, können Gefäßerkrankungen4führen. Daher werden vaskulären Bildung und Anpassung häufig untersucht, wie sie unerlässlich bei der Aufrechterhaltung der Organgesundheit sind und sind in die Entwicklung der zahlreichen pathologische Staaten involviert.
Wegen einem besseren Verständnis der Beteiligung des Gefäßsystems in Entwicklung, sowie bei Manifestation der Krankheit und dem Fortschreiten entwickelten Assays Modell Vaskulogenese und Angiogenese in Vitro und in Vivo5 ,6,7. Modellieren Schiff Bildung umfasst das Plattieren vaskulärer Zellen, wie Endothelzellen in Basalmembran-Matrix, die Zelle Organisation und Bildung von Schiff Netze8,9,10fördert. In der Regel folgende Übernachtung Inkubation, Bilder der Zelle, die Netze zu einem einzigen Zeitpunkt, führt eine kleine Anzahl von Bildern zur Analyse11,12,13erfasst werden. Daher wurden für einzelne Zeitpunkt Bewertungen10,14analytische Ansätze weitgehend entwickelt und optimiert. Jedoch statische Analysen sind einfach nicht ausreichend zur Erfassung des dynamischen Prozesses der Gefäß-Bildung und begrenzten Einblick in mögliche Mechanismen beteiligt. Obwohl immer häufiger bildgebende wahrscheinlich die notwendigen Daten zur Bildung Kinetik zu erkennen geben würde, wäre Anwendung der zuvor entwickelten Analytics zu einem Multi-Zeit Punkt imaging Ansatz ineffizient und arbeitsintensiv intensive14. Darüber hinaus macht trotz Entwicklung der kommerziell verfügbaren Analysen, eine Gebühr zahlen pro Bild diese Option für kinetische Untersuchungen, in denen Tausende von Bildern erzeugt15sind, kostspielig. Deshalb müssen in das Feld für einen schlanken und effizienten Ansatz zu erfassen und zu quantifizieren, Vaskulogenese in Vitro, einschließlich der Fähigkeit, große Bildsätze erzeugte Zeitraffer live Zelle Mikroskopie zu analysieren.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein neues Konzept entwickelt, mit dem Ziel der Erweiterung einzigen Zeitpunkt Bildgebung ermöglichen dynamische Beurteilung der Vaskulogenese mit Bilder alle 15 min16erworben. Durch die Erfassung von mehreren Zeitpunkten über mehrere Stunden, stellt dieser Ansatz eine detailliertere Darstellung des Prozesses der Vaskulogenese, sowie einen Einblick in mögliche Mechanismen, die einen Beitrag zur Bildung und Erhaltung des Schiffes Netzwerke. Dieser Ansatz beinhaltet neben der Verbesserung der Häufigkeit und Qualität der Bildaufnahme, neuartige Software in Form von einem Open-Source-Plug-in17. Die Software, bezeichnet als kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV), ist eine optimierte Anwendung, die Bildverarbeitung und Analyse speziell für großes Bild-Sets aus mehreren Zeit-Punkt Akquisitionen generiert enthält. KAV analysiert Phase kontrastreiche Bilder durch Bild Segmentierung gefolgt von Skelettierung18. Zehn Parameter der Netzwerkstruktur durch KAV quantifiziert sind unter anderem: Zweige, geschlossene Netze, Knoten, Netzbereiche, Netzwerkstrukturen, dreifach verzweigten Knoten, Quad verzweigte Knoten, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge und Ortsverbandes Knoten-Verhältnis (siehe schematisch in Abbildung 1)16. Anwendung des KAV-Konzepts enthält einen neuartigen, berechnete Phänotyp von in-vitro- Vaskulogenese, als der Zweig Knoten-Verhältnis bezeichnet. Unsere aktuelle Arbeiten gezeigt, dass dieses Verhältnis bezeichnend für Netzwerk-Konnektivität ist und andere zelluläre Prozesse, Netzwerkbildung, z. B. Motilität16zugeordnet werden.
Obwohl fetalen Endothelzellen koloniebildenden Zellen (ECFC) Vaskulogenese in diesen Studien beurteilt wurde, kann dieses Bild-Erfassung und Analyse-Ansatz ohne weiteres angewendet werden, um alle Zelltypen zu bewerten, die Vaskulogenese oder Angiogenese zu unterziehen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet werden, um veränderte Gefäßfunktion, die aus einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie gestational Diabetes Mellitus zu identifizieren, wie in diesen Studien gezeigt. Darüber hinaus könnte diese Methode bewerten, Netzwerkbildung und Verzweigungen, die wichtig sind für andere biologisch relevante Prozesse angepasst werden. So ist die potenziellen Auswirkungen der Anwendung dieser neuartigen Ansatzes auf einzigartige biologische Systeme noch nicht ermittelt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mm Tissue Culture Plates</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495949B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Angiogenesis 15-well micro-slides</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">81506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGM2 Medium</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC3162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PSA Antimyocytic, Antibiotic</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT30004C1</td>
			<td style="width:167px;">Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">MT25052CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Type 1 Collagen</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354226</td>
			<td style="width:167px;">100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A38-212</td>
			<td style="width:167px;">Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kim Wipes</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chambered slide</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80296</td>
			<td style="width:167px;">This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">20012027</td>
			<td>1x solution, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 and MEF55030</td>
			<td style="width:167px;">Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Stage</td>
			<td style="width:127px;">Prior Instruments</td>
			<td style="width:119px;">ProScan II</td>
			<td style="width:167px;">Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Objective</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">93178</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Fluor DL 10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera</td>
			<td style="width:127px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:167px;">ORCA Flash 4.0LT</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Stage Blower</td>
			<td style="width:127px;">Precision Controls</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stage-top Incubator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">OKOLabs</td>
			<td style="width:119px;">H301</td>
			<td style="width:167px;">BoldLine including a two position slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:127px;">Hewlett-Packard</td>
			<td style="width:119px;">Z620 or equivalent</td>
			<td style="width:167px;">4 core Intel Xeon processor, &#62;32 GB RAM, &#62;2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nikon Elements Software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">AR v 4.20</td>
			<td style="width:167px;">ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">FIJI (ImageJ) Software</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">KAV Plug-In</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro

Vaskulogenese ist ein komplexer Prozess, der durch den Stamm- und Vorläuferzellen Endothelzellen de Novo Schiff Ausbildung unterziehen. Quantitative Bewertung der Vaskulogenese ist eine zentrale Auslesen der endothelialen Vorläuferzellen Zellfunktionalität geworden, und daher wurden mehrere Versuche unternommen, in Vitro und in Vivo Vaskulogenese Modelle zu verbessern. Allerdings sind Standardmethoden, mit statischen Messungen nicht zu viele Aspekte dieses hoch dynamischen Prozesses erfassen eingeschränkt. Daher war das Ziel der Entwicklung dieser neuartigen Protokoll zur Bewertung der Kinetics von in-vitro- Vaskulogenese um quantitate Preise der Netzwerkbildung und Stabilisierung sowie Einblick in mögliche Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion. Anwendung dieses Protokolls wird demonstriert mit fetalen Endothelzellen koloniebildenden Zellen (ECFCs), mütterlichen Diabetes Mellitus. Fetale ECFCs wurden abgeleitet aus Nabelschnurblut nach der Geburt, kultiviert und vergoldet in Folien mit Basalmembran Matrix, wo sie Vaskulogenese unterzogen. Bilder der gesamten Folie Brunnen wurden aufgenommen mit Zeitraffer Phasenkontrastmikroskopie über 15 Stunden. Bilder wurden zur Ableitung von quantitativen Daten mithilfe einer Analysesoftware namens kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) analysiert. KAV verwendet Bild Segmentierung gefolgt von Skelettierung Netzwerkkomponenten aus Stapeln von Multi-Zeit Punkt Kontrast Phasenbilder abzuleiten zehn Parameter (9 gemessen, 1 berechnet) des Netzwerk einschließlich der Struktur zu analysieren: Netzwerke, Netzbereiche, geschlossen Knoten, Zweige, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge, dreifach verzweigten Knoten, Quad verzweigte Knoten, Netzstrukturen und Ortsverbandes Knoten-Verhältnis. Anwendung dieses Protokolls identifiziert verändert Preise der Vaskulogenese in ECFCs von Schwangerschaften, die durch Diabetes Mellitus kompliziert erhalten. Diese Technik hat jedoch große Auswirkungen würde den Rahmen sprengen, hier berichtet. Umsetzung dieses Ansatzes fördert die mechanistische Bewertung und Verbesserung der funktionellen Auslesen Vaskulogenese und anderen biologisch wichtigen Verzweigung Prozesse in zahlreichen Zelltypen oder Krankheitszustände.

KAV erzeugt visuelle Darstellungen der Netzwerkstruktur Der Kontrast zwischen der ECFCs und der Matrix Hintergrund in die Phasenbilder Kontrast ermöglicht KAV, zellspezifische Strukturen zu identifizieren. ECFC Netzwerke von KAV identifiziert vertreten sind bildhaft als Skelett und Maske Darstellungen zur Veranschaulichung von Strukturen, die von der Software zur Quantifizierung (Abb. 2A) verwendet. Wichtig ist, ermöglicht qualitative Bewertung der Skelett und Maske Formatvarianten schnelle Identifizierung von KAV Empfindlichkeit und Genauigkeit, die bei der Bestimmung der optimalen Schwellenwerteinstellungen und Interpretation Analyse-Ergebnisse nützlich sein können. Wenn die Qualität der Bilder Phase Kontrast hoch ist und ausreichender Kontrast erreicht, identifiziert KAV genau ECFC Netzwerke wie durch Ähnlichkeit zwischen der Phase kontrastreiches Bild und die KAV-generierte Skelett und Maske Wiedergaben (Abbildung 2 A und Video 1).
Alternativ, wenn Kontrast Phasenbilder keinen hohen Kontrast und/oder Artefakte von imaging wie Gitterlinien auftreten, Netzwerk Erkennungsgenauigkeit wird reduziert und Ergebnisse werden nicht eindeutig ist (Abbildung 2B). Bildung von Luftblasen innerhalb der Zelle Medien kann darüber hinaus auch Erkennungsgenauigkeit (Abbildung 2) verdecken. Jedoch können Probleme mit der Bildqualität durch Auswahl von verschiedenen Schnittstellenüberwachung Methoden in der KAV-Software enthalten oft überwunden werden. Beispielsweise wurde die Phase Kontrast Bild in Abbildung 2B mit identisches Bild Bearbeitung Einstellungen außer der Schnittstellenüberwachung Methode analysiert. Von Skelett und Maske Formatvarianten ist es offensichtlich, dass die Otsu Schnittstellenüberwachung eine genauere Erkennung der ECFC Netze Phase Kontrast Bild (Abbildung 2B) geführt. Daher ist die Bildqualität entscheidend für genaue und aussagekräftige Ergebnisse in diesem Test. Allerdings ermöglichen unterschiedliche Schwellwerte Methoden in der KAV-Benutzeroberfläche Anpassung der Bildanalyse anhand der Qualität der Bilder.
Time-Lapse Mikroskopie ermittelt qualitative und quantitative Unterschiede in ECFC Vaskulogenese nach intrauteriner gestational Diabetes Mellitus Exposition Vor kurzem wurde der KAV analytische Ansatz angewandt, um fetale ECFC Funktion nach Exposition gegenüber mütterlichen Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) in Utero16festzusetzen. KAV, veränderte Kinetik der Vaskulogenese wurden identifiziert in fetalen ECFCs T2DM ausgesetzt. Allerdings beeinträchtigt die Exposition, die während der gesamten Schwangerschaft, gestational Diabetes Mellitus (GDM) oder die Entwicklung von Glucose-Intoleranz häufig im dritten Trimester der Schwangerschaft auftritt, neben T2DM auch ECFC Funktion13. Daher wurde KAV angewendet, um festzustellen, ob GDM-exponierten ECFCs auch veränderte Kinetik der ECFC Netzwerkbildung anzeigen. Phase 1 (0-5 h) und Phase 2 (5 + h) wurden anhand Zeit verfallen Mikroskopie gepaart mit KAV Analyse (Abbildung 3). Repräsentative Phasenbilder Kontrast zu Beginn der Bildaufnahme (0,50 h) erworben und in den zeitlichen Verlauf (5,00 bis 10,00 Uhr) zeigen ECFC Netzwerkbildung in der vier Proben von einem experimentellen Tag (Abbildung 3 und Video 1 ). Trotz entsprechenden Zelle laden, wie in der Phase kontrastreiche Bilder 0,50 Stunden beobachtet sind qualitative Unterschiede in der Netzwerkstruktur offensichtlich zu den 5,00 und 10,00-Stunden Zeitpunkten. ECFCs von der unkomplizierten Schwangerschaft (UC) bilden eine komplexe und komplizierte Netzwerk 5 Stunden nach dem Plattieren, ähnlich wie unsere bisher veröffentlichten Daten16. Im Gegensatz dazu probieren ECFCs von GDM 1 (GDM1) Form sehr wenige Strukturen vernetzen, die nicht miteinander verbunden sind. Allerdings spiegelt dieses Muster nicht in alle ECFC Proben aus GDM Schwangerschaften, bezeichnend für Heterogenität zwischen den Proben. GDM2 Proben und GDM3 anzeigen mehr Netzwerkbildung im Vergleich zu GDM1, obwohl die Muster der Konnektivität veränderten im Vergleich zu den UC-Probe erscheinen. Wichtig ist, misst KAV mehrere strukturelle Komponenten ECFC Netzwerke, offensichtliche und subtile Phänotypen zu identifizieren.
Neben der Erzeugung von Skelett und Maske Wiedergaben der Netzwerkstruktur, quantitates KAV 10 Metriken Netzstruktur, einschließlich der Anzahl der individuelle Netzwerkstrukturen, Knoten, dreifach verzweigten Knoten, Knoten vierfach verzweigt, Zweige, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge Knoten-Verhältnis, total geschlossen Filialnetze und Netzwerk-Bereich16. KAV kompiliert die Daten für jede Probe in einer einzelnen Tabelle mit Werten für alle Bilder von den zeitlichen Verlauf. Tabelle 1 enthält repräsentative Rohdaten aus einer bildgebenden Studie für eine ECFC Probe. Parameter der Netzwerkstruktur gemessen von KAV gliedern sich in Spalten, und die Daten für die aufeinander folgenden Bildern, die im Laufe der Zeit erworben sind in Zeilen unterteilt. Für Beispiel, in unseren Studien, Bild 1 30 min nach dem Überzug mit nachfolgenden Bildern erworben wurde, wird alle 15 min. Rohwerte erzeugte gesammelt, KAV kann dann grafisch dargestellt oder weiter analysiert mit Hilfe komplexer statistischer Ansätze16.
Fünf Graphen zeigt Mittelwerte der Netzwerkstruktur aus drei separaten Experimente sind für eine unkomplizierte Einzelprobe (UC) und die drei GDM-Proben (Abbildung 4) dargestellt. Die UC-Probe in diesen Experimenten ähnlich zu zuvor analysiert UC Proben16. Zuvor wurde festgestellt, dass ECFC Vaskulogenese in Vitro Bi-phasisch, bestehend aus Phase 1 (0 - 5 h) und Phase 2 (5-10 h)16. Dieses Muster entspricht in aktuellen Studien, wie der Graph Darstellung geschlossenes Netzwerkdaten (Abbildung 4) belegt. Die UC-Probe gebildet eine größere Anzahl von geschlossenen Netzwerken im Vergleich zu allen drei der GDM Proben. Interessanterweise erscheinen drei der vier Proben zu einer ähnlichen Zeit, maximale Anzahl der geschlossenen Netzen, die zwischen 2,5 und 3 Stunden stattfindet. Allerdings war die GDM2 Probe langsamer maximale geschlossene Netze zu erreichen, die 5 Stunden Post-Beschichtung ist aufgetreten. Und trotz der GDM2 Probe weniger maximale Netzwerke im Vergleich zu den UC-Probe zu bilden, die Netzwerke, die es bildet wurden ebenso beibehalten, die UC-Probe im Laufe der Zeit. GDM1 und GDM3, die weniger Netzwerke im Vergleich zu den UC-Probe gebildet, stellte hingegen eine Verringerung Netzwerknummer im Laufe der Zeit. Insgesamt aus dem Diagramm Darstellung geschlossene Netzwerknummer, ist es offensichtlich, dass alle ECFC Proben eine Bi-phasisch Muster der Netzwerkbildung, angezeigt, aber die Bildung und die maximale Anzahl von Netzwerken erreicht über Proben variieren.
Netzwerkbereich stellt den durchschnittlichen Bereich innerhalb der geschlossenen Netze durch die ECFCs gebildet. Deshalb, je größer die geschlossene Netzwerk Nummer, je kleiner der Netzbereiche. Dieses Muster spiegelt sich in den Netzwerk-Bereich Grafiken wo die UC-Probe, die eine größere Anzahl von geschlossene Netzwerke gebildet, kleinere Netzbereiche im Laufe der Zeit im Vergleich zu den drei GDM-Proben (Abbildung 4 hatte). GDM2, die maximale geschlossene Netze langsamer erreicht, stellte hohe Netzwerkbereich zunächst, jedoch stabilisiert das Gebiet über Zeit, und dies um 15 Uhr die UC-Probe am ähnlichsten war. Im Laufe der Zeit stieg die durchschnittliche Netzwerkbereich in allen Proben aufgrund Netzwerk de-Stabilisierung. Einige Beispiele, wie GDM1 und GDM3, stellte jedoch einen rascheren Anstieg der Netzwerkbereich, die verringerte Stabilität im Vergleich zu anderen Proben ausstellen einen allmählichen Anstieg wahrscheinlich ein Indikator ist.
GDM-exponierten ECFCs weisen geringere Netzwerkstabilität Das Verhältnis der Zweige zu Knoten ist eine neuartige Phänotyp von KAV berechnet und in unseren früheren Studien identifiziert, und dies ist bezeichnend für Netzwerk-Konnektivität16. In der aktuellen Studie wies die UC-Probe ein niedriges Verhältnis, das ein hohes Maß an Netzwerkkonnektivität zu vertreten, die im Laufe der Zeit (Abbildung 4) gepflegt wurde. Dagegen hatte die drei Proben, GDM ein höheres Verhältnis von Zweigen, Knoten, vor allem in Phase 2 der Netzwerkbildung. Diese Beobachtung zeigt reduzierten Konnektivität und de-Stabilisierung von Netzwerkstrukturen.
Insgesamt bildeten GDM1 weniger Knoten und Zweige, die im Vergleich zu den anderen Proben mit der Reduktion erhalten im Laufe des Experiments. GDM2 und GDM3 gebildet und eine größere Anzahl von Filialen im Vergleich zu den UC-Probe, vor allem zwischen 5-15 h. Die Anzahl der Knoten in der GDM2 und GDM3 Netzwerke erkannt wurden mehr Ähnlichkeit mit der Anzahl der Knoten in der UC-Probe, vor allem zwischen 10-15 Uhr. Eine größere Anzahl von Filialen, aber eine ähnliche Anzahl von Knoten, könnte die erhöhte AST Knoten-Verhältnis deutlich zu späteren Zeitpunkten in den GDM-Proben entfallen. Wichtig ist, können gleichzeitige Änderungen im Zweig und Knoten schwierig in getrennten Diagrammen zu interpretieren sein. Jedoch bietet die neue Niederlassung Knoten-Verhältnis eine Möglichkeit, bewerten, wie Änderungen, einschließlich schwer zu erkennen, in den einzelnen Diagrammen im Zweig und Knoten, geringfügige Änderungen in veränderten Netzwerkkonnektivität führen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schaltplan skizziert 10 Parameter quantifiziert durch kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV). KAV quantitates zehn verschiedene Parameter der Netzwerkstruktur. Alle Parameter sind farblich gekennzeichnet und beschrieben im Schaltplan numerisch (1-10). Die Parameter umfassen die Anzahl der Filialen (grün 1), geschlossen Netze (blau, 2) und Knoten (rot, 3), durchschnittlich Netzwerkbereich (Orange, 4), die Anzahl der Netzwerkstrukturen (schwarz, 5), dreifach verzweigten Knoten (gelb, 6) und Quad-verzweigte Knoten (lila, 7), sowie Total (9) und (10) Zweig Durchschnittslänge und das Verhältnis der Anzahl der Filialen an die Anzahl der Knoten (10). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig2.jpg"> Abbildung 2 : Kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) quantitates Netzwerkstruktur. (A) Skelett und Maske Überstellungen von Netzwerkstrukturen von KAV mit Phase bieten kontrastreiche Bilder visuelle Darstellung von Netzwerkstrukturen identifiziert und quantifiziert durch KAV identifiziert. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) eine repräsentative Phase Kontrast Bild von ECFC Netzwerke-10 h Post-Beschichtung, die niedrigen Kontrast und Raster hat markiert aus einzelne Bildern zusammenfügen. Unterschiedliche Schwellwerte Methoden, z. B. Mittelwert oder Otsu, wählbar in den KAV-Plug-in, Quantifizierung Genauigkeit zu verbessern, wenn Kontrast Phasenbilder kontrastarmen haben oder Gitterlinien auftritt. Skelett und Maske Wiedergaben der Phase kontrastreiches Bild sind für mittlere und Otsu Schnittstellenüberwachung Methoden gezeigt. Phase kontrastreiche Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv erfasst. Maßstabsleiste = 500 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig3.jpg"> Abbildung 3 : Intrauterine GDM Belichtung verändert ECFC Netzwerkbildung. Bilder der ECFC Netzwerkbildung wurden in 15 Minuten Intervallen für 15 h von Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Repräsentative Phase kontrastreiche Bilder in 5 h-Schritten, beginnend bei der Beschichtung (0,5 h), sind für die UC und drei GDM Proben gezeigt. Phase kontrastreiche Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv erfasst. Maßstabsleiste = 500 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig4.jpg"> Abbildung 4 : ECFCs, intrauterine GDM Ausstellung verändert Netzwerk Bildung Kinetik ausgesetzt. ECFCs wurden von einer unkomplizierten Schwangerschaft (UC, schwarz) und drei Schwangerschaften kompliziert durch gestational Diabetes Mellitus (GDM 1-3, rot) erhalten. Phase wurden Kontrast Aufnahmen in 15 min. Intervalle für 15 h. kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) Software quantitated geschlossen Netze, Netzbereiche, Niederlassungen, Knoten und das Verhältnis der Zweige zu Knoten. Illustrierte Darstellung der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei separaten Experimenten für jede Probe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57044/57044video1.jpg"> Video 1: Intrauterine GDM Belichtung verändert Kinetik der ECFC Netzwerkbildung. Bilder der ECFC Netzwerkbildung wurden in 15 Minuten Intervallen für 15 h von Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Phasenbilder Kontrast werden für die UC und drei GDM Proben über 15 h ab 0,5 h angezeigt. Die Maßstabsleiste stellt 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57044/Video1.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Bild</td>
			<td>Insgesamt Filialnetze</td>
			<td>Knoten</td>
			<td>Dreibettzimmer</td>
			<td>Viererzimmer</td>
			<td>Filialen</td>
			<td>Insgesamt Zweig Länge *</td>
			<td>AVG-Zweig Länge *</td>
			<td>Filiale Knoten-Verhältnis</td>
			<td>Geschlossene Netze</td>
			<td>Netzwerk-Bereich **</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>382</td>
			<td>290</td>
			<td>278</td>
			<td>11</td>
			<td>943</td>
			<td>47210</td>
			<td>124</td>
			<td>3.25</td>
			<td>9</td>
			<td>480214</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>284</td>
			<td>345</td>
			<td>337</td>
			<td>8</td>
			<td>940</td>
			<td>50699</td>
			<td>179</td>
			<td>2,72</td>
			<td>16</td>
			<td>264469</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>205</td>
			<td>376</td>
			<td>366</td>
			<td>9</td>
			<td>910</td>
			<td>55728</td>
			<td>272</td>
			<td>2.42</td>
			<td>27</td>
			<td>150621</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>162</td>
			<td>422</td>
			<td>407</td>
			<td>15</td>
			<td>947</td>
			<td>59692</td>
			<td>368</td>
			<td>2.24</td>
			<td>40</td>
			<td>98713</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>132</td>
			<td>454</td>
			<td>441</td>
			<td>12</td>
			<td>967</td>
			<td>61923</td>
			<td>469</td>
			<td>2.13</td>
			<td>53</td>
			<td>72951</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>122</td>
			<td>435</td>
			<td>419</td>
			<td>14</td>
			<td>907</td>
			<td>62587</td>
			<td>513</td>
			<td>2.09</td>
			<td>68</td>
			<td>56948</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>88</td>
			<td>429</td>
			<td>411</td>
			<td>17</td>
			<td>852</td>
			<td>63983</td>
			<td>727</td>
			<td>1.99</td>
			<td>74</td>
			<td>51429</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>68</td>
			<td>451</td>
			<td>437</td>
			<td>13</td>
			<td>874</td>
			<td>63960</td>
			<td>941</td>
			<td>1,94</td>
			<td>74</td>
			<td>51780</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>93</td>
			<td>437</td>
			<td>417</td>
			<td>18</td>
			<td>905</td>
			<td>60901</td>
			<td>655</td>
			<td>2.07</td>
			<td>49</td>
			<td>82919</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>126</td>
			<td>511</td>
			<td>487</td>
			<td>24</td>
			<td>1075</td>
			<td>61981</td>
			<td>492</td>
			<td>2.1</td>
			<td>37</td>
			<td>116857</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>49</td>
			<td>397</td>
			<td>384</td>
			<td>12</td>
			<td>737</td>
			<td>61823</td>
			<td>1262</td>
			<td>1.86</td>
			<td>79</td>
			<td>48805</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>81</td>
			<td>376</td>
			<td>364</td>
			<td>10</td>
			<td>751</td>
			<td>56817</td>
			<td>701</td>
			<td>2</td>
			<td>63</td>
			<td>64431</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>98</td>
			<td>509</td>
			<td>482</td>
			<td>26</td>
			<td>1028</td>
			<td>60799</td>
			<td>620</td>
			<td>2.02</td>
			<td>44</td>
			<td>98056</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>93</td>
			<td>449</td>
			<td>416</td>
			<td>31</td>
			<td>909</td>
			<td>58282</td>
			<td>627</td>
			<td>2.02</td>
			<td>45</td>
			<td>94081</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="11">* gerundet zur nächsten Mikron ** gerundet zur nächsten Mikron ^ 2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Repräsentative Rohdaten aus einer Bildgebung zu studieren, für ein ECFC Beispiel.

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Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für Zeitraffer-Aufnahmen und Analyse der Vaskulogenese Verwendung von in-vitro- phase Kontrast Mikroskopie gekoppelt mit der open-Source-Software, kinetische Analyse der Vaskulogenese. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das Vasculogenic Potential von zahlreichen Zelltypen oder experimentellen Bedingungen, die arterielle Verschlusskrankheit modellieren quantitativ zu bewerten.

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