Name: kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro at JoVE.com

המחברים להכיר לוסי מילר ליאן הרננדז, ד ר דוד האס, בריטני Yeley (אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת), ד ר קארן Pollok, ג'ולי. Mund, מתיו Repass, אמילי סימס (BioCore אנגיוגרפיה במרכז הסרטן סיימון אוניברסיטת אינדיאנה) עבור מעולה סיוע טכני שתנבע ECFC דגימות. המחברים גם להכיר ד"ר מורין א הרינגטון, אדוארד פ סרור, ריצ'רד ש היום, מרווין ג Yoder ו מתיאס א Clauss (אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת) דיון אקדמי, כמו גם ג'ניס קירות (אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת) תמיכה מנהלתית. הדמיה כל בוצעה במרכז אינדיאנה על מיקרוסקופ ביולוגי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 HL094725, P30 CA82709 ו- U10 HD063094) וקרן של הילדים ריילי. בנוסף, פרסום זה התאפשרה עם תמיכה חלקית מן הלאומי ללב, ריאות, דם המכון של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס # T32 HL007910.

<ol>
	<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tips,+stalks,+tubes:+notch-mediated+cell+fate+determination+and+mechanisms+of+tubulogenesis+during+angiogenesis.">Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis.</a> CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298 (2011).</li><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+health+and+disease.">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Functional+Characterization+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Blood.">Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularization:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).</li><li>Crabtree, B., Subramanian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+endothelial+cells+on+Matrigel+and+development+of+a+method+for+a+rapid+and+reproducible+in+vitro+angiogenesis+assay.">Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay.</a> In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Allier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+lensfree+microscopy+of+2D+and+3D+culture+of+cells.">Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells.</a> SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).</li><li>Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10+overexpression+improves+the+function+of+endothelial+progenitor+cells+stimulated+with+TNF-&#945;+through+the+activation+of+the+STAT3+signaling+pathway.">Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-&#945; through the activation of the STAT3 signaling pathway.</a> Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hyperglycemia+or+a+diabetic+intrauterine+environment+reduces+neonatal+endothelial+colony-forming+cell+numbers+and+function.">In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function.</a> Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).</li><li>Blue, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+diabetes+induces+alterations+in+the+function+of+neonatal+endothelial+colony-forming+cells.">Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells.</a> Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).</li><li>. WimTube Available from: <a target="_blank" href="https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube">https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube</a> (2012)</li><li>Varberg, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+of+vasculogenesis+inform+mechanistic+studies.">Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies.</a> Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fern&#225;ndez-Gonz&#225;lez, R., Mu&#241;oz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+blood.">Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

קו מאפשר הערכה של ערכות נתונים גדולות עם מספר נקודות זמן באופן מסורתי, כימות של vasculogenesis במבחנה יש כלל אחד, או כמה זמן מדידות. גישה זו סטטית היא פשוט לא מתאימות עבור לכידת וכימות תהליך דינאמי ומורכב. לכן, בשיטה חדשנית זו פותחה כדי לאפשר ניתוח יעיל של קינטיקה היווצרות רשת כדי לזכות בתובנה פוטנציאליים המנגנונים המולקולריים המעורבים בתהליך דינמי של vasculogenesis. אוטומציה ויעילות הם מרכיבים חשובים בפיתוח של טכניקות הרומן ליצור ולנתח כמויות גדולות של נתונים הדמיה. קו פותחה במיוחד כדי לנתח את אוספי תמונות גדולים בהיקף של מאות תמונות כדי להקטין את הזמן ואת העבודה הנדרש כדי להפיק משמעות ביולוגית מסקנות זמן לשגות ערכות נתונים. חשוב, קו מבצעת עיבוד תמונה, דור נתונים תוך מספר שניות קטן (פחות מ- 100 תמונות) בתמונה ערימות דקות גדול (גדול מ 100 תמונות) תמונה ערימות, והתוצאה היא יעילות ללא תחרות. בנוסף, ארגון נתונים לתוך גליונות אלקטרוניים הפרמטרים הנמדדים וזמן מאפשר יצירה מהירה של מצגת גרפית וניתוח סטטיסטי.
אתגרים ביישום מוצלח של גישה זו למרות assay זה כולל שיפורים ייבוא תמונות וניתוח, כמה אתגרים עשויים לעכב יישום מוצלח. המכשולים העיקריים ארבע כוללים לחות יציבות, דיוק בתזמון של ציפוי כדי ייבוא תמונות, תוכנה, חומרה אמינות וניהול של ערכות נתונים גדולות שנוצר עבור כל ניסוי. הדמיה תא חי יציבה על פני מספר שעות יכול להיות מאתגר. באופן ספציפי, לחות המתאים ועקבית נדרש עבור התאים הדמיה. שקופיות אנגיוגנזה נמצאים בשימוש זה assay, אשר מיועדים parallelizing מבחני מבוסס-מטריקס אנגיוגנזה. נפח שלהם נמוך, כ- 50 µL, הופך אידוי ועיבוי שיקולים משמעותי עבור תנאים תרבות מורחב. כדי להתמודד עם הבעיה ניסיוני, זה הכרחי באינקובטור המסדירה את הלחות. עם זאת, גם ייתכן נדרש להגדיל את התקנה הזאת אם ייבוש יתר של התא הדמיה מתרחשת לאורך זמן. מצאנו כי הגישה הפשוטה ביותר כדי להגדיל את הלחות כדי להגדיל את שטח המים בבית הבליעה. כדי להשיג מטרה זו, הפרוטוקול שלנו מציע במקורות המים שלוש הבאות: שקופית chambered השני מלא מים, אשר גם בו נמדד הטמפרטורה חממה, מים באזור שמסביב הבארות שקופיות ולאחר שנרטבו נייר סינון או מגבונים לחים. לעומת זאת, עיבוי מתרחש כאשר טמפרטורת האוויר בחדר התחתון של השקופית מתקרר ומתעבה הלחות בתוך החדר על השקופיות ואת הבארות. הסיבוך הזה יכול להוביל לדילול התקשורת תא ואפקט lensing המפריע הניגוד שלב. במחקרים אלה, עיבוי היה ממוזער דרך היישום של אוויר חם (39-42 ° C) על גבי התחתון של השקופית.
אחד מהשיקולים המרכזיים למחקר כל זמן לשגות הוא עקביות בין חניכה ניסוי והדמיה. העיתוי של הפעלת הדמיה חיוני לפרשנויות של אירועים במורד הזרם. כדי להבטיח הדיוק בתזמון הזה assay, הזמן בין ציפוי הראשונית נקודת זמן שבעורך הראשונה צריכה להיות בחוזקה נשלטת. בפועל, ניתן למזער את "זמן מת", אבל יותר חשוב, זה צריך להיות עקבי לאפשר ניסויים בימים שונים לצורך השוואה. למשל, בפרוטוקול זה אנו מצפים זמן מת של 30 דקות. זה ניתן להקל על ידי הקרבה של מתקני הכנת ניסויי והדמיה.
מה שאולי נראה כאילו לפרטים ארציים במבט ראשון חשובים עבור תוכנה, חומרה יציבות וניהול נתונים. תוכנה, מנהלי התקני חומרה המשויך, בסביבת רשת ותוכנות אוטומטיות מעדכן כל השפעה היציבות של התוכנה. . זה שווה בדיקה פרוטוקול זה ב "הרצה" כדי לזהות צווארי בקבוק ואת מקורות פוטנציאליים של בעיות ברכישת תמונה; למשל, בדוק אם הגדרת תא חי לא אמין, הבמה, תריס המצלמה אמינות וצריכת את מדיניות טכנולוגיית המידע המוסדיים על מערכת הפעלה אוטומטית, עדכוני תוכנה.
ניהול נתונים הוא עניין מרכזי של כל ניסוי הדמיה שיוצר מאות עד אלפי תמונות. למרבה המזל, תוכנה מסחרית תדירות בודק עבור שטח זמין לפני הפעלת ניסוי הדמיה. עם זאת, וזמינותו הזה כולל גם תמונת לכידת שלאחר עיבוד וניתוח שניתן להוסיף לי שטח כונן קשיח או להפריע הדמיה ניסויים, אם השטח הפנוי מוגבל. יתרה מזאת, הביטחון והיציבות של המחשב אין אפשרות להבטיח, אפילו עם פתרונות חומרה כמו מערך יתיר של דיסקים זהים. לכן, אסטרטגיה וניהול נתונים כדי להבטיח מקום בכוננים הקשיחים של המחשב עבור ניסויים מתמשכים וארכוב של חזקה מרחוק, למשל עם משאב בארכיון מוסדיים, הכרחי.
אסטרטגיות כדי למקסם את איכות התמונה למרות היכולת של קו להבחין במדויק ECFCs מהרקע מטריקס חזקים, הרגישות של וזמינותו תלויה באיכות התמונה. לדוגמה, אם התמונה כוללת ניגודיות נמוכה, התוכנה יאתר תא רשתות עם פחות דיוק (איור 2B). האיכות של הניגוד שלב מושפע במספר גורמים, כולל ההגדרות של המיקרוסקופ משמש ייבוא תמונות, טעינה של המטריקס ואמצעי התקשורת התליה תא במהלך ההכנה assay, ותחזוקה של רמות התקשורת בתוך הבארות במהלך דימות. כדי למטב את הניגוד שלב עבור מבחני אלו, נעשו התאמות קלות ליישור טבעת שלב במיקרוסקופ כדי לשפר את הניגודיות. בנוסף, הכנת הדוגמא היה נבדק בקפידה כדי להבטיח טעינת מדיה שווה ועקבית. אם הסכום של מטריקס ו/או מדיה נטען לתוך הבארות או מתחת או מעל הטווח האופטימלי, מניסקוס יכולים ליצור המוביל שלב שינו חדות. בסופו של דבר, עקב כמות נוזלים הבארות קטן, חיוני כדי לשמור על רמות מדיה על-ידי מזעור אידוי ועיבוי, כאמור לעיל. בסך הכל, אופטימיזציה assay חיוני ליצירת תמונות חדות באיכות גבוהה לצורך ניתוח.
בנוסף שלב חדות באיכות, גורמים אחרים יכולים גם להשפיע assay התוצאות כולל זיהום מדיה, פגמים מטריצה, ו חלקיקים או פסולת מטריקס או מדיה. זיהום הוא סיכון assay הזה מאז שהוא כרוך הדמיה תא חי על פני מספר שעות בחדר מיקרוסקופ. כדי להפחית את הסיכון של זיהום, המתלים מטריקס ותא נטענים על גבי השקופית בשכונה סטרילי. בנוסף, כל מדגם הוא בדרך כלל מצופה כפילויות או שהפקידים עבור ניסוי כדי למזער את הסיכון של אובדן נתונים עקב בעיות בלתי צפויות כגון פסולת או חלקיקים משתנה מתערב בניתוח.
לדוגמה הטרוגניות כוננים צריך רגישות מוגברת assay הטרוגניות נצפתה ודיווח במחקרים קודמים של ECFCs נחשפים GDM13. רמה גבוהה של הטרוגניות בתפקוד התא שנצפתה הדגימות speculated להיות לייחס מספר גורמים, כולל חומרת המחלה אימהית, משך המחלה, ואת סגנון הניהול המשמש לווסת את רמות הגלוקוז בדם. חשוב לציין, גישה אנליטית זו לוכדת את טווח דינמי של ECFC vasculogenesis, שהופך אותו האפשריים כדי לזהות הבדלים פנוטיפי בשל הטרוגניות פונקציונלי בדגימות של GDM הריונות. בסך הכל, השימוש העיקרי דגימות החולה, כגון אלה נעשה שימוש במחקרים אלה, ניתן להציג את השתנות גדולה יותר לעומת קו תא. כפי מושם דגש רב יותר על translational מחקרים שכללו מספר ראשי דגימות בעלי חיים או אדם עם השתנות פונקציונלי, רגישות assay חיוני זיהוי, נגזרת של מדידות משמעות ביולוגית ומסקנות. לפיכך, פיתוח של גישות כמו קו תשפר את כמות ואיכות נתונים שנוצרו על-ידי במבחנה vasculogenesis ואנגיוגנזה מבחני כדי לאפשר עמידים יותר תצפיות ומסקנות. יתר על כן, נתונים אלה יקל בעתיד לפתוח בחקירה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס שתורמים שינו vasculogenesis ECFC בעקבות חשיפה GDM תוך רחמי.
יישומים עתידיים של גישה זו למרות ששיטה זו היה מוחל להערכת העובר ECFC vasculogenesis במבחנה במחקרים אלה, יישומים אפשריים של גישה זו הן רבות. טכניקה זו ניתן ליישם בקלות ללמוד כל התושבים תא המשתתפת בתהליכי vasculogenesis או אנגיוגנזה. באופן ספציפי, זה יכול לשמש כדי לחקור אוכלוסיות תא בודד, כמו הודגם במחקר זה, אבל זה גם יכול להיות מיושם במערכות תרבות משותפת. בעתיד, זה יהיה מועיל להרחיב את גישה זו מעבר מימדי במבחנה הנועד להעריך דגמים תלת ממדיים (3D). למרות שהגירסה הנוכחית של קו יהיה מספיק quantitating 3D הדמיה נתונים, דומה זמן לשגות רב פרמטרית אנליטית גישה במיוחד לדגמי תלת-ממד או ויוו היה להודיע אם תצפיות שני ממדים במבחנה הם נציג של הפונקציה תא באווירה יותר ביולוגית רלוונטית.

היכולת של אנדותל ובתאים לעבור vasculogenesis, או היווצרות כלי דה נובו , חיוני בהקמת להערכת עובריים במהלך פיתוח1. בנוסף, היווצרות כלי נוסף, ההבשלה של כלי הקיימת מראש, המכונה אנגיוגנזה, היא גם תהליך מפתח בהתפתחות וגם בחיים לאחר הלידה כדי לשמור על זרימת הדם הומאוסטזיס ברחבי הגוף2. כל איבר בגוף תלויה במערכת כלי הדם על אספקה של חמצן וחומרים מזינים, ועל סילוק פסולת3. אם כלי הדם הומאוסטזיס לא נשמרות, כך היווצרות כלי דם ותיקון הם מחסור או עודף, מחלות לב וכלי דם יכול לגרום4. לכן, היווצרות כלי דם והתאמה נפוץ נלמדים, כפי שהם חיוניים תוך שמירה על הבריאות איברים הם מעורבים בפיתוח של מדינות רבות פיפטות.
עקב הבנה מוגברת של המעורבות של מערכת כלי הדם פיתוח, וכן ביטוי המחלה והתקדמות, פותחו מבחני דגם vasculogenesis אנגיוגנזה חוץ גופית בתוך ושל ויוו5 6, ,7. היווצרות כלי מידול כרוך ציפוי כלי דם תאים, כמו תאי אנדותל, במטריצת קרום המרתף המקדם תא הארגון ועל היווצרות כלי רשתות8,9,10. בדרך כלל, בעקבות לילה דגירה, תמונות של תא הרשתות נלכדים בנקודת זמן אחת, וכתוצאה מכך מספר קטן של תמונות עבור ניתוח11,12,13. לכן, גישות אנליטיות יש בעיקר פותחה, אופטימיזציה עבור פעם נקודת הערכות10,14. עם זאת, ניתוח סטטי פשוט אינם מספיקים ב לכידת תהליך דינמי של היווצרות כלי ומספקים מוגבל תובנה מעורבים פוטנציאליים מנגנונים. למרות הדמיה בתדירות הולכת וגוברת ככל הנראה תספק את הנתונים הדרושים כדי לזהות היווצרות קינטיקה, יישום של ניתוח בעבר מפותח לנקודת זמן רב הדמיה הגישה יהיה לא יעיל ודיני אינטנסיבית14. בנוסף, למרות הפיתוח של ניתוחים זמינים מסחרית, תשלום שכר-לכל-תמונה מעבד אפשרות זו שאבטחה ללימודי קינטי, שבה אלפי תמונות הם שנוצר15. לכן, יש צורך בשטח גישה מפושטת ויעילה ללכוד ולכמת vasculogenesis במבחנה, כולל את היכולת לנתח תמונה גדולה ערכות שנוצר על ידי מיקרוסקופ תא חי זמן לשגות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, גישה חדשה פותחה במטרה להרחיב את נקודת הזמן יחיד הדמיה כדי לאפשר הערכת דינמי של vasculogenesis עם תמונות רכשה כל 15 דקות16. על-ידי לכידתו במספר נקודות זמן על פני מספר שעות, גישה זו מספק תיאור מפורט יותר של התהליך של vasculogenesis, כמו גם תובנה מנגנונים פוטנציאל לתרום היווצרות ותחזוקה של רשתות כלי השיט. בנוסף לשיפור את תדירות ואיכות התמונה רכישה, גישה זו משלבת תוכנה חדשניים בצורה של יישום plug-in קוד פתוח17. התוכנה, מכונה בשם קינטי ניתוח של Vasculogenesis (קו), הוא יישום יעיל המשלבת עיבוד וניתוח תמונה במיוחד עבור ערכות תמונה גדולה המופקים רכישות נקודת זמן רב. קו מנתח לשלב תמונות חדות באמצעות סגמנטציה ואחריו skeletonization18. עשרה פרמטרים של מבנה הרשת הם לכמת על ידי קו כולל: סניפים, רשתות סגורות, צמתים, רשת אזורי, מבני רשת, צמתי קנים משולשת, צמתי קנים עם ארבע ליבות, סניף סה כ אורך, סניף ממוצע אורך ואת הענף צומת יחס (ראה מפרטים טכניים באיור1)16. היישום של הגישה עמותת קו כולל הפנוטיפ הרומן, מחושבת של במבחנה vasculogenesis, המכונה את סניף צומת יחס. העבודה האחרונה שלנו הוכיח כי יחס זה מרמז על קישוריות רשת, עשויה להיות קשורה אחרים תהליכים תאיים המעורבים היווצרות רשת, כגון תנועתיות16.
למרות העובר המושבה אנדותל ויוצרים תאים (ECFC) vasculogenesis נאמד במחקרים אלה, ניתוח של רכישת גישה זו התמונה ניתן להחיל בקלות כדי להעריך את כל סוגי תאים עוברים vasculogenesis או אנגיוגנזה. בנוסף, גישה זו ניתן לזהות שינו תפקוד כלי דם כתוצאה ממגוון רחב של מדינות פיפטות, כגון סוכרת הריונית, כפי שמוצג במחקרים אלה. יתר על כן, שיטה זו יכולה להתאים להעריך היווצרות רשת הסתעפות, אשר חשובים עבור תהליכים ביולוגית רלוונטיים אחרים. לכן, ההשפעה הפוטנציאלית של החלת גישה חדשנית זו ייחודית מערכות ביולוגיות הוא עדיין נקבע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mm Tissue Culture Plates</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495949B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Angiogenesis 15-well micro-slides</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">81506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGM2 Medium</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC3162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PSA Antimyocytic, Antibiotic</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT30004C1</td>
			<td style="width:167px;">Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">MT25052CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Type 1 Collagen</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354226</td>
			<td style="width:167px;">100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A38-212</td>
			<td style="width:167px;">Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kim Wipes</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chambered slide</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80296</td>
			<td style="width:167px;">This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">20012027</td>
			<td>1x solution, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 and MEF55030</td>
			<td style="width:167px;">Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Stage</td>
			<td style="width:127px;">Prior Instruments</td>
			<td style="width:119px;">ProScan II</td>
			<td style="width:167px;">Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Objective</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">93178</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Fluor DL 10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera</td>
			<td style="width:127px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:167px;">ORCA Flash 4.0LT</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Stage Blower</td>
			<td style="width:127px;">Precision Controls</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stage-top Incubator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">OKOLabs</td>
			<td style="width:119px;">H301</td>
			<td style="width:167px;">BoldLine including a two position slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:127px;">Hewlett-Packard</td>
			<td style="width:119px;">Z620 or equivalent</td>
			<td style="width:167px;">4 core Intel Xeon processor, &#62;32 GB RAM, &#62;2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nikon Elements Software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">AR v 4.20</td>
			<td style="width:167px;">ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">FIJI (ImageJ) Software</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">KAV Plug-In</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro

Vasculogenesis הוא תהליך מורכב שבו עוברים גזע אנדותל ותאי קדמון היווצרות כלי דה נובו . הערכה כמותית של vasculogenesis הפך הבדיקה המרכזי של פונקציונליות תא אנדותל קדמון, לכן, נעשו מספר נסיונות לשפר גם במבחנה וגם ויוו מודלים vasculogenesis. עם זאת, בשיטות הרגילות מוגבלים היקף, עם מדידות סטטי נכשל ללכוד היבטים רבים של תהליך דינמי מאוד. לפיכך, היעד של פיתוח פרוטוקול הרומן זה היה כדי להעריך את קינטיקה של במבחנה vasculogenesis על מנת quantitate המחירים של היווצרות רשת וייצוב, כמו גם לספק תובנות פוטנציאליים המנגנונים שבבסיס כלי דם תפקוד לקוי. יישום של פרוטוקול זה הוכח באמצעות עוברית המושבה אנדותל ויוצרים תאים (ECFCs) נחשפים סוכרת אימהית. ECFCs עוברי היו נגזר דם חבל הטבור לאחר הלידה, תרבותי, מצופה בשקופיות המכיל מטריצה קרום המרתף, בה שעברו vasculogenesis. תמונות מן הבארות השקופית כולה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב זמן לשגות מעל 15 שעות. תמונות נותחו עבור נגזרת של נתונים כמותיים באמצעות ניתוח של תוכנה בשם קינטי ניתוח של Vasculogenesis (קו). קו משתמש סגמנטציה ואחריו skeletonization כדי לנתח את רכיבי הרשת הערימות של נקודת זמן רב שלב תמונות חדות להפיק עשרה פרמטרים (נמדד 9, 1 מחושב) של רשת מבנה כולל: סגור רשתות, רשת אזורים, צמתי סניפים, סניף סה כ אורך, סניף ממוצע אורך, צמתי קנים משולשת, צמתי קנים עם ארבע ליבות, מבני רשת, את סניף צומת יחס. יישום של פרוטוקול זה מזוהה שינו שערי vasculogenesis ב ECFCs המתקבל הריונות מסובך בגלל סוכרת. עם זאת, טכניקה זו יש השלכות רחבות מעבר להיקף דיווחו כאן. יישום של גישה זו לשפר הערכה מכניסטית ולשפר את המפרט פונקציונלי של vasculogenesis ותהליכים אחרים חשובים מבחינה ביולוגית מסעף אינספור סוגי תאים או מצבי מחלה.

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro at JoVE.com

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה בצילום מואץ והשלב ניתוח של vasculogenesis במבחנה באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת יחד עם התוכנה בקוד פתוח, ניתוח קינטי של Vasculogenesis. פרוטוקול זה ניתן ליישם באופן כמותי להעריך את הפוטנציאל vasculogenic של סוגי תאים רבים או תנאים ניסיוני דגם מחלת כלי דם.

ניתוח קינטי של Vasculogenesis מכמתת את הדינמיקה של Vasculogenesis ואנגיוגנזה במבחנה

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...