Name: kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro
Uploaded: 2018-01-31T15:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro at JoVE.com

Los autores reconocen Lucy Miller, Leanne Hernández, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), el Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Mateo reabra y Emily Sims (Angio BioCore en el centro de cáncer Universidad Simon de Indiana) para asistencia técnica excelente en derivadas de muestras ECFC. Los autores también reconocen los Drs. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder y Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) para discusión académica así como paredes de Janice (Indiana University School of Medicine) para apoyo administrativo. Toda la proyección de imagen se realizó en el centro de Indiana para microscopia biológica, escuela de medicina de la Universidad de Indiana. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01 HL094725 P30 CA82709 y HD063094 U10) y Fundación de los niños Riley. Además, esta publicación fue posible con el apoyo parcial de nacional del corazón, pulmón y sangre Instituto de los institutos nacionales de salud bajo premio # T32 HL007910.

<ol>
	<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tips,+stalks,+tubes:+notch-mediated+cell+fate+determination+and+mechanisms+of+tubulogenesis+during+angiogenesis.">Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis.</a> CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298 (2011).</li><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+health+and+disease.">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Functional+Characterization+of+Endothelial+Colony+Forming+Cells+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Blood.">Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularization:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).</li><li>Crabtree, B., Subramanian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+endothelial+cells+on+Matrigel+and+development+of+a+method+for+a+rapid+and+reproducible+in+vitro+angiogenesis+assay.">Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay.</a> In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Allier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+lensfree+microscopy+of+2D+and+3D+culture+of+cells.">Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells.</a> SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).</li><li>Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-10+overexpression+improves+the+function+of+endothelial+progenitor+cells+stimulated+with+TNF-&#945;+through+the+activation+of+the+STAT3+signaling+pathway.">Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-&#945; through the activation of the STAT3 signaling pathway.</a> Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hyperglycemia+or+a+diabetic+intrauterine+environment+reduces+neonatal+endothelial+colony-forming+cell+numbers+and+function.">In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function.</a> Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).</li><li>Blue, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+diabetes+induces+alterations+in+the+function+of+neonatal+endothelial+colony-forming+cells.">Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells.</a> Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).</li><li>. WimTube Available from: <a target="_blank" href="https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube">https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube</a> (2012)</li><li>Varberg, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+of+vasculogenesis+inform+mechanistic+studies.">Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies.</a> Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fern&#225;ndez-Gonz&#225;lez, R., Mu&#241;oz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li><li>Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+blood.">Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

KAV permite evaluación de conjuntos de datos grandes con varios puntos de tiempo Tradicionalmente, la cuantificación de la vasculogénesis en vitro ha consistido en una sola o unas mediciones de punto de tiempo. Este enfoque estático es simplemente insuficiente para capturar y cuantificar un proceso dinámico y complejo. Por lo tanto, este nuevo método fue desarrollado para permitir la eficientes análisis de la cinética de formación de la red para profundizar en los posibles mecanismos moleculares implicados en el proceso dinámico de vasculogénesis. Eficiencia y automatización son componentes importantes en el desarrollo de nuevas técnicas para generar y analizar grandes cantidades de datos de imágenes. KAV se desarrolló específicamente para analizar pilas de ampliación de imagen consisten en cientos de imágenes para disminuir el tiempo y mano de obra necesaria para derivar conclusiones propósito biológico de Time-lapse conjuntos de datos. Lo importante, KAV realiza procesamiento de imágenes y generación de datos en cuestión de segundos para los pequeños (menos de 100 imágenes) imagen pilas y minutos más grande (más de 100 imágenes) pilas, dando por resultado eficacia sin par de la imagen. Además, organización de datos en hojas de cálculo por el tiempo y los parámetros medidos permite la rápida generación de presentación y análisis estadístico.
Desafíos en la aplicación exitosa de este enfoque Aunque este ensayo incluye mejoras en la adquisición de imágenes y análisis, algunos de los desafíos pueden impedir la implementación exitosa. Los cuatro principales obstáculos incluyen estabilidad de humedad, precisión de sincronización de galjanoplastia para la adquisición de imágenes, software y hardware confiabilidad y gestión de grandes conjuntos de datos generados para cada experimento. Imágenes de células vivas estable durante varias horas pueden ser difícil. Específicamente, humidificación adecuada y coherente se requiere para las cámaras de proyección de imagen. Diapositivas de angiogénesis se utilizan en este ensayo, que se diseñan para compiladores basados en matriz angiogénesis ensayos. Su bajo volumen, aproximadamente 50 μL, hace de evaporación y condensación consideraciones importantes para las condiciones de cultivo extendido. Para combatir este problema experimental, es necesario utilizar una incubadora que regula la humedad. Sin embargo, también puede ser necesario aumentar este Reglamento si sequedad excesiva de la cámara de proyección de imagen se produce con el tiempo. Se encontró que el enfoque más sencillo para aumentar la humedad es aumentar la superficie de agua en la cámara. Para lograr este objetivo, nuestro protocolo indica las siguientes tres fuentes de agua: una segunda diapositiva cámara llenas de agua, que es también donde se mide la temperatura de la incubadora, agua en los alrededores de los pozos en las diapositivas y papel de filtro impregnada o toallitas húmedas. Por el contrario, se produce condensación cuando la temperatura del aire en la habitación enfría la parte inferior de la diapositiva y la humedad dentro de la cámara se condensa en las diapositivas y los pozos. Esta complicación puede conducir a una dilución de los medios de comunicación celular y un efecto de lente que interfiere con el contraste de fases. En estos estudios, se minimizó la condensación mediante aplicación de aire caliente (39-42 ° C) en la parte inferior de la diapositiva.
Una consideración clave para cualquier estudio Time-lapse es la consistencia entre el experimento de iniciación y proyección de imagen. El momento cuando comienza la proyección de imagen es fundamental para la interpretación de los acontecimientos posteriores. Para asegurar la precisión de sincronización de este ensayo, el tiempo entre galjanoplastia inicial y el primer punto de la imagen del tiempo debe ser bien controlado. En la práctica, se puede minimizar este "tiempo muerto", pero más importante aún, debe ser consistente para permitir experimentos en días diferentes para comparar. Por ejemplo, en el presente Protocolo se espera un tiempo muerto de aproximadamente 30 minutos. Esto puede facilitarse por la proximidad de preparación experimental y servicios de imagen.
Lo que podría parecer como detalles mundanos a primera vista son importantes para el software, estabilidad de hardware y gestión de datos. El software y hardware asociado, entorno de red y software automatizado actualiza todos afectan la estabilidad del software. Merece la pena probar este protocolo en un "dry run" para identificar los cuellos de botella y posibles fuentes de problemas en la adquisición de la imagen; por ejemplo, comprobar configuración de células vivas no fiable, confiabilidad de la etapa, el obturador y la cámara y las políticas de tecnología de información institucional sobre sistema operativo automatizado y actualizaciones de software.
Gestión de datos es una preocupación constante de cualquier experimento de la proyección de imagen que genera cientos o miles de imágenes. Afortunadamente, software comercial a menudo busca espacio disponible antes de comenzar un experimento de la proyección de imagen. Sin embargo, este análisis también incluyen procesamiento de imágenes de la captura y análisis que se pueden añadir a la carga de espacio de disco duro e interferir con experimentos, la proyección de imagen si el espacio disponible es limitado. Además, la seguridad y la estabilidad de la computadora no se puede garantizar, incluso con soluciones de hardware como una matriz redundante de discos idénticos. Así, una estrategia de gestión de datos para garantizar espacio en el disco duro del equipo para los experimentos actuales y un robusto archivo remoto, por ejemplo con un recurso de archivo institucional, es necesaria.
Estrategias para maximizar la calidad de la imagen Aunque la capacidad de KAV para discernir con precisión ECFCs desde el fondo de la matriz es sólida, la sensibilidad del ensayo depende de la calidad de imagen. Por ejemplo, si la imagen tiene poco contraste, el software detectará redes de célula con menos precisión (figura 2B). La calidad del contraste de fase se ve afectada por varios factores, incluyendo la configuración del microscopio utilizado para la adquisición de imágenes, carga de la matriz y los medios de comunicación de suspensión de célula durante la preparación del análisis y el mantenimiento de los niveles medios dentro de los pozos a lo largo de la proyección de imagen. Para optimizar el contraste de fase para estos ensayos, se hicieron pequeños ajustes a la alineación del anillo de fase en el microscopio para mejorar el contraste. Además, preparación de la muestra fue sometido a pruebas rigurosas para asegurar carga media igual y constante. Si la cantidad de matriz o media cargada en los pozos es por debajo o por encima del rango óptimo, un menisco puede formar líderes para contraste de fase alterada. Finalmente, dado el escaso volumen de líquido en los pozos, es crítico para mantener los niveles medios por reducir al mínimo la evaporación y la condensación, como se señaló anteriormente. En general, optimización de análisis es fundamental para generar imágenes de contraste de alta calidad para su análisis.
Además de la calidad de contraste de fase, otros factores también pueden afectar los resultados ensayo incluyendo la contaminación de los medios de comunicación, las imperfecciones de la matriz y las partículas o residuos en la matriz o los medios de comunicación. La contaminación es un peligro de este ensayo ya que se trata de imágenes de células vivas durante varias horas en una sala de microscopía. Para reducir el riesgo de contaminación, las suspensiones de la célula y la matriz se cargan en la diapositiva en una campana estéril. Además, cada muestra se platea típicamente en duplicado o triplicado para un experimento reducir el riesgo de pérdida de datos debido a imprevistos como la suciedad o partículas de confundir el análisis.
Muestra heterogeneidad unidades necesitan para la sensibilidad del ensayo mayor Heterogeneidad ha sido observada y reportado en estudios previos de ECFCs expuestos a GDM13. Un alto nivel de heterogeneidad en función de las células observada en estas muestras se especula atribuible a varios factores incluyendo la severidad de la enfermedad materna, duración de la enfermedad y estilo de gestión utilizado para regular niveles de glucosa en sangre. Lo importante, este enfoque analítico captura la gama dinámica de ECFC vasculogénesis, lo que es factible identificar diferencias fenotípicas debido a la heterogeneidad funcional en muestras de embarazos GDM. En general, el uso primarios de muestras de pacientes, como los utilizados en estos estudios, puede introducir mayor variabilidad respecto a una línea celular. Como se pone un mayor énfasis en estudios traslacionales con múltiples muestras de animales o humanas primarias con variabilidad funcional, sensibilidad del ensayo es fundamental para la detección y derivación de medidas biológicamente significativas y conclusiones. Por lo tanto, desarrollo de enfoques como KAV mejorará la cantidad y calidad de los datos generados por la angiogénesis y vasculogénesis en vitro ensayos para permitir que más observaciones y conclusiones. Además, estos datos facilitarán futuras investigación de mecanismos moleculares subyacentes que contribuyen a la vasculogénesis ECFC alterados tras la exposición intrauterina de GDM.
Futuras aplicaciones de este enfoque Aunque este método fue aplicado para evaluar fetal ECFC vasculogénesis en vitro en estos estudios, las posibles aplicaciones de este enfoque son numerosos. Esta técnica se puede implementar fácilmente para estudiar una población celular que participa en el proceso de vasculogénesis o angiogénesis. En concreto, puede ser utilizado para el estudio de las poblaciones individuales de la célula, como se demostró en este estudio, pero también se podría aplicar a los sistemas de co-cultivo. En el futuro, sería beneficioso ampliar este enfoque más allá el análisis bidimensional en vitro para evaluar modelos tridimensionales (3D). Aunque la versión actual de KAV sería insuficiente para la cuantificación de los datos de la proyección de imagen 3D, un enfoque analítico Time-lapse, multi-paramétrico semejantemente diseñado específicamente para los modelos 3D o en vivo informarían si observaciones realizadas en dos dimensiones en vitro son representativos de la función de la célula en un ambiente biológicamente más relevante.

La capacidad de las células progenitoras endoteliales a vasculogénesis, o formación de vasos de novo , es fundamental en el establecimiento de vasculatura embrionaria en desarrollo1. Además, más formación de vasos y la maduración de los vasos preexistentes, que se conoce como angiogénesis, también es un proceso clave en el desarrollo y en la vida postnatal para mantener el flujo de sangre y homeostasis en todo el cuerpo2. Cada órgano en el cuerpo es dependiente sobre el sistema vascular para la entrega de oxígeno y nutrientes y para la eliminación de residuos3. Si no se mantiene la homeostasis vascular, tal que la reparación y formación de vasos sanguíneos son insuficientes o en exceso, enfermedades vasculares pueden producir4. Por lo tanto, adaptación y formación vascular son comúnmente estudiados, ya que son esenciales en el mantenimiento de la salud de órganos y están implicados en el desarrollo de numerosos estados patológicos.
Debido a una mayor comprensión de la participación del sistema vascular en desarrollo, así como en la progresión y la manifestación de la enfermedad, se han desarrollado ensayos modelo vasculogénesis y angiogénesis in vitro y en vivo5 ,6,7. Modelos de formación de vasos consiste en platear las células vasculares, como las células endoteliales, en la matriz de la membrana del sótano que promueve la organización celular y formación de redes de vasos8,9,10. Por lo general, la siguiente noche incubación, imágenes de celular redes son capturadas en un solo momento, resultando en un pequeño número de imágenes para el análisis11,12,13. Por lo tanto, enfoques analíticos en gran parte se han desarrollado y optimizado para vez punto evaluaciones10,14. Sin embargo, el análisis estáticos son simplemente insuficientes en capturar el proceso dinámico de formación de vasos y proporcionan información limitada sobre posibles mecanismos implicados. Aunque el aumento de la frecuencia imagen es probable que proporcionaría los datos necesarios para determinar la cinética de la formación, aplicación de análisis anteriormente desarrollado a un punto multi-tiempo imagen enfoque sería ineficiente y trabajo intensivo14. Además, a pesar del desarrollo de análisis disponibles en el mercado, una tarifa de pago por imagen representa esta opción prohibitiva para estudios cinéticos en los que miles de imágenes son generadas15. Por lo tanto, es una necesidad en el campo de forma ágil y eficiente capturar y cuantificar vasculogénesis en vitro, incluyendo la habilidad para analizar sistemas de ampliación de imagen generadas por microscopia celular en time-lapse.
Para superar estas limitaciones, se desarrolló un nuevo enfoque con el fin de ampliar solo momento la proyección de imagen para permitir la evaluación dinámica de vasculogénesis con imágenes adquiridas cada 15 min16. Por la captura de varios puntos del tiempo durante varias horas, este enfoque proporciona una descripción más detallada del proceso de vasculogénesis, así como información sobre posibles mecanismos que contribuyen a la formación y mantenimiento de redes de vasos. Además de mejorar la frecuencia y calidad de adquisición de la imagen, este enfoque incorpora nuevo software en forma de un plug-in de código abierto17. El software, que se refirió a como cinética análisis de vasculogénesis (KAV), es una aplicación optimizada que incorpora procesamiento de imágenes y análisis específicamente para sistemas de ampliación de imagen generado por adquisiciones del multi-tiempo punto. KAV analiza imágenes de contraste de fase a través de la segmentación de la imagen seguido del skeletonization18. Diez parámetros de estructura de red se cuantifican por KAV incluyendo: ramas, redes cerradas, nodos, red áreas, estructuras de red, nodos ramificados triple, nodos ramificados quad, longitud total de la rama, longitud promedio de la rama y la rama al cociente de nodo (véase esquema en la figura 1)16. Aplicación del enfoque KAV incluye un fenotipo nuevo, calculado de en vitro vasculogénesis, conocido como la rama al cociente de nodo. Nuestro trabajo reciente demostró que esta relación es indicativa de la conectividad de red y puede estar asociada con otros procesos celulares implicados en la formación de la red, tales como la motilidad16.
Aunque en estos estudios se evaluaron la fetal endoteliales formadoras vasculogénesis (ECFC) de la célula, este enfoque de adquisición y análisis de imagen puede aplicarse fácilmente para evaluar cualquier tipo de célula que se someten a vasculogénesis o angiogénesis. Además, este enfoque puede utilizarse para identificar la alteración de la función vascular resultante de una variedad de estados patológicos como diabetes gestacional, como se muestra en estos estudios. Además, este método podría ser adaptado para evaluar la formación de redes y sucursales, que son importantes para otros procesos biológicamente relevantes. Así, el impacto potencial de la aplicación de este nuevo enfoque a los sistemas biológicos únicos es ser determinada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:628px;" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100mm Tissue Culture Plates</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1495949B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Angiogenesis 15-well micro-slides</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">81506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matrigel</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354234</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGM2 Medium</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC3162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PSA Antimyocytic, Antibiotic</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT30004C1</td>
			<td style="width:167px;">Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">MT25052CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Type 1 Collagen</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Corning)</td>
			<td style="width:119px;">354226</td>
			<td style="width:167px;">100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A38-212</td>
			<td style="width:167px;">Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kim Wipes</td>
			<td style="width:127px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chambered slide</td>
			<td style="width:127px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80296</td>
			<td style="width:167px;">This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Fisher (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">20012027</td>
			<td>1x solution, pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MEA53100 and MEF55030</td>
			<td style="width:167px;">Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Stage</td>
			<td style="width:127px;">Prior Instruments</td>
			<td style="width:119px;">ProScan II</td>
			<td style="width:167px;">Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Objective</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">93178</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Fluor DL 10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera</td>
			<td style="width:127px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-42U</td>
			<td style="width:167px;">ORCA Flash 4.0LT</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Stage Blower</td>
			<td style="width:127px;">Precision Controls</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stage-top Incubator&#160;</td>
			<td style="width:127px;">OKOLabs</td>
			<td style="width:119px;">H301</td>
			<td style="width:167px;">BoldLine including a two position slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:127px;">Hewlett-Packard</td>
			<td style="width:119px;">Z620 or equivalent</td>
			<td style="width:167px;">4 core Intel Xeon processor, &#62;32 GB RAM, &#62;2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Nikon Elements Software</td>
			<td style="width:127px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">AR v 4.20</td>
			<td style="width:167px;">ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">FIJI (ImageJ) Software</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">KAV Plug-In</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetic analysis of vasculogenesis quantifies dynamics of vasculogenesis and angiogenesis in vitro

Vasculogénesis es un proceso complejo por el cual las células madre y progenitoras endoteliales sufren de novo formación de vasos. Evaluación cuantitativa de la vasculogénesis se ha convertido en una lectura central de la funcionalidad de células progenitoras endoteliales, y por lo tanto, se hicieron varios intentos para mejorar modelos de vasculogénesis tanto in vitro e in vivo . Sin embargo, los métodos estándar son limitados en alcance, con mediciones estáticas no capturar muchos aspectos de este proceso altamente dinámico. Por lo tanto, el objetivo de desarrollar este nuevo protocolo era evaluar la cinética de la vasculogénesis en vitro con el fin de cuantificar las tasas de formación de redes y estabilización, así como proporcionar la penetración en mecanismos potenciales subyacentes vascular disfunción. Aplicación de este protocolo se demuestra utilizando Colonia endotelial fetal formando células (ECFCs) expuestas a diabetes mellitus materna. ECFCs fetales fueron derivados de la sangre del cordón umbilical después del nacimiento, cultivados y plateados en diapositivas que contiene la matriz de la membrana del sótano, donde experimentaron la vasculogénesis. Imágenes de los pozos de la diapositiva entera fueron adquiridas mediante microscopía de contraste de fase Time-lapse durante 15 horas. Imágenes se analizaron para la derivación de datos cuantitativos utilizando un software de análisis llamado análisis cinético de vasculogénesis (KAV). KAV utiliza segmentación seguida skeletonization para analizar los componentes de la red de pilas de imágenes de contraste de fase punto multi-tiempo obtener diez parámetros (9 medidos, 1 calculado) de estructura de red, incluyendo: cerrado redes, áreas de la red, nodos, ramas, longitud total rama, longitud de rama media, nodos ramificados triple, ramificados de cuatro nodos, estructuras de la red y el poder relación nodo. Aplicación de este protocolo identificado altera tarifas de vasculogénesis en ECFCs de embarazos complicados por diabetes mellitus. Sin embargo, esta técnica tiene implicaciones generales más allá del alcance divulgado aquí. Aplicación de este enfoque será mejorar evaluación mecanicista y mejorar lecturas funcionales de vasculogénesis y otros procesos de ramificación biológicamente importantes en numerosos tipos celulares o en Estados de enfermedad.

KAV produce representaciones visuales de la estructura de la red El contraste entre el ECFCs y el fondo de la matriz en las imágenes de contraste de fase permite KAV identificar estructuras celulares específicas. Redes ECFC identificadas por KAV se representan gráficamente como copias del esqueleto y la máscara para ilustrar las estructuras utilizadas por el software para la cuantificación (figura 2A). Lo importante, evaluación cualitativa de las copias del esqueleto y la máscara permite la identificación rápida de KAV sensibilidad y precisión, que puede ser útil en determinar configuraciones de umbral óptimo e interpretación de los resultados del análisis. Cuando la calidad de las imágenes de contraste de fase es alta y se logra suficiente contraste, KAV con precisión identifica redes ECFC según lo indicado por la semejanza entre la imagen de contraste de fase y el KAV generado esqueleto y la máscara copias (figura 2 A y Video 1).
Alternativamente, si imágenes de contraste de fase no tiene alto contraste o artefactos de la proyección de imagen tales como la red se producen, se reduce la precisión de detección de red y los resultados se convierten en ambiguos (figura 2B). Además, la formación de burbujas de aire dentro de los medios de comunicación de la célula también puede ocultar precisión de detección (figura 2). Sin embargo, problemas con calidad de imagen a menudo pueden ser superados mediante la selección de métodos de umbral diferentes incluidas en el software KAV. Por ejemplo, la imagen de contraste de fase en la figura 2B se analizó utilizando la configuración de procesamiento de imagen idéntica excepto por el método de umbralización. De las copias del esqueleto y la máscara, es evidente que el umbral Otsu dio lugar a una detección más precisa de las redes ECFC que se muestra en la imagen de contraste de fase (figura 2B). Por lo tanto, la calidad de imagen es fundamental para lograr resultados precisos y significativos en este ensayo. Sin embargo, umbralización diferentes métodos incluidos en la interfaz de usuario KAV permiten ajuste de análisis de imagen basado en la calidad de las imágenes de entrada.
Time-lapse microscopia identifica diferencias cualitativas y cuantitativas en vasculogénesis ECFC después de la exposición intrauterina a diabetes gestacional Recientemente, el enfoque analítico de KAV se aplicó para valorar la función ECFC fetal tras la exposición materna tipo 2 mellitus de la diabetes (T2DM) en el útero16. Usando KAV, alteración cinética de vasculogénesis identificaron en ECFCs fetales expuestas a T2DM. Sin embargo, además de T2DM exposición, que se produce a lo largo de la gestación toda, diabetes mellitus gestacional (GDM) o el desarrollo de intolerancia a la glucosa comúnmente en el tercer trimestre del embarazo, también deteriora ECFC función13. Por lo tanto, para determinar si ECFCs expuestos de GDM también mostrarán alteración cinética de formación de redes ECFC se aplicó KAV. Fase 1 (0-5 h) y fase 2 (5 + h) fueron evaluados utilizando tiempo microscopia lapso junto con análisis KAV (figura 3). Imágenes de contraste de fase representativa adquirieron al inicio de la adquisición de la imagen (0,50 h) y durante todo el curso del tiempo (5.00 y 10.00 h) representan la formación de redes ECFC en las cuatro muestras analizadas de un solo día experimental (figura 3 y Video 1 ). A pesar de la célula equivalente de carga, como se observa en las imágenes de contraste de fase a las 0,50 horas, diferencias cualitativas en la estructura de la red son evidentes en los puntos de tiempo 5,00 y 10,00 horas. ECFCs del embarazo sin complicaciones (UC) forman una red compleja e intrincada 5 horas después de la galjanoplastia, similar a nuestros datos previamente publicados16. Por el contrario, la ECFCs de GDM muestra 1 formulario (GDM1) muy pocas estructuras que no están interconectadas de la red. Sin embargo, este patrón no se refleja en todas las muestras ECFC obtenidas embarazos GDM, indicativos de la heterogeneidad entre las muestras. Muestras GDM2 y GDM3 Mostrar mayor formación de la red en comparación con GDM1, aunque los patrones de conectividad alterados en comparación con la muestra de la UC. Lo importante, KAV mide varios componentes estructurales de las redes ECFC para identificar fenotipos obvios y sutiles.
Además de generar copias de esqueleto y la máscara de la estructura de la red, KAV quantitates diez indicadores de estructura de red, incluyendo el número de estructuras de red, nodos, nodos ramificados triple, nodos cuádruple-ramificado, ramas, total longitud de la rama, longitud de rama media, redes de sucursales y nodo, total cerrado y red área16. KAV compila los datos de cada muestra en una sola tabla de valores para todas las imágenes del curso del tiempo. La tabla 1 incluye datos representativos de un estudio de proyección de imagen para una muestra ECFC. Parámetros de estructura de la red medido por KAV se organizan en columnas y los datos de imágenes secuenciales adquiridas con el tiempo se organizan en filas. Por ejemplo, en nuestros estudios, imagen 1 se obtuvo 30 min post chapado con imágenes posteriores ser recogidos cada 15 minutos los valores Raw generados por KAV entonces puede graficar o más analizadas utilizando estadísticos más complejos acerca a16.
Se muestran cinco gráficos que representan los valores medios de la estructura de la red de tres experimentos independientes para una sola muestra sin complicaciones (UC) y las tres muestras GDM (figura 4). La muestra de la UC en estos experimentos llevados a cabo de manera similar al previamente analizados UC muestras16. Anteriormente, se identificó que la ECFC vasculogénesis in vitro es bifásico, que consta de la fase 1 (0 - 5 h) y fase 2 (5-10 h)16. Este patrón es consistente en los estudios actuales, como lo demuestra el gráfico que representa datos de la red cerrada (figura 4). La muestra UC formó un mayor número de redes cerradas en comparación con los tres de las muestras GDM. Curiosamente, tres de las cuatro muestras parecen tener un tiempo similar al máximo número de redes cerradas, que se produce entre 2,5 y 3 horas. Sin embargo, la muestra GDM2 fue más lenta alcanzar máximas redes cerradas, que se produjeron horas después de la galjanoplastia. Y, a pesar la muestra GDM2 formando redes máximas menos en comparación con la muestra de la UC, las redes de forma mantuvieron de manera similar a la muestra de la UC con el tiempo. Por el contrario, GDM1 y GDM3, que formaron redes menos en comparación con la muestra de la UC, también exhibieron una reducción general en el número de red en el tiempo. En general, de la gráfica que representa el número de red cerrada, es evidente que todas las muestras ECFC muestran un patrón bifásico de la formación de la red, sin embargo la tasa de formación y el número máximo de lograr las redes varían de muestras.
Área de red representa el área promedio dentro de las redes cerradas formadas por el ECFCs. Por lo tanto, cuanto mayor sea la red cerrada número, el más pequeño las áreas de la red. Este patrón se refleja en los gráficos de área de red donde la muestra de la UC, que formó un mayor número de redes cerradas, tenía áreas más pequeñas de la red con el tiempo en comparación con las tres muestras GDM (figura 4). GDM2, que alcanzó la máximas redes cerradas más lentamente, exhiben área red alta inicialmente, sin embargo la zona estabilizada en el tiempo y esto fue más parecida a la muestra de la UC a las 15 horas. Con el tiempo, la zona media de la red en todas las muestras aumentó debido a la estabilización de la red. Sin embargo, algunas muestras, como GDM1 y GDM3, exhibieron un aumento más rápido en el área de la red, que es probablemente indicativo de estabilidad disminuida en comparación con otras muestras exhibiendo un aumento más gradual.
Expuestos al GDM ECFCs exhiben estabilidad de red reducida La proporción de ramas en los nodos es un fenotipo nuevo calculado por KAV e identificado en nuestros estudios anteriores, y esto es indicativo de red Conectividad16. En el presente estudio, la muestra de la UC tenía una proporción baja, que representaba un alto nivel de conectividad de red que se mantuvo en el tiempo (figura 4). Por el contrario, las tres muestras GDM tenían un cociente más alto de las ramas de los nodos, especialmente en la fase 2 de formación de redes. Esta observación demuestra la estabilización de las estructuras de red y conectividad reducida.
En general, GDM1 formado menos nodos y ramas en comparación con las otras muestras, con la reducción mantenida a lo largo del experimento. GDM2 y GDM3 forman y mantenido un mayor número de ramas en comparación con la muestra de la Universidad de California, especialmente entre 5-15 h. El número de nodos en las redes GDM2 y GDM3 era más similar en el número de nodos en la muestra de la Universidad de California, especialmente entre 10-15 h. Un mayor número de ramas, pero un número similar de nodos, podría explicar la rama mayor relación nodo evidente en los puntos de tiempo posteriores en las muestras GDM. Importante, cambios simultáneos en rama y nodo el número pueden ser difíciles de interpretar en gráficos separados. Sin embargo, la novela rama relación nodo ofrece una manera de evaluar cómo provocar cambios, incluyendo cambios leves difíciles de detectar en los gráficos individuales, en número de rama y de nodo, conectividad de red alterada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig1.jpg"> Figura 1 : Esquema delineando 10 parámetros cuantificados por análisis cinético de vasculogénesis (KAV). KAV quantitates diez parámetros distintos de la estructura de la red. Todos los parámetros están codificados por color y se indica en el esquema numérico (1-10). Los parámetros incluyen el número de redes de sucursales (verde, 1), cerrados (azul, 2), y nodos (rojo, 3), promedio de área de red (naranja, 4), el número de estructuras de la red (negro, 5), los nodos ramificados triple (amarillo, 6) y ramificados de cuatro nodos (púrpura, 7), así como total (9) y longitud media de la rama (10) y el cociente entre el número de ramas en el número de nodos (10). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig2.jpg"> Figura 2 : Análisis cinético de vasculogénesis (KAV) quantitates estructura de la red. (A) copias de esqueleto y la máscara de red estructuras identificadas por KAV con fase contraste imágenes proporcionan una representación visual de estructuras de red identificada y cuantificada por KAV. Barra de escala = 500 μm. (B) una imagen de contraste de fase representativa de ECFC redes 10 h la galjanoplastia que tiene poco contraste y rejilla marca de sutura imágenes individuales. Métodos diferentes de umbralización, como media o Otsu, pueden seleccionarse en el KAV plugin para mejorar la precisión de la cuantificación, si imágenes de contraste de fase tienen bajo contraste o si se produce la red. Métodos de media y Otsu umbral se muestran copias de esqueleto y la máscara de la imagen de contraste de fase. Imágenes de contraste de fase fueron capturados utilizando un objetivo de X 10. Barra de escala = 500 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig3.jpg"> Figura 3 : Exposición de GDM intrauterina altera la formación de redes ECFC. Imágenes de la formación de redes ECFC fueron capturados a intervalos de 15 minutos para 15 h por microscopía de contraste de fase. Imágenes de contraste de fase representativa en incrementos de 5 h, a partir de la hora de platear (0,5 h), se presentan para la UC y tres muestras GDM. Imágenes de contraste de fase fueron capturados utilizando un objetivo de X 10. Barra de escala = 500 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57044/57044fig4.jpg"> Figura 4 : ECFCs expuestos a intrauterina cinética de formación GDM exposición alterado red. ECFCs se obtuvieron de un embarazo sin complicaciones (UC, negro) y tres embarazos complicados por diabetes gestacional (1-3, rojo GDM). Imágenes de contraste de fase fueron capturados en el min 15 intervalos de 15 h. software de análisis cinético de vasculogénesis (KAV) cuantificado cerrados redes, áreas de red, ramas, nodos y la proporción de ramas en los nodos. Los datos ilustrados representan la media ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes para cada muestra. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57044/57044fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57044/57044video1.jpg"> Video 1: Exposición de GDM intrauterina altera la cinética de formación de redes ECFC. Imágenes de la formación de redes ECFC fueron capturados a intervalos de 15 minutos para 15 h por microscopía de contraste de fase. Imágenes de contraste de fase se presentan para la UC y tres muestras GDM más de 15 h a partir de 0.5 h. La barra de escala representa 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57044/Video1.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Imagen</td>
			<td>Total rama redes</td>
			<td>Nodos de</td>
			<td>Triples</td>
			<td>Cuádruples</td>
			<td>Sucursales</td>
			<td>Total rama longitud *</td>
			<td>Longitud de rama de AVG *</td>
			<td>Rama nodo relación</td>
			<td>Redes cerradas</td>
			<td>Red área **</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>382</td>
			<td>290</td>
			<td>278</td>
			<td>11</td>
			<td>943</td>
			<td>47210</td>
			<td>124</td>
			<td>3.25</td>
			<td>9</td>
			<td>480214</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>284</td>
			<td>345</td>
			<td>337</td>
			<td>8</td>
			<td>940</td>
			<td>50699</td>
			<td>179</td>
			<td>2.72</td>
			<td>16</td>
			<td>264469</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>205</td>
			<td>376</td>
			<td>366</td>
			<td>9</td>
			<td>910</td>
			<td>55728</td>
			<td>272</td>
			<td>2.42</td>
			<td>27</td>
			<td>150621</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>162</td>
			<td>422</td>
			<td>407</td>
			<td>15</td>
			<td>947</td>
			<td>59692</td>
			<td>368</td>
			<td>2.24</td>
			<td>40</td>
			<td>98713</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>132</td>
			<td>454</td>
			<td>441</td>
			<td>12</td>
			<td>967</td>
			<td>61923</td>
			<td>469</td>
			<td>2.13</td>
			<td>53</td>
			<td>72951</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>122</td>
			<td>435</td>
			<td>419</td>
			<td>14</td>
			<td>907</td>
			<td>62587</td>
			<td>513</td>
			<td>2.09</td>
			<td>68</td>
			<td>56948</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>88</td>
			<td>429</td>
			<td>411</td>
			<td>17</td>
			<td>852</td>
			<td>63983</td>
			<td>727</td>
			<td>1.99</td>
			<td>74</td>
			<td>51429</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>68</td>
			<td>451</td>
			<td>437</td>
			<td>13</td>
			<td>874</td>
			<td>63960</td>
			<td>941</td>
			<td>1.94</td>
			<td>74</td>
			<td>51780</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>93</td>
			<td>437</td>
			<td>417</td>
			<td>18</td>
			<td>905</td>
			<td>60901</td>
			<td>655</td>
			<td>2.07</td>
			<td>49</td>
			<td>82919</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>126</td>
			<td>511</td>
			<td>487</td>
			<td>24</td>
			<td>1075</td>
			<td>61981</td>
			<td>492</td>
			<td>2.1</td>
			<td>37</td>
			<td>116857</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>49</td>
			<td>397</td>
			<td>384</td>
			<td>12</td>
			<td>737</td>
			<td>61823</td>
			<td>1262</td>
			<td>1.86</td>
			<td>79</td>
			<td>48805</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>81</td>
			<td>376</td>
			<td>364</td>
			<td>10</td>
			<td>751</td>
			<td>56817</td>
			<td>701</td>
			<td>2</td>
			<td>63</td>
			<td>64431</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>98</td>
			<td>509</td>
			<td>482</td>
			<td>26</td>
			<td>1028</td>
			<td>60799</td>
			<td>620</td>
			<td>2.02</td>
			<td>44</td>
			<td>98056</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>93</td>
			<td>449</td>
			<td>416</td>
			<td>31</td>
			<td>909</td>
			<td>58282</td>
			<td>627</td>
			<td>2.02</td>
			<td>45</td>
			<td>94081</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="11">* redondea al más cercano micrones, ** redondea al más cercano micrones ^ 2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Datos crudos representativos de proyección de imagen de un estudian de una muestra ECFC.

Watch this Scientific Journal Video about Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro at JoVE.com

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo para la proyección de imagen de Time-lapse y fase de análisis de la vasculogénesis en vitro usando microscopía de contraste junto con el software de código abierto, análisis cinético de la vasculogénesis. Este protocolo se puede aplicar para evaluar cuantitativamente el potencial de Vasculogénica de numerosos tipos de células o condiciones experimentales que modelo de enfermedad vascular.

Análisis cinético de vasculogénesis cuantifica la dinámica de la vasculogénesis y angiogénesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...