Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
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我们非常感谢詹妮弗·蒙吉亚女士对原理图的艺术插图。我们感谢休斯敦社区公共广播电台KPFT的迈克尔·霍尼格先生的编辑协助。这项研究得到了美国糖尿病协会#1-15-BS-177（YS）和NIH R56DK118334/R01DK118334（YS）的支持。这项工作还得到了美国农业部国家粮食和农业研究所、Hatch项目1010840（YS）和R01 DK095118（SG）的支持。

此处描述的所有方法均已获得得克萨斯 A&M 大学动物护理和使用委员会 （ACUC） 的批准。所需手术工具如图1所示，手术原理图如图2所示。 
1. 解决方案
<ol><li>通过将 100 mL 的 10X HBSS（从库存）添加到 900 mL 的蒸馏水，使 1 L HBSS （1X）</li>
	<li>准备停止溶液（必须新鲜，应在1小时内使用），将50 mL的100X胎儿牛血清（FBS）加入450 mL的冰...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).</li><li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

该协议包括胶原酶灌注和消化，然后是胰岛纯化。该协议最关键的步骤是有效的注射和完全灌注胰腺1，4，7。该协议的传递方法允许酶穿过解剖途径，以更好地消化胰岛1周围的外分子组织。此外，该技术非常适合完全消化脾功能区域，其中胰岛浓度最高，为4，6。?...

文献中有两种常见的胰岛隔离方法。一个要求切除胰腺，并用手术剪刀切成小块，然后消化在胶原酶溶液1，2，3。另一种更精确的方法是使用胰腺中的导管网络来引入消化酶。以下部位已用于消化酶注射：胆汁和囊性导管的结点，胆囊进入普通胆管，或普通胆管本身1，4，5。众所周知，胰岛在胰腺中分布不均匀;脾功能区域包含最多的胰岛6。虽然第二种方法使用解剖途径提供消化酶允许更完整的灌注胰腺，包括脾科区域，但此过程通常需要夹紧或缝合从技术上讲的 Vater 的 ampulla挑战。在胰岛纯化方面，使用多密度梯度以及细胞滤网和磁缩器来纯化胰岛3、7。这些梯度的利用可能非常耗时，而菲科尔梯度可能导致小岛8的毒性损伤。
目前的协议是建立在李等人描述的方法之上的，根据我们自己和其他人的经验，增加了额外的修改。我们协议最关键的步骤是夹紧靠近肝端的普通胆管，通过Vater的ampulla注射胶原酶P来消化外分明组织，然后用摇动的水浴以机械方式加速消化1。 4，7.随后，应用"STOP"溶液抑制胰岛的进一步消化;HBSS 用于洗掉剩余的胶原酶 P 和 STOP 溶液。当Ficoll方法用于纯化人类胰岛时，据报道，与使用Percoll梯度9相比，具有更大功能能力（例如胰岛素分泌）的胰岛的产量是两倍。然而，研究已经质疑使用菲科尔梯度，由于其毒性作用的小岛1，10。据介绍，Histopaque梯度为小鼠胰岛隔离提供了最佳的纯化动力学，具有更简单的步骤和更低的成本，可产生高质量的胰岛的良好产量。在我们的协议中，Histopaque-1077用于从其他残余组织8，11中纯化胰岛。收获的小岛可以在完整的RPMI-1640培养基培养，或直接用于RNA/蛋白质定量。
我们的协议，使用胶原酶P消化和单梯度纯化步骤的组合，比其他已公布的协议更简单。我们的方法不需要苛刻的外科手术，只有几个简单的步骤。更重要的是，正如我们报道的12中那样，该协议始终能产生高质量的功能胰岛（250-350/鼠标）的良好产量。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

胰腺胰岛，也称为兰格汉斯岛，是一组内分泌细胞，产生用于葡萄糖调节和其他重要生物功能的激素。胰岛主要由五种类型的激素分泌细胞组成：β细胞分泌胰高血糖素，β细胞分泌胰岛素，β细胞分泌生长激素，β细胞分泌ghrelin，PP细胞分泌胰腺多肽。胰岛中60%至80%的细胞是β细胞，这是研究胰岛素分泌的最重要细胞群。胰腺胰岛是研究体外胰岛素分泌的重要模型系统。获得高质量的胰岛对糖尿病研究具有重要意义。大多数小岛分离程序需要技术上难以进入胶原酶注射部位、苛刻和复杂的消化程序以及多个密度梯度纯化步骤。本文采用一种简单的高产小鼠胰岛隔离方法，具有详细的描述和真实的演示，显示了以下具体步骤：1）在Vater的ampulla注射胶原酶P，一个连接胰腺导管的小区域，常见的胆管，2）酶消化和机械分离的外分子胰腺，和3）单梯度纯化步骤。这种方法的优点是使用更易访问的 Vater ampulla 注射消化酶，使用酶和机械方法的组合进行更完整的消化，以及更简单的单梯度纯化步骤。该协议每只鼠标产生大约 250-350 个小岛;和小岛适合各种活体研究。此过程的可能警告是由于酶消化和/或长时间的梯度孵育而可能损坏的小岛，所有这些可以通过仔细说明孵育时间来避免。

正确完成这个程序需要一些了解在腹腔的小鼠解剖。这允许正确识别 Vater 的安拉和夹紧公共胆管。整个过程通常需要 1⁄2 小时。同时从4-6只小鼠中分离胰岛更为有效，因此可以将多个样品离心在一起。胰岛采摘的时间因胰岛数量和消化效率而异;从 1 只鼠标中选取 250-350 个小岛可能需要大约一个小时。
本文包括一些非常逼真的图像：图3显示了小鼠的腹?...

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A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

此胰岛分离方案描述了胶原酶注射以消化外分子组织的新途径，以及从小鼠中纯化胰岛的简化梯度程序。它涉及酶消化，梯度分离/纯化，和小岛手工采摘。成功的隔离可以产生250~350个高质量和全功能的小岛每只鼠标。

胰腺胰岛与小鼠分离的简单高效协议

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

与更复杂的传统小岛隔离方法相比，该协议要求使用单密度梯度，使其劳动密集型程度显著降低，成本效益更高。该协议的主要优点是，酶直接送到胰腺，从而增强组织消化和增加胰岛产量。首先将小鼠的四肢贴在苏平位置，然后用70%乙醇喷洒身体。使用盖玻璃钳和弯曲的手术剪刀，做一个约三厘米的水平腹部皮肤切口，并拉开皮肤暴露腹壁。在腹部腹膜上进行三到四厘米的垂直切口，以完全暴露胰腺，将鼠标置于解剖显微镜下。将肝叶上级推至暴露显示为淡粉色管的胆管，轻轻将肠道从右腰椎和腹腔右侧移动，以暴露胆管和肝动脉。使用Schwartz微肌素仔细夹紧普通胆管尽可能靠近肝脏，并识别位于十二指肠教皇的Va特尔的安培，该安培由胰腺导管和普通胆管结合形成。使用微型Adson钳子拉普通胆管教学，插入一个30量程半英寸针连接到一个三毫升注射器，含有三毫升新鲜准备的胶原酶P溶液到Va特尔的安图拉推针到管道平行于容器约四分之一的容器长度。一旦针头就位，用微型Adson钳子稳定针头，并缓慢而稳定地将三毫升胶原蛋白酶P溶液注入管道。如果胰腺的头部、颈部、身体和尾部区域完全膨胀，则注射被认为是成功的。正确进入普通胆管的安培和导管是成功消化收获的关键。刺穿导管壁会降低隔离的功效。使用弯曲和微型Adson钳子，小心地拉出膨胀的胰腺，从脾脏开始，继续朝胃和沿十二指肠。然后将胰腺放在含有三毫升冰冷胶原酶P溶液的50毫升消化管中。要收获小岛，首先使用精细的手术剪刀切割胰腺三至五秒钟，然后将管子置于37摄氏度的水浴中，每分钟旋转100至120次，旋转12至13分钟。在孵育结束时，轻轻摇动管子约30秒，以扰乱组织，直到溶液是均匀的，如细砂状胰腺组织颗粒确认。一旦组织被消化，将管子放在冰上，并加入40毫升的冰冷停止溶液，以终止酶反应。轻轻搅拌颗粒后，在摆动桶离心机中旋转消化的组织，然后每次洗涤两次离心，并加热 20 毫升新鲜止损溶液。上次洗涤后，将颗粒重新在 40 毫升的冰冷 HBSS 中重新加洗三次，在上次洗涤后将颗粒重新用 5 毫升室温密度梯度溶液中重新填充。在低速下短暂旋转管，直到溶液均质，然后再向管中再添加五毫升室温密度梯度。现在使用10毫升移液器，以滴滴的方式轻轻地缓慢地将10毫升室温HSS加入管子，以允许形成梯度，并使用摆动桶离心机通过密度梯度分离来分离细胞群。在离心结束时，使用 10 毫升移液器预湿与冷 HBSS 收集密度梯度和 HBSS 之间的 5 到 10 毫升的小岛层。将小岛转移到一个新的50毫升管中，里面装着20毫升的新鲜冰冷HSS，并在摆动桶离心机中离心收集细胞。小心吸气，但最后三毫升的上一液，而不干扰颗粒和洗小岛至少三次，每次洗涤20毫升新鲜HSS。上次洗涤后，用 37 摄氏度 RMPI 1640 介质的 4 毫升更换上经剂，轻轻旋转管子以取出颗粒。立即将小岛倒入 100 毫米 Petri 盘中，用 5 毫升新鲜 RPMI 1640 介质清洗管，收集与其他小岛一起清洗的任何剩余小岛。然后使用解剖显微镜和20微升移液器尖端，从培养皿中挑选具有光滑表面的健康球形或长方形金棕色小岛，将其转移到含有10毫升完整RPMI 1640介质的新培养皿中。收集所有小岛后，将小岛放在37摄氏度的无菌孵化器中，将5%的二氧化碳在加湿空气中过夜。良好的健康小岛似乎有一个光滑的圆形，而损坏的坏小岛表现出粗糙的边缘。未消化的外分泌组织在外观上是半透明的，并且表现出不规则的形状。胶原酶P酶的适当的凝固和分布可以通过胰腺的血性部分的膨胀来证实。在低葡萄糖介质中过夜孵育可以在第二天为胰岛提供葡萄糖刺激胰岛素分泌测定，从而深入了解小岛胰岛素分泌能力。

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

小鼠胰岛隔离

科研

生物学

Neutrophil Isolation Protocol

嗜中性粒细胞的分离协议

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

人类胰岛的分离：第一部分：收集和胰腺组织消化

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

人类胰岛的分离：第二部分：人类胰岛的分离纯化及文化

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

人胰腺癌移植瘤的干细胞的分离

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

一个简单的协议提取血细胞从野生毛毛虫

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

对小鼠胰腺胰岛分离和细胞内cAMP的测定方法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

胰岛嵌段石蜡切片

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

小鼠胰腺胰岛细胞亚群中的钙动力学成像

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