Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
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Nous sommes extrêmement reconnaissants à Mme Jennifer Munguia pour son illustration artistique du diagramme schématique. Nous remercions M. Michael R. Honig de la station de radio publique communautaire KPFT de Houston pour son aide éditoriale. Cette étude a été soutenue par l'American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS), et NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Ce travail a également été soutenu par l'USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1010840 (YS) et R01 DK095118 (SG).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux (ACUC) de l'Université Texas A et M. Les outils chirurgicaux nécessaires sont indiqués à la figure 1 et le diagramme schématique de la procédure est indiqué dans la figure 2.
1. Solutions
<ol><li>Préparer la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) en ajoutant 100 ml de 10X HBSS (à partir du stock) à 900 ml d...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).</li><li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

Ce protocole comprend la perfusion et la digestion du collagène, suivie s'il y a purification des îlots. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'injection efficace et la perfusion complète du pancréas1,4,7. La méthode d'administration de ce protocole permet à l'enzyme de traverser les voies anatomiques pour mieux digérer le tissu exocrine entourant les îlots1. En outre, cette techniq...

Il y a deux méthodes communes dans la littérature pour l'isolement pancréatique d'îcle. Il faut l'exciser le pancréas et le découper en petits morceaux à l'aide de ciseaux chirurgicaux, puis le digérer dans une solution de collagène1,2,3. Une autre méthode plus précise est d'utiliser le réseau de conduits présents dans le pancréas pour introduire l'enzyme digestive. Les sites suivants ont été utilisés pour l'injection d'enzymes digestives: la jonction de la bile et le conduit cystique, la vésicule biliaire dans le canal biliaire commun, ou le canal biliaire commun lui-même1,4,5. On sait que les îlots ne sont pas répartis uniformément dans le pancréas; la région splénique contient le plus d'îlots6. Alors que la deuxième méthode utilisant des voies anatomiques pour délivrer des enzymes digestives permet une perfusion plus complète du pancréas, y compris la région splénique, cette procédure nécessite souvent le serrage ou la suture de l'ampulla de Vater qui est techniquement qui met au défi. En termes de purification des îlots, des gradients de densité multiples, ainsi que des passoires cellulaires et une rétraction magnétique ont été utilisés pour purifier les îlots3,7. L'utilisation de ces gradients peut prendre du temps et les gradients Ficoll peuvent entraîner des dommages toxiques des îlots8.
Le protocole actuel est construit sur la méthode décrite par Li et al.7, avec des modifications supplémentaires ajoutées basées sur l'expérience de nous-mêmes et d'autres1,4. Les étapes les plus critiques de notre protocole sont le serrage du canal biliaire commun près de l'extrémité du foie, l'injection de collagène P via l'ampulla de Vater pour digérer le tissu exocrine, puis en utilisant un bain d'eau secouant pour accélérer la digestion mécaniquement1, 4,7. Par la suite, une solution «STOP» est appliquée pour inhiber la digestion des îlots; HBSS est utilisé pour laver la solution restante de collagène P et STOP. Lorsque la méthode Ficoll a été utilisée pour purifier les îlots humains, le rendement a été signalé comme étant deux fois plus élevé que les îlots ayant une plus grande capacité fonctionnelle (p. ex., sécrétion d'insuline) par rapport à l'utilisation des gradients Percoll9. Cependant, des études ont remis en question l'utilisation du gradient Ficoll en raison de son effet toxique sur les îlots1,10. Il a été rapporté que le gradient Histopaque fournit la cinétique optimale de purification pour l'isolementd'îlots de souris, qui produit le bon rendement des îlots de haute qualité avec des étapes plus simples et le coût inférieur 1. Dans notre protocole, Histopaque-1077 est utilisé pour purifier les îlots d'autres tissus résiduels8,11. Les îlots récoltés peuvent être cultivés dans des milieux COMPLETs RPMI-1640, ou directement utilisés dans la quantitation d'ARN/protéines.
Notre protocole, utilisant une combinaison de digestion de P de collagène et d'une étape simple de purification de gradient, est plus simple que d'autres protocoles édités. Notre méthode ne nécessite pas d'interventions chirurgicales exigeantes et n'a que quelques étapes simples. Plus important encore, ce protocole produit constamment un bon rendement des îlots fonctionnels de haute qualité (250-350/mouse) comme nous l'avons rapporté12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

Les îlots pancréatiques, également appelés les îlots de Langerhans, sont un groupe de cellules endocriniennes qui produit des hormones pour la régulation du glucose et d'autres fonctions biologiques importantes. Les îlots se composent principalement de cinq types de cellules sécrétrices d'hormones : les cellules sécrètent le glucagon, les cellules sécrètent l'insuline, les cellules sécrètent la somatostatine, les cellules sécrètent la ghréline et les cellules PP sécrètent du polypeptide pancréatique. Soixante à 80 % des cellules des îlots sont des cellules d'A, qui sont la population cellulaire la plus importante pour étudier la sécrétion d'insuline. Les îlots pancréatiques sont un système modèle crucial pour étudier la sécrétion d'insuline ex vivo. L'acquisition d'îlots de haute qualité est d'une grande importance pour la recherche sur le diabète. La plupart des procédures d'isolement d'înet exigent techniquement difficile d'accéder au site de l'injection de collagène, des procédures dures et complexes de digestion, et des étapes multiples de purification de gradient de densité. Cet article comporte une méthode simple d'isolement d'îlet de souris à haut rendement avec des descriptions détaillées et des démonstrations réalistes, montrant les étapes spécifiques suivantes : 1) injection de collagène P à l'ampulla de Vater, une petite zone joignant le conduit pancréatique et le canal biliaire commun, 2) la digestion enzymatique et la séparation mécanique du pancréas exocrine, et 3) une seule étape de purification de gradient. Les avantages de cette méthode sont l'injection d'enzyme digestive en utilisant l'ampulla plus accessible de Vater, une digestion plus complète en utilisant la combinaison d'approches enzymatiques et mécaniques, et une étape de purification de gradient unique plus simple. Ce protocole produit environ 250 à 350 îlots par souris; et les îlots conviennent à diverses études ex vivo. Les mises en garde possibles de cette procédure sont des îlots potentiellement endommagés en raison de la digestion enzymatique et/ou de l'incubation prolongée de gradient, qui peuvent toutes être en grande partie évitées par la justification d'annonces soigneuses du temps d'incubation.

L'achèvement approprié de cette procédure exige une certaine compréhension de l'anatomie de la souris dans la cavité abdominale. Cela permet d'identifier correctement l'ampulla de Vater et le serrage du canal biliaire commun. L'ensemble de la procédure prend normalement 1/2 h. Il est plus efficace d'isoler les îlots de 4 à 6 souris en même temps, de sorte que plusieurs échantillons peuvent être centrifuges ensemble. Le temps de la cueillette des îlots varie en fonction du nombre d'îlots et de l'efficacité d...

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A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Ce protocole exige l’utilisation d’un gradient de densité unique le rendant sensiblement moins laborieux et plus rentable comparé aux méthodes conventionnelles plus complexes d’isolement d’îlot. Le principal avantage de ce protocole est que l’enzyme est livrée directement au pancréas, ce qui entraîne une digestion accrue des tissus et une augmentation du rendement des îlots. Commencez par enregistrer les membres de la souris en position supine et pulvériser le corps avec 70% d’éthanol.À l’aide de forceps en verre de couverture et de ciseaux chirurgicaux incurvés, faites une incision abdominale horizontale d’environ trois centimètres de la peau et ouvrez la peau pour exposer la paroi abdominale. Faire une incision verticale de trois à quatre centimètres sur le péritoine abdominal pour exposer complètement le pancréas et placer la souris sous un microscope disséquant. Poussez le lobe hépatique de façon supérieure pour exposer le canal biliaire qui apparaît comme un tube rose pâle et déplacez doucement les intestins de la région lombaire et iliaque droite à droite de la cavité abdominale pour exposer le canal biliaire et l’artère hépatique.Utilisez les micro serrefines Schwartz pour serrer soigneusement le canal biliaire commun le plus près possible du foie et identifier l’ampulla de Vater qui est située à la papille duodénanale et formée par l’union du conduit pancréatique et du canal biliaire commun. À l’aide de forceps micro Adson pour tirer le canal biliaire commun enseigné, insérez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30 fixée à une seringue de trois millilitres contenant trois millilitres de solution de collagène P fraîchement préparée dans l’ampulla de Vater poussant l’aiguille dans le conduit parallèle au navire pendant environ un quart de la longueur du navire. Une fois l’aiguille en place, stabiliser l’aiguille avec des forceps micro Adson et injecter lentement et régulièrement trois millilitres de solution de collagène P dans le conduit.L’injection est considérée comme réussie si les régions de la tête, du cou, du corps et de la queue du pancréas sont entièrement gonflées. L’entrée appropriée dans l’ampulla et la cannulation du canal biliaire commun sont critiques pour une récolte réussie de digestion. Percer les parois ductal réduit l’efficacité de l’isolement.À l’aide de forceps incurvés et micro Adson, retirez soigneusement le pancréas gonflé à partir de la rate et continuez vers l’estomac et le long du dudénome. Placez ensuite le pancréas dans un tube de digestion de 50 millilitres contenant trois millilitres de solution glacée de collagène P. Pour récolter les îlots, utilisez d’abord de fins ciseaux chirurgicaux pour hacher le pancréas pendant trois à cinq secondes avant de placer le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius à 100 à 120 rotations par minute pendant 12 à 13 minutes.À la fin de l’incubation, secouez doucement le tube pendant environ 30 secondes pour perturber le tissu jusqu’à ce que la solution soit homogène, comme le confirment les particules de tissu pancréatique de sable fin. Dès que le tissu est digéré, placez le tube sur la glace et ajoutez 40 millilitres de solution d’arrêt froid pour mettre fin à la réaction enzymatique. Après avoir doucement perturbé la pastille, faites tourner le tissu digéré dans une centrifugeuse balançante suivie de deux centrifugations avec 20 millilitres de solution d’arrêt frais par lavage.Après le dernier lavage, resuspendez la pastille dans 40 millilitres de HBSS glacé pour trois lavages supplémentaires, en réutilisant la pastille en cinq millilitres de solution de gradient de densité de température ambiante après le dernier lavage. Vortex le tube brièvement à basse vitesse jusqu’à ce que la solution soit homogénéisée avant d’ajouter un autre gradient de densité de température ambiante de cinq millilitres au tube. Utilisez maintenant une pipette de 10 millilitres pour ajouter doucement et lentement 10 millilitres de HBSS à température ambiante au tube d’une manière goutte-sage pour permettre la formation d’un gradient et utiliser une centrifugeuse balançante de seau pour isoler les populations cellulaires par séparation de gradient de densité.À la fin de la centrifugation, utilisez une pipette de 10 millilitres pré-humide avec du HBSS froid pour recueillir de cinq à 10 millilitres de la couche d’îlot entre le gradient de densité et le HBSS. Transférer les îlots dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de HBSS froid et recueillir les cellules par centrifugation dans une centrifugeuse balançante. Aspirez soigneusement tous sauf les trois derniers millilitres du supernatant sans déranger la pastille et lavez les îlots au moins trois fois de plus avec 20 millilitres de HBSS frais par lavage.Après le dernier lavage, remplacer le supernatant par quatre millilitres de 37 degrés Celsius RMPI 1640 moyen et tourbillonner doucement le tube pour déloger la pastille. Versez immédiatement les îlots dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et lavez le tube avec cinq millilitres de rpmi frais 1640 moyen pour recueillir les îlots restants mettant en commun le lavage avec les autres îlots. Ensuite, utilisez un microscope à dissection et une pointe de pipette de 20 microlitres pour choisir des îlots brun doré sphériques ou oblongs sains avec une surface lisse de la boîte de Petri pour le transfert dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 10 millilitres de rpmi complet 1640 milieu.Lorsque tous les îlots ont été ramassés, placez les îlots dans un incubateur stérile à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans l’air humidifié pendant la nuit. Les îlots en bonne santé semblent avoir une forme ronde lisse tandis que les îlots endommagés présentent des bords rugueux. Le tissu exocrine non digéré est translucide dans l’aspect et démontre une forme irrégulière.Une cannulation et une distribution appropriées de l’enzyme de collagène P peuvent être confirmées par une inflation de la partie splénique du pancréas. L’incubation pendant la nuit dans les médias à faible teneur en glucose peut amorce les îlots pour un test de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose le lendemain permettant un aperçu de la capacité sécrétaire d’insuline des îlots.

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