Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
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Wir sind Frau Jennifer Munguia sehr dankbar für ihre künstlerische Darstellung des Schemas. Wir danken Herrn Michael R. Honig von Houstons Community Public Radio Station KPFT für seine redaktionelle Unterstützung. Diese Studie wurde von der American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS) und NIH R56DK1118334/R01DK118334 (YS) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1010840 (YS) und R01 DK095118 (SG) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Texas A&M University genehmigt. Der Bedarf an chirurgischen Werkzeugen ist in Abbildung 1 und das schematische Diagramm des Verfahrens in Abbildung 2dargestellt.
1. Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) vor, indem Sie 100 ml 10X HBSS (ab Lager) zu 900 ml destilliertem Wasser hinzufügen, um 1 L HBSS (1X) herzustellen.</l...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).</li><li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

Dieses Protokoll umfasst Kollagenase-Perfusion und Verdauung, gefolgt von der Reinigung von Inselchen. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die effektive Injektion und vollständige Perfusion der Bauchspeicheldrüse1,4,7. Die Abgabemethode dieses Protokolls ermöglicht es dem Enzym, die anatomischen Wege zu durchqueren, um das Exokringewebe, das die Inselchen umgibt, besser zu verdauen1. Darüb...

Es gibt zwei gängige Methoden in der Literatur für die Pankreas-Islet-Isolierung. Man erfordert, die Bauchspeicheldrüse auszugraben und mit einer chirurgischen Schere in kleine Stücke zu zersieben und sie dann in einer Kollagenaselösung1,2,3zu verdauen. Eine weitere genauere Methode ist die Verwendung des In-Kanal-Netzwerks in der Bauchspeicheldrüse zur Einführung von Verdauungsenzymen. Folgende Stellen wurden für die Injektion von Verdauungsenzymen verwendet: die Verbindung des Gallen- und Cystkanals, die Gallenblase in den gemeinsamen Gallengang oder der gemeinsame Gallengang selbst1,4,5. Es ist bekannt, dass Inselchen nicht gleichmäßig in der Bauchspeicheldrüse verteilt sind; der Splenic-Bereich enthält die meisten Inselchen6. Während die zweite Methode, die anatomische Wege zur Lieferung von Verdauungsenzymen verwendet, eine vollständigere Durchblutung der Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Milzregion, ermöglicht, erfordert dieses Verfahren oft das Spannen oder DasNusn der Ampulla von Vater, die technisch schwierig. In Bezug auf die Inselreinigung wurden mehrfachdichte Gradienten sowie Zellsiebe und magnetischer Rückzug verwendet, um die Inselchen zu reinigen3,7. Die Nutzung dieser Steigungen kann zeitaufwändig sein und die Ficoll-Gradienten können zu toxischen Schäden an Inselchen8führen.
Das aktuelle Protokoll basiert auf der von Li et al.7beschriebenen Methode, wobei zusätzliche Modifikationen hinzugefügt werden, die auf der Erfahrung von uns und anderen basieren1,4. Die kritischsten Schritte unseres Protokolls sind das Spannen des gemeinsamen Gallengangs in der Nähe des Leberendes, das Injizieren der Kollagenase P über die Ampulla von Vater, um das Exokringewebe zu verdauen, und dann mit einem schütteren Wasserbad, um die Verdauung mechanisch zu beschleunigen1, 4,7. Anschließend wird eine "STOP"-Lösung angewendet, um die weitere Verdauung der Inselchen zu hemmen; HBSS wird verwendet, um die verbleibende Kollagenase P und STOP Lösung abzuwaschen. Wenn die Ficoll-Methode verwendet wurde, um menschliche Inselchen zu reinigen, wurde berichtet, dass die Ausbeute doppelt so hoch war wie die Inseln mit größerer Funktioneller Fähigkeit (z. B. Insulinsekretion) im Vergleich zur Verwendung von Percoll-Gradienten9. Studien haben jedoch die Verwendung von Ficoll Gradienten aufgrund seiner toxischen Wirkung auf die Inseln1,10in Frage gestellt. Es wurde berichtet, dass der Histopaque Gradient eine optimale Reinigungskinetik für die Isolierung von Mausinseln bietet, was eine gute Ausbeute an hochwertigen Inselchen mit einfacheren Schritten und niedrigerenKosten1 erzeugt. In unserem Protokoll wird Histopaque-1077 verwendet, um Inselchen aus anderen Restgeweben zu reinigen8,11. Die geernteten Inseln können in kompletten RPMI-1640-Medien kultiviert oder direkt in der RNA/Protein-Quantitation verwendet werden.
Unser Protokoll, das eine Kombination aus Kollagenase P-Verdauung und einem einzigen Gradientenreinigungsschritt verwendet, ist einfacher als andere veröffentlichte Protokolle. Unsere Methode erfordert keine anspruchsvollen chirurgischen Eingriffe und hat nur wenige einfache Schritte. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll konsequent eine gute Ausbeute an hochwertigen funktionstüchtigen Inseln (250-350/Maus) erzeugt, wie berichtet12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

Pankreasinseln, auch Die Inselchen langerhans genannt, sind ein Cluster von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulation und andere wichtige biologische Funktionen produziert. Die Inselchen bestehen in erster Linie aus fünf Arten von hormonsekretierenden Zellen: Zellen sekrete Glucagon, Zellen sezernieren Insulin, Zellen sezernieren Somatostatin, Zellen sezernieren Ghrelin und PP-Zellen sezernieren Pankreaspolypeptid. Sechzig bis 80% der Zellen in den Inselchen sind Zellen, die die wichtigste Zellpopulation sind, um die Insulinsekretion zu untersuchen. Pankreasinseln sind ein entscheidendes Modellsystem zur Untersuchung der Ex-vivo-Insulinsekretion. Der Erwerb hochwertiger Inselchen ist für die Diabetesforschung von großer Bedeutung. Die meisten Isolierungsverfahren auf Der Iseutiniten erfordern technisch schwierigen Zugriff auf die Stelle der Kollagenaseinjektion, harte und komplexe Verdauungsverfahren und Schritte zur Reinigung von Mehrfachdichtegradienten. Dieses Papier verfügt über eine einfache High-Yield-Maus-Insel-Isolationsmethode mit detaillierten Beschreibungen und realistischen Demonstrationen, die die folgenden spezifischen Schritte zeigt: 1) Injektion der Kollagenase P an der Ampulla von Vater, ein kleiner Bereich, der den Pankreaskanal verbindet und der gemeinsame Gallengang, 2) enzymatische Verdauung und mechanische Trennung der exokrinen Bauchspeicheldrüse und 3) ein einziger Gradientenreinigungsschritt. Die Vorteile dieser Methode sind die Injektion des Verdauungsenzyms mit der leichter zugänglichen Ampulla von Vater, eine vollständigere Verdauung mit Kombination enzymatischer und mechanischer Ansätze und ein einfacherer Einzelgradientenreinigungsschritt. Dieses Protokoll erzeugt ca. 250–350 Inselchen pro Maus; und Inselchen eignen sich für verschiedene Ex-vivo-Studien. Mögliche Vorbehalte dieses Verfahrens sind potenziell geschädigte Inseln aufgrund enzymatischer Verdauung und/oder längerer Gradienteninkubation, die alle durch sorgfältige Ad-Begründung der Inkubationszeit weitgehend vermieden werden können.

Der ordnungsgemäße Abschluss dieses Verfahrens erfordert ein gewisses Verständnis der Mausanatomie in der Bauchhöhle. Dies ermöglicht eine ordnungsgemäße Identifizierung der Ampulla von Vater und das Spannen des gemeinsamen Gallengangs. Die gesamte Prozedur dauert normalerweise 1-2 h. Es ist effizienter, Inselchen von 4–6 Mäusen gleichzeitig zu isolieren, so dass mehrere Proben zusammen zentrifugiert werden können. Die Zeit für die Pflückerung variiert je nach Anzahl der Inselchen und der Effizienz der Verda...

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A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dieses Protokoll erfordert die Verwendung eines einzigen Dichtegradienten, der es im Vergleich zu komplexeren konventionellen Islet-Isolationsmethoden deutlich arbeitsintensiver und kostengünstiger macht. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass das Enzym direkt an die Bauchspeicheldrüse abgegeben wird, was zu einer verbesserten Gewebeverdauung und einer erhöhten Islet-Ausbeute führt. Beginnen Sie, indem Sie die Gliedmaßen der Maus in der Supine-Position kleben und den Körper mit 70% Ethanol besprühen.Mit CoverglassZangen und gekrümmten chirurgischen Scheren, machen Sie einen etwa drei Zentimeter horizontalen Bauchhautschnitt und ziehen Sie die Haut auf, um die Bauchwand freizulegen. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von drei bis vier Zentimetern am Bauchperitoneum, um die Bauchspeicheldrüse vollständig freizulegen und die Maus unter ein Sezierendes Mikroskop zu stellen. Drücken Sie den Leberlappen überlegen, um den Gallengang freizulegen, der als blassrosa Röhre erscheint, und bewegen Sie den Darm sanft von der rechten Lenden- und Iliasregion nach rechts von der Bauchhöhle, um den Gallengang und die Leberarterie freizulegen.Verwenden Sie Schwartz micro serrefines, um den gemeinsamen Gallengang so nah wie möglich an der Leber zu klemmen und die Ampulla von Vater zu identifizieren, die sich an der Zwölffingerdarmpapille befindet und durch die Vereinigung des Bauchspeicheldrüsenkanals und des gemeinsamen Gallengangs gebildet wird. Mit Mikro-Adson-Zangen, um den gemeinsamen Gallengang zu ziehen, legen Sie eine 30-Spur-Halb-Zoll-Nadel, die an einer Drei-Milliliter-Spritze befestigt ist, die drei Milliliter frisch zubereitete Kollagennase P-Lösung enthält, in die Ampulla von Vater, die die Nadel parallel zum Gefäß für etwa ein Viertel der Gefäßlänge in den Kanal drückt. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, stabilisieren Sie die Nadel mit Mikro Adson Zange und langsam und stetig injizieren drei Milliliter Kollagenase P Lösung in den Kanal.Die Injektion gilt als erfolgreich, wenn die Kopf-, Nacken-, Körper- und Schwanzbereiche der Bauchspeicheldrüse vollständig aufgeblasen sind. Der richtige Einstieg in die Ampulla und die Cannulation des gemeinsamen Gallengangs sind entscheidend für eine erfolgreiche Verdauungsernte. Das Durchstechen der duktalen Wände reduziert die Wirksamkeit der Isolierung.Mit gekrümmten und mikroadon Zangen, ziehen Sie vorsichtig die aufgeblasene Bauchspeicheldrüse beginnend an der Milz und weiter in Richtung des Magens und entlang des Zwölffingerdarms. Dann legen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine 50 Milliliter Verdauungsröhre mit drei Millilitere eiskalte Kollagenase P-Lösung. Um die Inselchen zu ernten, verwenden Sie zuerst eine feine chirurgische Schere, um die Bauchspeicheldrüse für drei bis fünf Sekunden zu hacken, bevor Sie das Rohr in einem 37 Grad Celsius Wasserbad bei 100 bis 120 Umdrehungen pro Minute für 12 bis 13 Minuten platzieren.Am Ende der Inkubation schütteln Sie das Rohr vorsichtig für etwa 30 Sekunden, um das Gewebe zu stören, bis die Lösung homogen ist, wie durch feine sandartige Pankreasgewebepartikel bestätigt wird. Sobald das Gewebe verdaut ist, legen Sie die Röhre auf Eis und fügen Sie 40 Milliliter eiskalte Stop-Lösung hinzu, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Nach sanftem Stören des Pellets das verdaute Gewebe in einer schwingenden Eimerzentrifuge, gefolgt von zwei Zentrifugationen mit 20 Milliliterfrischer Stop-Lösung pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche das Pellet in 40 Millilitereeisis HBSS für drei zusätzliche Waschungen wieder aufsetzen und das Pellet in fünf Milliliterraum-Temperaturgradientenlösung nach der letzten Wäsche wieder aufhängen. Wirbeln Sie das Rohr kurz bei niedriger Geschwindigkeit, bis die Lösung homogenisiert wird, bevor Sie weitere fünf Milliliter Raumtemperaturgradient in das Rohr einfügen. Verwenden Sie nun eine 10-Milliliter-Pipette, um 10 Milliliter Raumtemperatur-HBSS in tropfenweise in das Rohr zu geben, um die Bildung eines Gradienten zu ermöglichen und eine schwingende Eimerzentrifuge zu verwenden, um die Zellpopulationen durch Dichtegradiententrennung zu isolieren.Verwenden Sie am Ende der Zentrifugation eine 10 Milliliter Pipette vornass mit kaltem HBSS, um fünf bis zehn Milliliter der Isletschicht zwischen dichtem Gradienten und HBSS zu sammeln. Übertragen Sie die Inselchen in eine neue 50-Milliliter-Röhre mit 20 Milliliterfrischer eiskaltem HBSS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in einer schwingenden Eimerzentrifuge. Alle bis auf die letzten drei Milliliter des Überstandes vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören und die Inselchen mindestens drei weitere Male mit 20 Millilitern frischer HBSS pro Wäsche zu waschen.Nach der letzten Wäsche, ersetzen Sie den Überstand mit vier Milliliter 37 Grad Celsius RMPI 1640 medium und wirbeln Sie das Rohr sanft, um das Pellet zu lösen. Gießen Sie die Inseln sofort in eine 100-Millimeter-Petrischale und waschen Sie das Rohr mit fünf Millilitern frischem RPMI 1640 Medium, um alle verbleibenden Inselchen zu sammeln, die die Wäsche mit den anderen Inseln bündeln. Dann verwenden Sie ein Seziermikroskop und eine 20 Mikroliter Pipettenspitze, um gesunde kugelförmige oder längliche goldbraune Inselchen mit einer glatten Oberfläche aus der Petrischale für den Transfer in eine neue Petrischale mit 10 Millilitern komplettem RPMI 1640 Medium zu pflücken.Wenn alle Inseln gesammelt wurden, legen Sie die Inseln in einem sterilen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in befeuchteter Luft über Nacht. Gute gesunde Inselchen scheinen eine glatte runde Form zu haben, während schlecht beschädigte Inselchen raue Kanten aufweisen. Unverdautes Exokringewebe ist lichtdurchlässig im Aussehen und zeigt eine unregelmäßige Form.Eine richtige Konservenierung und Verteilung des Kollagenase-P-Enzyms kann durch eine Inflation des Milzteils der Bauchspeicheldrüse bestätigt werden. Die nächtliche Inkubation in glukosearmen Medien kann die Inselchen am nächsten Tag für einen glukosestimulierten Insulinsekretionstest grundieren, der Einen Einblick in die Insulinsekretorienkapazität der Inseln ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Forschung

Biologie

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophile Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...