Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה לגברת ג'ניפר Munguia להמחשה האמנותית של התרשים הסכימטי. אנו מודים למר מייקל ר. הוניג בתחנת הרדיו הציבורית של יוסטון, KPFT לקבלת סיוע מערכתי. מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת #1 -15-BS-177 (YS), ו-NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של מזון וחקלאות, הצוהר פרויקט 1010840 (YS) ו R01 DK095118 (SG).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (ACUC) של אוניברסיטת טקסס A & M. הכלים המנתחים צריכים מוצגים באיור 1 והתרשים הסכמטי של השגרה מוצג באיור 2.
1. פתרונות
<ol><li>להכין את הפתרון מאוזנת מלח של האנק (HBSS) על ידי הוספת 100 mL ש?...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).</li><li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

פרוטוקול זה כולל קולגן הפרזיה ועיכול, ואחריו טיהור של איונים. הצעדים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם הזרקה יעילה זלוף השלם של הלבלב1,4,7. שיטת המסירה של פרוטוקול זה מאפשרת לאנזים לחצות את המסלולים האנטומיים כדי לעכל טוב יותר את רקמת אקסוקר...

ישנן שתי שיטות נפוצות בספרות עבור בידוד איון הלבלב. האדם דורש לנצל את הלבלב ולהכניס אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיים, ולאחר מכן לעכל אותו בתמיסה הקולגן1,2,3. עוד שיטה מדויקת יותר היא להשתמש ברשת של צינורות הנמצאים בלבלב כדי להחדיר אנזים העיכול. האתרים הבאים שימשו עבור הזרקת אנזים העיכול: הצומת של צינור המרה פיברוזיס, המרה לתוך צינור המרה המשותף, או צינור מרה משותף עצמו1,4,5. ידוע כי איונים אינם מופצים באופן שווה בלבלב; אזור הטחול מכיל את מרבית האיים6. בעוד השיטה השנייה באמצעות נתיבי אנטומי לספק אנזימי העיכול מאפשר להשלים מלאה יותר של הלבלב, כולל האזור הטחול, הליך זה דורש לעתים קרובות לולאה או מעבר ampulla של Vater כי הוא מבחינה טכנית מאתגר. מבחינת הטיהור של איון, מעברי צפיפות מרובים, כמו גם שפכים סלולריים והנסיגה המגנטית שימשו כדי לטהר את איונים3,7. הניצול של מעברי הצבע האלה יכול לגזול זמן ומעברי הצבע של פיקדול עלולים לגרום לנזק רעיל של איונים8.
הפרוטוקול הנוכחי בנוי על השיטה המתוארת על ידי Li et al.7, עם שינויים נוספים שנוספו על בסיס החוויה של עצמנו ואחרים1,4. הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שלנו הם לסדר את צינור המרה המשותף ליד סוף הכבד, הזרקת הקוליואז P דרך ampulla של Vater לעכל את רקמת אקסוקרינית, ולאחר מכן באמצעות אמבט מים לרעוד כדי לזרז את העיכול מכנית1, 4,7. לאחר מכן, הפתרון ' STOP ' מיושם על מנת לעכב את העיכול של איונים; HBSS משמש כדי לשטוף את שאר הקולגן בתמיסה ו STOP פתרון. כאשר שימש השיטה לטיהור האיים האנושיים, התשואה דווחה כפליים מהאיונים בעלי יכולת תפקודית גדולה יותר (למשל, הפרשת אינסולין) לעומת השימוש במעברי הצבע של חלחול9. עם זאת, מחקרים חקרו את השימוש בהדרגה בעקבות ההשפעה הרעילה שלה על איונים1,10. זה דווח כי הדרגתי Histopaque מספק קינטיקה טיהור אופטימלי עבור בידוד איון העכבר, אשר מייצרת תשואה טובה של איונים באיכות גבוהה עם צעדים פשוטים יותר ועלות נמוכה1. בפרוטוקול שלנו, Histopaque-1077 משמש לטיהור איונים משאר רקמות שיורית8,11. איונים שנקטפו יכול להיות תרבותי בRPMI מלאה-1640 מדיה, או מנוצל ישירות ב-RNA/חלבון כימות.
הפרוטוקול שלנו, באמצעות שילוב של העיכול הקולגן P וצעד טיהור יחיד מעבר צבע, הוא פשוט יותר מאשר פרוטוקולים שפורסמו אחרים. השיטה שלנו לא דורשת הליכים כירורגיים תובעניים ויש לו רק כמה צעדים פשוטים. חשוב מכך, פרוטוקול זה מייצר בעקביות תשואה טובה של איונים פונקציונליים באיכות גבוהה (250-350/עכבר) כפי שדווחו12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

איולי הלבלב, הנקרא גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצרת הורמונים עבור רגולציה של גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. איונים בעיקר מורכב מחמישה סוגים של הורמון הפרשת תאים: α תאים להפריש glucagon, תאים β להפריש אינסולין, δ תאים להפריש סוסטטין, ε תאים להפריש ghrelin, ו PP תאים להפריש polypeptide הלבלב. 60 עד 80% התאים באיים הם β תאים, שהם אוכלוסיית התאים החשובים ביותר ללמוד הפרשת אינסולין. איי הלבלב הם מערכת מודל חיונית כדי ללמוד לשעבר הפרשת אינסולין vivo. הקניית איים באיכות גבוהה היא בעלת חשיבות רבה לחקר הסוכרת. רוב הליכי בידוד של איון דורשים מבחינה טכנית קשה לגשת לאתר של הזרקת קולגן, הליכי עיכול קשים ומורכבים, ושלבי הדרגתי דחיסות מרובים. נייר זה כולל פשוט תשואה גבוהה העכבר איון בידוד שיטה עם תיאורים מפורטים והפגנות מציאותי, מראה את הצעדים הבאים ספציפיים: 1) הזרקה של הקולגן בתוך ampulla של vater, אזור קטן הצטרפות תעלת הלבלב ו צינור המרה המשותף, 2) העיכול אנזימטי והפרדה מכנית של הלבלב אקסוקרינית ו 3) צעד אחד טיהור הדרגתי. היתרונות של שיטה זו הם הזרקה של אנזים העיכול באמצעות ampulla נגיש יותר של Vater, העיכול מלאה יותר באמצעות שילוב של גישות אנזימטיות ומכני, ופשוט צעד טיהור יחיד הדרגתי. פרוטוקול זה מייצר כ-250-350 איים לכל עכבר; ו איונים מתאימים למחקרים שונים vivo ex. האזהרות האפשריות של הליך זה עלולות להינזק איונים בגלל עיכול אנזימטי ו/או דגירה ממושכת של הדרגתי, אשר כולם יכולים להימנע במידה רבה על ידי הצדקת מודעות לזמן הדגירה.

השלמת נאותה של הליך זה דורשת הבנה מסוימת של אנטומיה של העכבר בחלל הבטן. זה מאפשר זיהוי הנכון של ampulla של Vater ולסדר את צינור המרה המשותף. ההליך כולו בדרך כלל לוקח 1 – 2 h. זה יעיל יותר לבודד איונים מ 4-6 עכברים באותו זמן, כך כמה דגימות יכול להיות centrifuged יחד. הזמן עבור הקטיף איון משתנה, בהתאם למספר איו...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice at JoVE.com

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

פרוטוקול זה דורש שימוש שיפוע צפיפות אחת מה שהופך אותו באופן משמעותי פחות עבודה אינטנסיבית וחסכונית יותר בהשוואה לשיטות בידוד איון קונבנציונליות מורכבות יותר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא כי האנזים מועבר ישירות ללבלב וכתוצאה מכך עיכול רקמות משופרת ותפוקת איון מוגברת. התחל על ידי הקשה על הגפיים של העכבר בתמקמת supine ו ריסוס הגוף עם 70% אתנול.באמצעות ממטרות coverglass ומספריים כירורגיים מעוקל, לעשות חתך עור בטן אופקי כשלושה סנטימטרים ולמשוך לפתוח את העור כדי לחשוף את דופן הבטן. בצע חתך אנכי של שלושה עד ארבעה סנטימטרים על צפק הבטן כדי לחשוף באופן מלא את הלבלב ולמקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח. לדחוף את האונה הכבד מעולה לחשוף את צינור המרה המופיע צינור ורוד חיוור בעדינות להזיז את המעיים מאזור המותני הימני iliac מימין לחלל הבטן כדי לחשוף את צינור המרה ואת עורק הכבד.השתמשו ב-Schwartz micro serrefines כדי להדק בזהירות את צינור המרה המשותף קרוב ככל האפשר לכבד ולזהות את האמפולה של ואגר הממוקמת בבית האפיפיורות ונוצרת על ידי איחוד צינור הלבלב וצינור המרה המשותף. באמצעות מטחות מיקרו אדסון כדי למשוך את צינור המרה המשותף לימד, להכניס מחט 30 מד חצי אינץ', מחובר מזרק שלושה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של פתרון P קולגנס מוכן טרי לתוך אמפולה של ויטר דוחף את המחט לתוך הצינור במקביל לכלי במשך כרבע אורך הכלי. ברגע המחט היא במקום, לייצב את המחט עם מטח מיקרו אדסון לאט ובהתמדה להזריק שלושה מיליליטר של פתרון קולגנס P לתוך הצינור.הזריקה נחשבת מוצלחת אם אזורי הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב מנופחים לחלוטין. כניסה נכונה לתוך אמפולה ו cannulation של צינור המרה המשותף הם קריטיים עבור קציר עיכול מוצלח. פירסינג הקירות צינורית מפחית את היעילות של הבידוד.באמצעות מדפים מעוגלים ומיקרו אדסון, בזהירות לשלוף את הלבלב מנופח החל הטחול וממשיך לכיוון הבטן לאורך התריסיון. לאחר מכן מניחים את הלבלב בצינור עיכול 50 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של תוסף קולגנס P קר כקרח. כדי לקצור את האיים, ראשית להשתמש מספריים כירורגיים עדין לקצוץ את הלבלב במשך שלוש עד חמש שניות לפני הצבת הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 100 עד 120 סיבובים לדקה במשך 12 עד 13 דקות.בסוף הדגירה, בעדינות לנער את הצינור במשך כ 30 שניות כדי לשבש את הרקמה עד הפתרון הוא הומוגני כפי שאושר על ידי חלקיקי רקמת הלבלב דמוי חול בסדר. ברגע שהרקמות מתעכלות, מניחים את הצינור על קרח ומוסיפים 40 מיליליטר של פתרון עצירה קרה כקרח כדי לסיים את התגובה האנזימטית. לאחר שיבוש עדין של גלולה, לסובב את הרקמה מתעכל צנטריפוגה דלי מתנדנד ואחריו שני צנטריפוגות עם 20 מיליליטר של פתרון עצירה טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר את גלולה ב 40 מיליליטר של HBSS קר כקרח עבור שלוש שטיפות נוספות, resuspending את גלולה בחמישה מיליליטר של פתרון שיפוע טמפרטורת החדר לאחר הכביסה האחרונה. Vortex הצינור לזמן קצר במהירות נמוכה עד הפתרון הוא homogenized לפני הוספת עוד חמישה מיליליטר של שיפוע טמפרטורת החדר לצינור. עכשיו להשתמש פיפטה 10 מיליליטר בעדינות ולאט לאט להוסיף 10 מיליליטר של טמפרטורת החדר HBSS לצינור בצורה טיפה חכם כדי לאפשר היווצרות של שיפוע ולהשתמש צנטריפוגה דלי מתנדנד לבודד את אוכלוסיות התאים על ידי הפרדת שיפוע צפיפות.בסוף הצנטריפוגה, השתמש פיפט 10 מיליליטר רטוב מראש עם HBSS קר לאסוף חמישה עד 10 מיליליטר של שכבת האיון בין שיפוע הצפיפות HBSS. להעביר את האיים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של HBSS קר קרח טרי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה דלי מתנדנד. בזהירות שאפו את כל אבל שלושת המיליליטרים האחרונים של supernatant מבלי להפריע גלולה ולשטוף את האיים לפחות שלוש פעמים נוספות עם 20 מיליליטר של HBSS טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, להחליף את supernatant עם ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RMPI 1640 בינוני בעדינות מערבל את הצינור כדי לסלק את גלולה. מיד לשפוך את האיים לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר ולשטוף את הצינור עם חמישה מיליליטר של מדיום RPMI טרי 1640 כדי לאסוף את כל האיים הנותרים אוסף את הכביסה עם האיים האחרים. לאחר מכן השתמשו במיקרוסקופ ניתוח ובטיפ פיפט של 20 מיקרוליטר כדי לבחור איונים חומים כדוריים או מלבניים בריאים עם משטח חלק מצלחת פטרי להעברה לצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 שלם.כאשר כל האיים נאספו, מניחים את האיים באיים באינקובטור סטרילי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באוויר לח לילה. נראה כי לאיים בריאים וטובים יש צורה עגולה חלקה ואילו איונים פגומים רעים מפגינים קצוות מחוספסים. רקמה אקסוקרינית מעוכלת היא שקופה במראה ומדגימה צורה לא סדירה.קנולציה נכונה והפצה של אנזים קולגנס P יכול להיות מאושר על ידי אינפלציה של החלק הטחול של הלבלב. דגירה לילה במדיה גלוקוז נמוכה יכולה לגרום לאיים להערכה של הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז למחרת ומאפשרת תובנה לגבי יכולת הפרשת האינסולין של איונים.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

הלבלב Murine איילט בידוד

Neutrophil Isolation Protocol

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

הלבלב איון הטבעה למקטעי פרפין

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...