Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
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Estamos extremamente gratos à Sra. Jennifer Munguia por sua ilustração artística do diagrama esquemático. Agradecemos ao Sr. Michael R. Honig na estação de rádio pública da comunidade de Houston KPFT por sua assistência editorial. Este estudo foi apoiado pela American Diabetes Association #1-177 (YS), e NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de alimentação e agricultura do USDA, projeto Hatch 1010840 (YS) e R01 DK095118 (SG).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais (ACUC) da Universidade do Texas A & M. A necessidade de ferramentas cirúrgicas é mostrada na Figura 1 e o diagrama esquemático do procedimento é mostrado na Figura 2.
1. soluções
<ol><li>Prepare a solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) adicionando 100 mL de 10X HBSS (do estoque) a 900 mL da água destilada para fazer 1 L HBSS (1X).<...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. 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E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

Este protocolo inclui perfusão de colagenases e digestão, seguida de purificação de ilhotas. As etapas mais críticas deste protocolo são a injeção efetiva e a perfusão completa do pâncreas1,4,7. O método de parto deste protocolo permite que a enzima atravesse as vias anatômicas para melhor digerir o tecido exócrino que circunda as ilhotas1. Além disso, esta técnica é bem adequada para a di...

Há dois métodos comuns na literatura para o isolamento da ilíte pancreática. Um exige excisão o pâncreas e o dicing em partes pequenas usando tesouras cirúrgicas, e então digerindo o em uma solução1,2,3do colagenase. Outro método mais preciso é usar a rede de dutos presentes no pâncreas para introduzir a enzima digestiva. Os seguintes locais foram usados para a injeção digestiva da enzima: a junção da bilis e do duto cístico, a vesícula biliar no colagogo comum, ou o colagogo comum próprio1,4,5. Sabe-se que as ilhotas não são distribuídas uniformemente no pâncreas; a região esplênica contém a maioria das ilhotas6. Enquanto o segundo método usando rotas anatômicas para entregar enzimas digestivas permite uma perfusão mais completa do pâncreas, incluindo a região esplênica, este procedimento muitas vezes requer o aperto ou sutura da ampola de Vater que é tecnicamente Desafiador. Em termos de purificação de ilhós, gradientes de densidade múltipla, bem como filtros celulares e retração magnética têm sido utilizados para purificar as ilhotas3,7. A utilização desses gradientes pode ser demorada e os gradientes de Ficoll podem resultar em dano tóxico das ilhotas8.
O protocolo atual é construído sobre o método descrito por Li et al.7, com modificações adicionais adicionadas com base na experiência de nós mesmos e de outros1,4. As etapas mais críticas do nosso protocolo são o aperto do ducto biliar comum perto da extremidade do fígado, injetando colagenase P através da ampola de Vater para digerir o tecido exócrino e, em seguida, usando um banho de água agitando para agilizar a digestão mecanicamente1, 4,7. Subseqüentemente, uma solução do "batente" é aplicada para inibir uma digestão mais adicional das ilhotas; HBSS é utilizado para lavar a solução remanescente de colagenase P e STOP. Quando o método de Ficoll foi usado para purificar as ilhotas humanas, o rendimento foi relatado para ser duas vezes as ilhotas com maior capacidade funcional (por exemplo, secreção de insulina) em comparação com o uso de gradientes de Percoll9. No entanto, estudos têm questionado o uso do gradiente Ficoll devido ao seu efeito tóxico nas ilhotas1,10. Relatou-se que o gradiente histopaque fornece a cinética óptima da purificação para a isolação da ilhotas do rato, que produz o bom rendimento de ilhotas da alta qualidade com etapas mais simples e um mais baixo custo1. Em nosso protocolo, o Histopaque-1077 é usado para purificar ilhotas de outros tecidos residuais8,11. As ilhotas colhidas podem ser cultivadas em meios completos de RPMI-1640, ou utilizadas diretamente na quantificação de RNA/proteína.
Nosso protocolo, usando uma combinação de digestão do colagenase P e uma única etapa da purificação do inclinação, é mais simples do que outros protocolos publicados. Nosso método não exige procedimentos cirúrgicos exigentes e tem apenas alguns passos simples. Mais importante, este protocolo consistentemente produz um bom rendimento de ilhotas funcionais de alta qualidade (250-350/mouse) como nós relatado12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de Ilhéus de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produz hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. As ilhotas consistem principalmente em cinco tipos de células secreting-hormonais: células α secretam glucagon, células β secretam insulina, células δ secretam somatostatina, ε células secretam grelina, e células PP secretam polipeptídeo pancreático. 60 a 80% das células nas ilhotas são células β, que são a população celular mais importante para estudar a secreção de insulina. As ilhotas pancreáticas são um sistema de modelo crucial para estudar a secreção de insulina ex vivo. Adquirir ilhotas de alta qualidade é de grande importância para a pesquisa de diabetes. A maioria dos procedimentos de isolamento de Islet requer tecnicamente difícil de acessar o local de injeção de colagenase, procedimentos de digestão duras e complexas, e etapas de purificação de gradiente de densidade múltipla. Este papel caracteriza um método simples do isolamento do Islet do rato do rendimento elevado com descrições detalhadas e manifestações realísticas, mostrando as seguintes etapas específicas: 1) injeção do colagenase P no ampulla de Vater, uma área pequena que se juntar ao duto pancreatic e o ducto biliar comum, 2) digestão enzimática e separação mecânica do pâncreas exócrino, e 3) uma única etapa de purificação de gradiente. As vantagens deste método são a injeção da enzima digestiva usando a ampola mais acessível de Vater, digestão mais completa usando a combinação de abordagens enzimáticas e mecânicas, e um passo simples de purificação de gradiente único. Este protocolo produz aproximadamente 250 — 350 ilhotas por o rato; e ilhotas são adequados para vários estudos ex vivo. Possíveis advertências deste procedimento são ilhotas potencialmente danificadas devido à digestão enzimática e/ou incubação prolongada de gradiente, todas as quais podem ser largamente evitadas pela justificação cuidadosa do anúncio do tempo de incubação.

A conclusão apropriada deste procedimento exige alguma compreensão da anatomia do rato na cavidade abdominal. Isto permite a identificação apropriada do ampulla de Vater e do aperto do colagogo comum. Todo o procedimento normalmente leva 1 – 2 h. É mais eficiente isolar ilhotas de 4 a 6 camundongos ao mesmo tempo, para que várias amostras possam ser centrifugadas juntas. O tempo para a Islet-colheita varia, dependendo do número de ilhotas e da eficiência da digestão; pode demorar cerca de uma hora para escolhe...

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A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Este protocolo requer o uso de um gradiente de densidade única tornando-o significativamente menos intensivo em mão-de-obra e mais econômico em comparação com métodos de isolamento de ilhotas convencionais mais complexos. A principal vantagem deste protocolo é que a enzima é entregue diretamente ao pâncreas, resultando em uma maior digestão tecidual e aumento do rendimento da ilhota. Comece gravando os membros do mouse na posição supina e pulverizando o corpo com 70% de etanol.Usando fórceps de vidro e tesoura cirúrgica curva, faça uma incisão de pele abdominal horizontal de aproximadamente três centímetros e puxe a pele para expor a parede abdominal. Faça uma incisão vertical de três a quatro centímetros no peritônio abdominal para expor totalmente o pâncreas e coloque o rato sob um microscópio dissecando. Empurre o lobo hepático superiormente para expor o ducto biliar que aparece como um tubo rosa pálido e mover suavemente os intestinos da região lombar e ilíaca direita para a direita da cavidade abdominal para expor o ducto biliar e artéria hepática.Use micro serrefinas Schwartz para fixar cuidadosamente o ducto biliar comum o mais próximo possível do fígado e identificar a ampola de Vater que está localizada na papila duodenal e formada pela união do ducto pancreático e do ducto biliar comum. Usando fórceps micro Adson para puxar o ducto biliar comum ensinado, insira uma agulha de meia polegada de calibre 30 presa a uma seringa de três mililitros contendo três mililitros de solução P de colagenase recém-preparada na ampola de Vater empurrando a agulha para dentro do duto paralelo ao vaso por cerca de um quarto do comprimento do vaso. Uma vez que a agulha esteja no lugar, estabilize a agulha com micro fórceps Adson e injete lentamente e firmemente três mililitros de solução P de colagem no duto.A injeção é considerada bem sucedida se as regiões da cabeça, pescoço, corpo e cauda do pâncreas estiverem totalmente infladas. A entrada adequada na ampola e a canulação do ducto biliar comum são fundamentais para uma colheita bem sucedida de digestão. Perfurar as paredes ductais reduz a eficácia do isolamento.Usando fórceps curvados e micro Adson, puxe cuidadosamente o pâncreas inflado começando no baço e continuando em direção ao estômago e ao longo do duodeno. Em seguida, coloque o pâncreas em um tubo de digestão de 50 mililitros contendo três mililitros de solução P de colagem gelada. Para colher as ilhotas, primeiro use uma tesoura cirúrgica fina para cortar o pâncreas por três a cinco segundos antes de colocar o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius a 100 a 120 rotações por minuto durante 12 a 13 minutos.No final da incubação, agite suavemente o tubo por cerca de 30 segundos para interromper o tecido até que a solução seja homogênea, como confirmado por partículas finas de tecido pancreático semelhantes à areia. Assim que o tecido for digerido, coloque o tubo no gelo e adicione 40 mililitros de solução de parada gelada para acabar com a reação enzimática. Depois de interromper suavemente a pelota, gire o tecido digerido em uma centrífuga de balde balançando seguida de duas centrífugas com 20 mililitros de solução de parada fresca por lavagem.Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 40 mililitros de HBSS gelado para três lavagens adicionais, reutilizando a pelota em cinco mililitros de solução de gradiente de densidade de temperatura ambiente após a última lavagem. Vórtice o tubo brevemente em baixa velocidade até que a solução seja homogeneizada antes de adicionar outros cinco mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo. Agora use uma pipeta de 10 mililitros para adicionar suavemente e lentamente 10 mililitros de HBSS de temperatura ambiente ao tubo de uma maneira em termos de gota para permitir a formação de um gradiente e usar uma centrífuga de balde balançando para isolar as populações celulares por separação gradiente de densidade.No final da centrifugação, use uma pipeta de 10 mililitros pré-molhada com HBSS frio para coletar de cinco a dez mililitros da camada de ilhotas entre o gradiente de densidade e o HBSS. Transfira as ilhotas para um novo tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de HBSS frios de gelo fresco e colete as células por centrifugação em uma centrífuga de balde balançando. Aspire cuidadosamente todos, menos os últimos três mililitros do supernatante sem perturbar a pelota e lave as ilhotas pelo menos mais três vezes com 20 mililitros de HBSS frescos por lavagem.Após a última lavagem, substitua o supernatante por quatro mililitros de 37 graus Celsius RMPI 1640 médio e gire suavemente o tubo para desalojar a pelota. Despeje imediatamente as ilhotas em uma placa de Petri de 100 milímetros e lave o tubo com cinco mililitros de meio RPMI 1640 fresco para coletar quaisquer ilhotas restantes que juntem a lavagem com as outras ilhotas. Em seguida, use um microscópio de dissecção e uma ponta de pipeta de 20 microliteres para colher ilhotas marrons douradas esféricas saudáveis ou oblongas com uma superfície lisa da placa de Petri para transferência em uma nova placa de Petri contendo 10 mililitros de meio RPMI completo 1640.Quando todas as ilhotas tiverem sido coletadas, coloque as ilhotas em uma incubadora estéril a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no ar umidificado durante a noite. Boas ilhotas saudáveis parecem ter uma forma redonda suave, enquanto ilhotas danificadas apresentam bordas ásperas. Tecido exócrino não digerido é translúcido na aparência e demonstra uma forma irregular.Uma cannulação adequada e distribuição da enzima P colagenase pode ser confirmada por uma inflação da porção esplênica do pâncreas. A incubação noturna em baixa mídia de glicose pode preparar as ilhotas para um ensaio de secreção de insulina estimulado pela glicose no dia seguinte, permitindo uma visão da capacidade secreta de insulina das ilhotas.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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