Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
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Estamos muy agradecidos a la Sra. Jennifer Munguia por su ilustración artística del diagrama esquemático. Agradecemos al Sr. Michael R. Honig en la Community Public Radio Station KPFT de Houston por su asistencia editorial. Este estudio fue apoyado por la Asociación Americana de la Diabetes #1-15-BS-177 (YS), y NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el proyecto Hatch 1010840 (YS) y el R01 DK095118 (SG).

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad Texas A&M. La necesidad de herramientas quirúrgicas se muestra en la Figura 1 y el diagrama esquemático del procedimiento se muestra en la Figura 2.
1. Soluciones
<ol><li>Prepare la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank añadiendo 100 ml de 10X HBSS (de stock) a 900 ml de agua destilada para hacer 1 L de...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).</li><li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

Este protocolo incluye perfusión y digestión de la colagenasa, seguida de la purificación de los islotes. Los pasos más críticos de este protocolo son la inyección efectiva y la perfusión completa del páncreas1,4,7. El método de administración de este protocolo permite a la enzima atravesar las rutas anatómicas para digerir mejor el tejido exocrino que rodea los islotes1. Además, esta técnica...

Hay dos métodos comunes en la literatura para el aislamiento de islotes pancreáticos. Se requiere extirpar el páncreas y picarlo en trozos pequeños usando tijeras quirúrgicas, y luego digerirlo en una solución de colagenasa1,2,3. Otro método más preciso es utilizar la red de conductos presentes en el páncreas para introducir enzima digestiva. Los siguientes sitios se han utilizado para la inyección de enzimas digestivas: la unión de la bilis y el conducto quístico, la vesícula biliar en el conducto biliar común o el propio conducto biliar común1,4,5. Se sabe que los islotes no se distribuyen uniformemente en el páncreas; la región esplénica contiene la mayoría de los islotes6. Mientras que el segundo método que utiliza vías anatómicas para entregar enzimas digestivas permite una perfusión más completa del páncreas, incluyendo la región esplénica, este procedimiento a menudo requiere la sujeción o sutura de la ampolla de Vater que es técnicamente Desafiante. En términos de purificación de islotes, se han utilizado gradientes de densidad múltiple, así como coladores celulares y retracción magnética para purificar los islotes3,7. La utilización de estos gradientes puede llevar mucho tiempo y losgradientes de Ficoll pueden resultar en daños tóxicos de los islotes 8.
El protocolo actual se basa en el método descrito por Li et al.7, con modificaciones adicionales añadidas basadas en la experiencia de nosotros mismos y otros1,4. Los pasos más críticos de nuestro protocolo son la sujeción del conducto biliar común cerca del extremo del hígado, la inyección de colagenasa P a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido exocrina, y luego el uso de un baño de agua agitada para acelerar la digestión mecánicamente1, 4,7. Posteriormente, se aplica una solución 'STOP' para inhibir la digestión posterior de los islotes; HBSS se utiliza para lavar la solución restante de colagenasa P y STOP. Cuando se utilizó el método Ficoll para purificar los islotes humanos, se informó que el rendimiento era el doble de los islotes con mayor capacidad funcional (por ejemplo, secreción de insulina) en comparación con el uso de gradientes de Percoll9. Sin embargo, los estudios han cuestionado el usodel gradiente de Ficoll debido a su efecto tóxico en los islotes 1,10. Se ha informado que el gradiente Histopaque proporciona una cinética de purificación óptima para el aislamiento de islotes de ratón, lo que produce un buen rendimiento de islotes de alta calidad con pasos más simples y menor costo1. En nuestro protocolo, Histopaque-1077 se utiliza parapurificar islotes de otros tejidos residuales 8,11. Los islotes cosechados pueden ser cultivados en medios RPMI-1640 completos, o utilizados directamente en la cuantificación de ARN/proteína.
Nuestro protocolo, utilizando una combinación de digestión de colagenasa P y un solo paso de purificación de gradiente, es más simple que otros protocolos publicados. Nuestro método no requiere procedimientos quirúrgicos exigentes y tiene sólo unos sencillos pasos. Más importante aún, este protocolo produce consistentemente un buen rendimiento de islotes funcionales de alta calidad (250-350/ratón) como informamos12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que produce hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Los islotes consisten principalmente en cinco tipos de células que secretan hormonas: las células secretan el glucagón, las células secretan insulina, las células secretan somatostatina, las células secretan la ghrelina y las células PP secretan polipéptido pancreático. Sesenta al 80% de las células de los islotes son células, que son la población celular más importante para estudiar la secreción de insulina. Los islotes pancreáticos son un sistema modelo crucial para estudiar la secreción de insulina ex vivo. Adquirir islotes de alta calidad es de gran importancia para la investigación de la diabetes. La mayoría de los procedimientos de aislamiento de islos requieren un sitio de inyección de colagenasa técnicamente difícil, procedimientos de digestión agresivos y complejos y pasos de purificación de gradiente de densidad múltiple. Este papel cuenta con un sencillo método de aislamiento de islotes de ratón de alto rendimiento con descripciones detalladas y demostraciones realistas, que muestra los siguientes pasos específicos: 1) inyección de colagenasa P en la ampolla de Vater, un área pequeña que une el conducto pancreático y el conducto biliar común, 2) la digestión enzimática y la separación mecánica del páncreas exocrino, y 3) un único paso de purificación de gradiente. Las ventajas de este método son la inyección de enzima digestiva utilizando la ampolla más accesible de Vater, una digestión más completa utilizando una combinación de enfoques enzimáticos y mecánicos, y un paso de purificación de un solo gradiente más simple. Este protocolo produce aproximadamente 250—350 islotes por ratón; e islotes son adecuados para varios estudios ex vivo. Las posibles advertencias de este procedimiento son islotes potencialmente dañados debido a la digestión enzimática y/ o incubación prolongada de gradiente, todo lo cual puede evitarse en gran medida mediante una cuidadosa justificación ad del tiempo de incubación.

La realización adecuada de este procedimiento requiere cierta comprensión de la anatomía del ratón en la cavidad abdominal. Esto permite una adecuada identificación de la ampolla de Vater y la sujeción del conducto biliar común. Todo el procedimiento normalmente toma 1–2 h. Es más eficiente aislar islotes de 4-6 ratones al mismo tiempo, por lo que varias muestras pueden ser centrifugadas juntas. El tiempo de recogida de islotes varía, dependiendo del número de islotes y la eficiencia de la digestión; puede t...

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A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Este protocolo requiere el uso de un gradiente de densidad única, lo que lo hace significativamente menos intensivo en mano de obra y más rentable en comparación con los métodos de aislamiento de islotes convencionales más complejos. La principal ventaja de este protocolo es que la enzima se entrega directamente al páncreas, lo que resulta en una mayor digestión tisular y un mayor rendimiento de los islotes. Comience pegando las extremidades del ratón en la posición supina y rociando el cuerpo con 70%etanol.Usando fórceps de tapa y tijeras quirúrgicas curvas, haz una incisión horizontal de la piel de la piel de aproximadamente tres centímetros y abre la piel para exponer la pared abdominal. Haga una incisión vertical de tres a cuatro centímetros en el peritoneo abdominal para exponer completamente el páncreas y colocar el ratón debajo de un microscopio diseccionado. Empuje el lóbulo hepático superiormente para exponer el conducto biliar que aparece como un tubo de color rosa pálido y mueva suavemente los intestinos de la región lumbar derecha e ilíaca a la derecha de la cavidad abdominal para exponer el conducto biliar y la arteria hepática.Utilice micro serrefinas Schwartz para sujetar cuidadosamente el conducto biliar común lo más cerca posible del hígado e identificar la ampolla de Vater que se encuentra en la papila duodenal y formada por la unión del conducto pancreático y el conducto biliar común. Usando micro fórceps Adson para tirar del conducto biliar común enseñado, inserte una aguja de media pulgada de calibre 30 unida a una jeringa de tres mililitros que contenga tres mililitros de solución de colágeno P recién preparada en la ampolla de Vater empujando la aguja en el conducto paralelo al recipiente durante aproximadamente un cuarto de la longitud del recipiente. Una vez que la aguja esté en su lugar, estabilice la aguja con micro fórceps Adson e inyecte lentamente y constantemente tres mililitros de solución de colagenasa P en el conducto.La inyección se considera exitosa si las regiones de la cabeza, el cuello, el cuerpo y la cola del páncreas están completamente infladas. La entrada adecuada en la ampolla y la cánulación del conducto biliar común son fundamentales para una cosecha de digestión exitosa. Perforar las paredes ductales reduce la eficacia del aislamiento.Usando fórceps curvos y micro Adson, extraiga cuidadosamente el páncreas inflado comenzando en el bazo y continuando hacia el estómago y a lo largo del duodeno. A continuación, coloque el páncreas en un tubo de digestión de 50 mililitros que contenga tres mililitros de solución de colagenasa P helada. Para cosechar los islotes, primero use tijeras quirúrgicas finas para cortar el páncreas durante tres a cinco segundos antes de colocar el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius a 100 a 120 rotaciones por minuto durante 12 a 13 minutos.Al final de la incubación, agita suavemente el tubo durante unos 30 segundos para interrumpir el tejido hasta que la solución sea homogénea como lo confirman las partículas de tejido pancreático similares a la arena fina. Tan pronto como se digiere el tejido, coloque el tubo sobre hielo y agregue 40 mililitros de solución de parada helada para terminar la reacción enzimática. Después de interrumpir suavemente el pellet, gire hacia abajo el tejido digerido en una centrífuga de cubo oscilante seguida de dos centrifugaciones con 20 mililitros de solución de parada fresca por lavado.Después del último lavado, resuspender el pellet en 40 mililitros de HBSS helado para tres lavados adicionales, resuspendiendo el pellet en cinco mililitros de solución de gradiente de densidad de temperatura ambiente después del último lavado. Vórtice el tubo brevemente a baja velocidad hasta que la solución se homogeneice antes de añadir otros cinco mililitros de gradiente de densidad de temperatura ambiente al tubo. Ahora utilice una pipeta de 10 mililitros para agregar suavemente y lentamente 10 mililitros de HBSS de temperatura ambiente al tubo de una manera gota para permitir la formación de un gradiente y utilizar una centrífuga de cubo oscilante para aislar las poblaciones celulares por separación de gradiente de densidad.Al final de la centrifugación, utilice una pipeta de 10 mililitros pre-húmeda con HBSS frío para recoger de cinco a 10 mililitros de la capa de islote entre el gradiente de densidad y el HBSS. Transfiera los islotes a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de HBSS frío fresco y recoja las células por centrifugación en una centrífuga de cubo oscilante. Aspirar cuidadosamente todos menos los últimos tres mililitros del sobrenadante sin alterar el pellet y lavar los islotes al menos tres veces más con 20 mililitros de HBSS fresco por lavado.Después del último lavado, reemplace el sobrenadante con cuatro mililitros de 37 grados Celsius RMPI 1640 medio y gire suavemente el tubo para desalojar el pellet. Inmediatamente verter los islotes en un plato Petri de 100 milímetros y lavar el tubo con cinco mililitros de nuevo RPMI 1640 medio para recoger los islotes restantes que se acumulen el lavado con los otros islotes. A continuación, utilice un microscopio de disección y una punta de pipeta de 20 microlitros para recoger islotes esféricos sanos u oblongos dorados con una superficie lisa de la placa Petri para transferirlos a un nuevo plato Petri que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 medio completo.Cuando se hayan recogido todos los islotes, coloque los islotes en una incubadora estéril a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono en el aire humidificado durante la noche. Los buenos islotes sanos parecen tener una forma redonda lisa, mientras que los islotes dañados mal exhiben bordes ásperos. El tejido exocrino no digerido es de aspecto translúcido y demuestra una forma irregular.Una cannulación y distribución adecuadas de la enzima colagenasa P puede ser confirmada por una inflación de la porción esplénica del páncreas. La incubación nocturna en medios bajos de glucosa puede preparar los islotes para un ensayo de secreción de insulina estimulado por glucosa al día siguiente, lo que permite conocer la capacidad secretora de insulina de los islotes.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Páncreas murino aislamiento Islet

Investigación

Biología

Neutrophil Isolation Protocol

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

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