Name: a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice at JoVE.com

Biz şematik diyagramonu sanatsal illüstrasyon için Bayan Jennifer Munguia son derece müteşekkiriz. Biz Bay Michael R. Honig Houston Topluluk Kamu Radyo İstasyonu KPFT onun editoryal yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma Amerikan Diyabet Derneği #1-15-BS-177 (YS) ve NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma usda Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch projesi 1010840 (YS) ve R01 DK095118 (SG) tarafından da desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Texas A&M Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. Cerrahi aletlerin ihtiyacı Şekil 1'de, yöntemin şematik diyagramı şekil2'de gösterilmiştir.
1. Çözümler
<ol><li>1 L HBSS (1X) yapmak için 900 mL distile suya 100 mL 100 mL (stoktan) ekleyerek Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) hazırlayın.</li>
	<li>STOP çözeltisini hazırlayın (ta...

<ol>
	<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans.">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease.">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes.">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).</li><li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients.">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374 (1987).</li><li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+filtration:+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function.">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li><li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans.">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li><li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R.">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).</li><li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique.">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li></ol>

Bu protokol kollajenaz perfüzyon ve sindirim, adacıkların arınma izledi içerir. Bu protokolün en kritik adımları etkili enjeksiyon ve pankreas tam perfüzyonvardır 1,4,7. Bu protokolün teslim yöntemi enzim daha iyi adacıklar çevreleyen ekzonrin doku sindirmek için anatomik yolları çapraz sağlar1. Buna ek olarak, bu teknik de adacıkların en yüksek konsantrasyona sahip dalak bölgesi, ta...

Pankreas adacık izolasyonu için literatürde iki ortak yöntem vardır. Bir pankreas excising ve cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrama gerektirir, ve sonra bir kollajenaz çözeltisi içinde sindirerek1,2,3. Başka bir daha kesin yöntem sindirim enzimi tanıtmak için pankreas mevcut kanalların ağ kullanmaktır. Aşağıdaki siteler sindirim enzim enjeksiyonu için kullanılmıştır: safra ve kistik kanal kavşağı, ortak safra kanalı içine safra kesesi, ya da ortak safra kanalı kendisi1,4,5. Bu adacıklar eşit pankreas dağıtılan olmadığı bilinmektedir; dalak bölgesi en çok adacık içerir6. Sindirim enzimleri sunmak için anatomik yolları kullanarak ikinci yöntem pankreas daha tam bir perfüzyon sağlar iken, dalak bölgesi de dahil olmak üzere, Bu prosedür genellikle teknik olarak Vater ampulla sıkma veya dikiş gerektirir Zorlu. Adacık arınma açısından, birden fazla yoğunluk gradyanları yanı sıra hücre süzgeçleri ve manyetik geri çekme adacıkları arındırmak için kullanılmıştır3,7. Bu degradelerin kullanımı zaman alıcı olabilir ve Ficoll gradyanları adacıklarıntoksik hasarına neden olabilir 8.
Mevcut protokol Li ve ark.7tarafından açıklanan yöntem üzerine inşa edilmiştir , ek değişiklikler kendimizi ve başkalarının deneyimine dayalı eklendi1,4. Protokolümüzün en kritik adımları karaciğer ucuna yakın ortak safra kanalı nın kenetlenme, eknotrin dokuyu sindirmek için Vater ampulla kolajenaz P enjekte ve sonra mekanik sindirim hızlandırmak için sallayarak su banyosu kullanarak1, 4,7. Daha sonra, adacıkların daha fazla sindirimini engellemek için bir 'STOP' çözeltisi uygulanır; HBSS kalan kollajenaz P ve STOP çözeltisini yıkamak için kullanılır. Ficoll yöntemi insan adacıkları arındırmak için kullanıldığında, verim iki kat daha fazla fonksiyonel yeteneği (örneğin, insülin salgılanma) percoll gradyanların kullanımı ile karşılaştırıldığında adacıklar olduğu bildirilmiştir9. Ancak, çalışmalar ficoll gradient adacıklar üzerindeki toksik etkisi nedeniyle kullanımını sorguladı1,10. Bu Histopaque gradyan fare adacık izolasyon için optimum arıtma kinetiği sağlar bildirilmiştir, hangi basit adımlar ve daha düşük maliyet ile yüksek kaliteli adacıklar iyi verim üretir1. Protokolümüzde, Histopaque-1077 diğer artık doku8,11adacıkları arındırmak için kullanılır. Hasat adacıkları tam RPMI-1640 ortamiçinde kültürlenebilir veya doğrudan RNA/protein nicelemesinde kullanılabilir.
Bizim protokol, kollajenaz P sindirim ve tek bir degrade arıtma adımı bir arada kullanarak, diğer yayınlanan protokolleri daha basittir. Yöntemimiz zorlu cerrahi prosedürler gerektirmez ve sadece birkaç basit adımvardır. Daha da önemlisi, bu protokol sürekli olarak yüksek kaliteli fonksiyonel adacıklar iyi bir verim üretir (250-350/fare) olarak biz12bildirdi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td>Hoding collagenase P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-396</td>
			<td>Holding skin of mouse to aid incision procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Holding tissues during pancreas removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>B13B16A</td>
			<td>To anaesthetize mice prior surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30-2041</td>
			<td>Used for islet culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G. &#189; inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads with waterproof moisture barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>To absorb blood from syurgical procesdudes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811FJ478114</td>
			<td>Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P- 1g</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>For digestion of exocrine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved surgical scissors</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>13-804-21</td>
			<td>For cutting open mouse abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution 10x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td>Washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>RNBF5100</td>
			<td>For gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Leeds</td>
			<td>LR92240</td>
			<td>Enhancing visibility of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>For removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td>Culturing Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-01</td>
			<td>Clamping common bile duct and hepatic artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking waterbath</td>
			<td>Boekel/Grant</td>
			<td>8R0534008</td>
			<td>Important for mechanical digestion of exocrine tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Cuttitng tissue that atached to pancreas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple high efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice

Pankreas adacıkları, ayrıca Langerhans Adacıkları denir, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik fonksiyonlar için hormonüreten endokrin hücrelerin bir küme vardır. Adacıklar öncelikle beş tür hormon salgılayan hücreden oluşur: α hücreleri glukagon salgılar, β hücreleri insülin salgılar, δ hücreleri somatostatin salgılar, ε hücreleri ghrelin salgılar, ve PP hücreleri pankreas polipeptidi salgılar. Adacıklarda hücrelerin %60-80'i insülin salgısını inceleyen en önemli hücre popülasyonu olan β hücreleridir. Pankreas adacıkları ex vivo insülin salgısını incelemek için önemli bir model sistemidir. Yüksek kaliteli adacıklar elde diyabet araştırma için büyük önem taşımaktadır. Çoğu adacık izolasyon prosedürleri kollajenaz enjeksiyon, sert ve karmaşık sindirim prosedürleri ve birden fazla yoğunluk gradyan arıtma adımları siteye erişmek için teknik olarak zor gerektirir. Bu kağıt ayrıntılı açıklamalar ve gerçekçi gösteriler ile basit bir yüksek verimli fare adacık izolasyon yöntemi özellikleri, aşağıdaki özel adımları gösteren: 1) Vater ampulla kollajenaz P enjeksiyonu, pankreas kanalı katılmadan küçük bir alan ve ortak safra kanalı, 2) enzimatik sindirim ve eknotrin pankreas mekanik ayırma, ve 3) tek bir degrade arıtma adımı. Bu yöntemin avantajları Vater daha erişilebilir ampulla kullanarak sindirim enzim enjeksiyonu, enzimomatik ve mekanik yaklaşımlar kombinasyonu kullanarak daha eksiksiz sindirim ve basit bir tek degrade arıtma adımı vardır. Bu protokol fare başına yaklaşık 250-350 adacık üretir; ve adacıklar çeşitli ex vivo çalışmalar için uygundur. Bu prosedürün olası uyarılar potansiyel olarak enzimatik sindirim ve / veya uzun gradyan kuluçka nedeniyle adacıklar zarar görmüş, tüm bunlar büyük ölçüde kuluçka süresi dikkatli reklam gerekçesi ile önlenebilir.

Bu işlemin doğru tamamlanması karın boşluğunda fare anatomisi bazı anlayış gerektirir. Bu Vater ampulla doğru belirlenmesi ve ortak safra kanalı nın kelepçeleme sağlar. Tüm prosedür normalde 1-2 saat sürer. Adacıkları aynı anda 4-6 fareden ayırmak daha etkilidir, bu nedenle çeşitli örnekler birlikte santrifüj edilebilir. Adacık toplama süresi, adacık ların sayısına ve sindirim in verimliliğine bağlı olarak değişir; 1 fareden 250-350 adacık almak yaklaşık bir saat sürebilir.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice at JoVE.com

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Bu protokol, daha karmaşık konvansiyonel adacık izolasyon yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha az emek yoğun ve daha uygun maliyetli hale tek bir yoğunluk gradyan kullanımını gerektirir. Bu protokolün ana avantajı enzim pankreas gelişmiş doku sindirim ve artan adacık verimi ile sonuçlanan doğrudan teslim olmasıdır. Supine pozisyonda farenin uzuvları dokunarak ve% 70 etanol ile vücut püskürtme ile başlayın.Coverglass forceps ve kavisli cerrahi makas kullanarak, yaklaşık üç santimetre yatay karın deri kesi yapmak ve karın duvarı ortaya çıkarmak için cilt açık çekin. Pankreası tamamen ortaya çıkarmak ve fareyi bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirmek için abdominal periton üzerinde 3-4 santimetrelik dikey kesi yapın. Soluk pembe bir tüp olarak görünen safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğer lobunu üstün bir şekilde itin ve safra kanalını ve hepatik arteri ortaya çıkarmak için bağırsakları sağ lomber ve iliak bölgesinden karın boşluğunun sağına doğru hafifçe hareket ettirin.Schwartz mikro serrefines dikkatle mümkün olduğunca karaciğere yakın ortak safra kanalı kelepçe ve duodenal papilla bulunan ve pankreas kanalı ve ortak safra kanalı nın birleşmesi ile oluşturulan Vater ampulla tanımlamak için kullanın. Öğretilen ortak safra kanalını çekmek için mikro Adson forsepsleri kullanarak, üç mililitrelik bir şırıngaya bağlı 30 kalibrelik yarım inçlik bir iğne yerleştirin ve üç mililitrelik taze hazırlanmış kollajenaz P çözeltisi içeren ampulla vater'in iğneyi damarın yaklaşık dörtte biri boyunca damara paralel olarak kolileterek damara paralel olarak sokun. İğne yerleştirildikten sonra, mikro Adson forsepsile iğneyi stabilize edin ve kanala üç mililitre kollajenaz P çözeltisi enjekte edin.Pankreasın baş, boyun, vücut ve kuyruk bölgeleri tamamen şişirilmiş ise enjeksiyon başarılı olarak kabul edilir. Ampulla doğru giriş ve ortak safra kanalı kanülasyonu başarılı bir sindirim hasat için çok önemlidir. Duktal duvarların delinme izolasyon etkinliğini azaltır.Kavisli ve mikro Adson forceps kullanarak, dikkatle dalak başlayan ve mide doğru devam ve duodenum boyunca şişirilmiş pankreas çekin. Sonra buz soğuk kollajenaz P çözeltisi üç mililitre içeren bir 50 mililitre sindirim tüpü içinde pankreas yerleştirin. Adacıkları hasat etmek için, ilk 12 ila 13 dakika boyunca dakikada 100 ila 120 rotasyonlar 37 derece santigrat su banyosu tüp yerleştirmeden önce üç ila beş saniye pankreas doğrayın ince cerrahi makas kullanın.Kuluçka sonunda, yavaşça çözelti ince kum benzeri pankreas dokusu parçacıkları tarafından onaylanan homojen olana kadar doku bozmak için yaklaşık 30 saniye boyunca tüp sallamak. Doku sindirilir sindirilmez, tüpü buza yerleştirin ve enzimatik reaksiyonu sonlandırmak için 40 mililitre buz gibi soğuk dur solüsyonu ekleyin. Peleti hafifçe bozduktan sonra, sindirilmiş dokuyu sallanan bir kova santrifüjünde aşağı doğru döndürün ve ardından yıkama başına 20 mililitre taze durdurma solüsyonu ile iki santrifüj edin.Son yıkamadan sonra, üç ek yıkama için buz gibi HBSS 40 mililitre pelet resuspend, son yıkamadan sonra oda sıcaklığında degrade çözeltisi beş mililitre pelet resususpend. Çözelti homojenize olana kadar tüpü kısa bir süre düşük hızda girdaplayın ve tüpün içine beş mililitre oda sıcaklığı yoğunluğu degradesi daha eklenebilir. Şimdi yavaşça ve yavaş yavaş bir degrade oluşumunu sağlamak için bir damla akıllıca bir şekilde tüp oda sıcaklığında HBSS 10 mililitre eklemek ve yoğunluk gradyan ayırma hücre popülasyonları izole etmek için sallanan bir kova santrifüj kullanmak için 10 mililitrelik pipet kullanın.Santrifüjsonunda, yoğunluk gradyanı ile HBSS arasındaki adacık tabakasının 5 ila 10 mililitresini toplamak için soğuk HBSS ile önceden ıslak 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Adacıkları 20 mililitre taze buz soğuk HBSS içeren yeni bir 50 mililitrelik tüp içine aktarın ve sallanan bir kova santrifüj içinde santrifüj ile hücreleri toplamak. Peleti bozmadan supernatantın son üç mililitresi hariç hepsini dikkatlice aspire edin ve adacıkları yıkama başına 20 mililitre taze HBSS ile en az üç kez daha yıkayın.Son yıkamadan sonra, 37 derece Santigrat RMPI 1640 orta dört mililitre ile supernatant değiştirin ve yavaşça pelet çıkarmak için tüp girdap. Adacıkları hemen 100 milimetrelik Petri kabına dökün ve diğer adacıklarla yıkamayı sağlayan kalan adacıkları toplamak için tüpü beş mililitre taze RPMI 1640 orta sıyla yıkayın. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu ve 20 mikrolitrelik pipet ucu kullanın ve 10 mililitre tam RPMI 1640 orta içeren yeni bir Petri kabına aktarmak için Petri kabından pürüzsüz bir yüzeye sahip sağlıklı küresel veya dikdörtgen altın kahverengi adacıkları seçin.Tüm adacıklar toplandığında, adacıkları steril bir kuluçka makinesine 37 santigrat derece ve nemlendirilmiş havada bir gecede %5 karbondioksit yerleştirin. İyi sağlıklı adacıklar pürüzsüz yuvarlak bir şekle sahip ken kötü hasarlı adacıklar pürüzlü kenarlar sergilerler. Sindirilmemiş ekzonrin doku görünümünde yarı saydam dır ve düzensiz bir şekil gösterir.Uygun bir kanülasyon ve kollajenaz P enzimdağılımı pankreas Dalakik kısmının bir enflasyon ile teyit edilebilir. Düşük glikoz lu ortamda bir gecede kuluçka adacıkları bir glukoz uyarılmış insülin salgılama tonu için ertesi gün adacıkların insülin salgı kapasitesi hakkında bilgi sağlayan astarlar astarlar olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Neutrophil Isolation Protocol

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...