Name: multiplexed isothermal amplification based diagnostic platform to detect zika, chikungunya, and dengue 1
Uploaded: 2018-03-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1 at JoVE.com

O trabalho foi financiado em parte por 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 e NIAID. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada em parte pelos institutos nacionais de alergia e doenças infecciosas e em parte pelo biomédico pesquisa programa de Florida Department of Health. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH ou Florida Department of Health. LLC de química combinatória dinâmico é reconhecido por seu apoio e contribuição para este projeto.
Vírus dengue 1 (estirpe BOL-KW010) foi gentilmente fornecida pela Florida departamento de saúde Secretariado dos laboratórios. Vírus Zika e estirpe asiática do vírus chikungunya foram graciosamente fornecidos pelos centros de controle e prevenção de doenças. A Oceano Índico a linhagem do vírus chikungunya foi gentilmente cedida por Robert Tesh (centro de referência mundial para vírus emergentes e arbovírus, através da Universidade do Texas Medical Branch em Galveston, Texas) para o UF-FMEL. Agradecemos a S. Bellamy, B. Eiko, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, r. ZimLer e Zirbel K. para obter assistência com os estudos de infecção. Agradecemos também o M. S. Kim para fornecer Q-papel.

Nota: Os mosquitos foram os únicos animais diretamente utilizados neste estudo. Os procedimentos para gerenciar as galinhas, cujo sangue foi usado para alimentar os mosquitos infectados, foram aprovados como IACUC protocolo #201507682 pela propagação cuidados animais institucionais da Universidade da Flórida e Committee.Virus de uso e estudos de infecção do mosquito foram realizado nas instalações da BSL-3 do laboratório de Entomologia Médica de Florida em Vero Beach, FL. RT-lâmpada experimentos foram realizad...

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Vírus transmitidas por mosquitos, incluindo Zika, chikungunya e dengue ameaçam a saúde pública e destaque de surtos recente Zika a necessidade de alternativas de baixo custo deteção de point-of-care para diagnóstico do paciente, bem como para vigilância de mosquito. Métodos de amplificação isotérmica foram desenvolvidos como alternativas acessíveis para sistemas baseados em PCR. Particularmente, RT-lâmpada-based plataformas foram aplicadas para detectar uma grande variedade de agentes patogénicos. No entan...

Infecções por vírus transmitidas por mosquitos, inclusive da dengue e chikungunya Zika vírus são sobre as estratégias de gestão imediata de ascensão e a demanda. Vírus da dengue e chikungunya já são endêmicas em muitas das regiões tropicais onde Zika está se espalhando no hemisfério ocidental1. Zika vírus, como a dengue, é um membro da família Flaviviridae e é nativa da África com um asiático e duas linhagens genéticas africanas2. Mesmo que a identificação do vírus Zika remonta a 1947, Zika infecção em humanos permaneceu esporádica há meio século antes de emergir no Pacífico e nas Américas. O primeiro surto relatado de Zika febre ocorreu na ilha de Yap, nos Estados Federados da Micronésia, em 2007, seguido de Polinésia francesa em 2013 e 2014. O primeiro grande foco nas Américas ocorreu em 2015 no Brasil.
Vírus da dengue, chikungunya e Zika são transmitidos principalmente pelo Aedes aegypti e Aedes albopictus. No entanto, Zika tem possibilidades adicionais a jusante transmissão de humano para humano, provavelmente sendo espalhadas através do contato sexual, interação mãe-para-feto e através do aleitamento materno3,4,5. Zika febre primeiro foi acreditado para causar doença apenas suave. No entanto, mais tarde foi associado com a síndrome de Guillain-Barré em adultos, microcefalia em recém-nascidos e crônicas doenças músculo-esqueléticas que podem últimos meses a anos. Diagnóstico de doença Zika pode ser um desafio, uma vez que os sintomas de uma infecção Zika são semelhantes de outros vírus de propagação do mosquito6. Co-infecções comuns destes vírus fazem diagnóstico diferencial ainda mais desafiador7,8. Portanto, deteção rápida e confiável dos ácidos nucleicos de Zika e outros vírus é necessária para compreender a epidemiologia em tempo real, para iniciar o controle e medidas preventivas e para gerenciar o atendimento ao paciente9.
Testes de diagnóstico atual para estes vírus incluem testes serológicos, isolamento do vírus, sequenciamento do vírus e PCR transcrição reversa (RT-PCR). Abordagens serológicas padrão muitas vezes sofrem de sensibilidade inadequada e resultados podem ser complicados por reatividade cruzada em pacientes que anteriormente foram infectados por outros flavivírus.
Portanto, o teste de ácido nucleico continua a ser a maneira mais confiável para detectar e diferenciar estes vírus. Deteção de Zika e outros vírus transmitidas por mosquitos é geralmente realizada usando RT-PCR ou RT-PCR em tempo real em uma variedade de fluidos biológicos, tais como soro, urina, saliva, sêmen, leite materno e fluido cerebral10,11. Amostras de urina e saliva são geralmente preferidas sobre sangue, uma vez que eles apresentam menos PCR-inibição, cargas virais, presença de vírus por longos períodos de tempo e maior facilidade de coleta e tratamento de12,13. Testes de diagnóstico baseados em RT-PCR, no entanto, compreendem as etapas de preparação de amostra extensa e caro equipamento de ciclismo térmico, tornando-se menos ideal para o local de tratamento.
Transcrição reversa mediada por loop de amplificação isotérmica (RT-lâmpada) surgiu como uma poderosa alternativa de RT-PCR, devido à sua alta sensibilidade e especificidade14,15, amostras de sua tolerância para substâncias inibidoras no biológico e operação em temperatura única, que significativamente reduz do ensaio de complexidade e custos associados, tornando-o adequado para ambientes de baixo recurso. RT-lâmpada, como classicamente é implementada, compreende seis primeiras demão que ligam a oito regiões distintas dentro da meta do RNA. Ele é executado em temperaturas constantes entre 60 ° C e 70 ° C e usa um transcriptase reversa e uma DNA polimerase com forte vertente deslocando atividade.
Durante os estágios iniciais do RT-lâmpada, avançar e retroceder internas Cartilhas (FIP e BIP, figura 1A) juntamente com o exterior para a frente e para trás as primeiras demão (F3 e B3) formam uma estrutura de haltere, a estrutura de sementes de amplificação exponencial de lâmpada. Amplificação é ainda mais acelerada por laço frente e para trás primers (LF e LB), que são projetados para ligar as regiões encalhadas única do haltere, e resulta na formação de concatemers com repetindo vários loops16. Ensaios de lâmpada clássica baseada na turbidez ou leitura por DNA intercalante corantes não é inteiramente adequada para deteção de point-of-care de Zika, onde algum nível de multiplexação é desejado17,18,19. Multiplexação não é facilmente obtida nestes sistemas, como eles são propensos a gerar falsos positivos devido amplificações fora do alvo.
Para gerenciar essas questões, a literatura adiciona um componente adicional sob a forma de uma "fio-deslocando sonda" para a arquitetura RT-lâmpada clássica20,21,22. Cada teste possui uma sequência específica dobro-costa e uma região de single-stranded escorva. A sonda com a região de single-stranded é marcada com um fluoróforo 5', e a sonda complementar é modificada com um quencher 3'-extremidade. Na ausência de um alvo, sem fluorescência é observada devido a hibridação das vertentes complementares sonda, que traz o fluoróforo e quencher em estreita proximidade. Na presença de um alvo, a parte single-stranded da sonda fluorescente vincula seu complemento no alvo e então é estendida por um fio, deslocando a polimerase. Nova prorrogação de polimerase por primers reversos provoca a separação da strand quencher de sua cadeia complementar fluorescente etiquetada, permitindo a emissão de fluorescência (figura 1B). Com este projeto, o sinal é gerado após a formação do haltere, reduzindo as chances de sinais falso-positivos.
A porção de dupla-hélice da vertente-deslocando sonda pode ser qualquer sequência, e quando a multiplexação é aplicada, a mesma sequência pode ser utilizada com pares diferentes fluoróforo-quencher. Com esta arquitetura, urina contaminada por vírus, soro ou mosquito esmagadas no papel de amostras foram introduzidas diretamente o ensaio sem preparação da amostra. Leituras de três cores fluorescência visíveis ao olho humano foram geradas dentro de 30-45 min, e os sinais foram visualizados por uma caixa de observação 3D-impresso que utiliza um LED azul e um filtro laranja. Os reagentes de RT-lâmpada de liofilização habilitado a implantação deste kit para diminuir as configurações de recursos sem a necessidade de refrigeração.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MBE-150</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G:BOX F3</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>G:BOX F3</td>
			<td>Gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Instrument II, 96-well</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>05 015 278 001</td>
			<td>Real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td>ultrafiltraton membrane for dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5417C Centrifuge</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5417C</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myblock Mini Drybath</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BSH200</td>
			<td>drybath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7934020</td>
			<td>lyophilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>all priers and probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom</td>
			<td>RT-LAMP primers and probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP set</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst&#160;2.0 WarmStart&#160;DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0538L</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0380L</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0372L</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50bp DNA Step Ladder</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G4521</td>
			<td>marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>real-time RT-LAMP analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed isothermal amplification based diagnostic platform to detect zika, chikungunya, and dengue 1

Zika, da dengue e o vírus chikungunya é transmitido por mosquitos, causando doenças com sintomas semelhantes do pacientes. No entanto, eles têm potenciais diferentes a jusante transmissão de paciente para paciente e requerem tratamentos muito diferentes pacientes. Assim, surtos recentes Zika torná-lo urgente para desenvolver ferramentas que rapidamente discriminam estes vírus em pacientes e presos os mosquitos, para selecionar o correto tratamento do paciente e para compreender e gerenciar sua epidemiologia em tempo real.
Infelizmente, testes de diagnóstico atual, incluindo aqueles emergência 2016 recebimento usar autorizações e acelerado estado, detectar o RNA viral por transcrição reversa cadeia da polimerase (RT-PCR), que requer instrumentação, treinou os usuários, e preparação da amostra considerável. Assim, devem ser enviadas para laboratórios de referência "aprovado", que requer tempo. Com efeito, em agosto de 2016, o Center for Disease Control (CDC) estava perguntando as mulheres grávidas, que tinha sido mordido por um mosquito e com sarna Zika-indicando que esperar uma inaceitável de 2 a 4 semanas antes de aprendizagem se eles foram infectados. Precisamos muito de testes que podem ser feitos no local, com poucos recursos e por pessoal treinado, mas não necessariamente licenciado.
Este vídeo demonstra um ensaio que atenda a estas especificações, trabalhando com urina ou soro (para pacientes) ou carcaças de mosquito esmagado (para vigilância ambiental), tudo sem muita preparação da amostra. Carcaças de mosquito são capturadas no papel carregando de amônio quaternário grupos (Q-papel) seguidos de um tratamento de amônia para gerenciar riscos biológicos. Estes são então diretamente, sem isolamento de RNA, colocados em tubos de ensaio contendo reagentes liofilizados que precisam sem cadeia de refrigeração. Uma forma modificada de amplificação isotérmica mediada por laço transcrição reversa com destino específico fluorescente etiquetadas sondas displaceable produz a leitura, em 30 min, como um sinal de fluorescência de três cores. Isto é visualizado com um dispositivo portátil, bateria com um filtro laranja. Contaminação direta é impedida com tubos selados e o uso de termolábil uracil DNA glycosylase (UDG) na presença de dUTP a mistura de amplificação.

Inicialmente, as performances de cada primer RT-lâmpada (tabela 1) , com sua correspondente substrato de RNA viral, bem como controles negativos foram avaliadas por eletroforese em gel. As primeiras demão RT-lâmpada foram projetadas para alvo NS5 região (RNA-dependente do RNA polimerase) para Zika e Dengue 1 e região nsP2 (proteínas não estruturais P2) para Chikungunya. Modelos foram RNA total extraído de estoques virais cultivadas em células de rim (Vero) do mac...

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Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Bioquímica

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Medindo interações entre sondas fluorescentes e lignina em seções de plantas por sFLIM Com base na autofluorescência nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Incubadora de plataformas com estágio XY móvel: uma nova plataforma para implementar oxidação fotoquímica rápida em células de proteínas

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...